Protocolo para aguda e crônica de ensaios toxicológicos do turquesa Killifish Nothobranchius furzeri

Resumo

Neste trabalho, descrevemos um bioensaio agudo, crônico e várias gerações para estudar os efeitos dos estressores único e combinadas sobre o turquesa killies Nothobranchius furzeri. Este protocolo é projetado para estudar traços de história de vida (mortalidade, crescimento, fecundidade, peso) e crítico máximo térmico.

Resumo

O Nothobranchius furzeri killies é um organismo modelo emergente no campo da ecotoxicologia e demonstrou-se sua aplicabilidade em ensaios de ecotoxicidade aguda e crônica. Em geral, a sensibilidade da espécie de compostos tóxicos está no intervalo com, ou superior, de outras espécies de modelo.

Este trabalho descreve os protocolos para os bioensaios agudos, crônicos e várias gerações dos efeitos combinados e único estressor na furzeri s.. Devido ao seu tempo de maturação curto e o ciclo de vida, este modelo de vertebrados permite o estudo de pontos de extremidade como tempo de maturação e fecundidade no prazo de quatro meses. Ensaios de exposição de ciclo de vida completo transgeracional podem ser executados em menos de 8 meses. Desde que esta espécie produz ovos que são resistentes à seca e permanecem viável durante anos, a cultura no local das espécies não é necessária, mas os indivíduos podem ser recrutados quando necessário. Os protocolos destinam-se a medida traços de história de vida (mortalidade, crescimento, fecundidade, peso) e crítico máximo térmico.

Introdução

Perfis de sensibilidade de uma matriz de espécies tóxicas para estrategicamente selecionadas foram descritos¹ para a legislação europeia chegar (registo, avaliação, autorização e restrição de produtos químicos). Testes de toxicidade aguda ou a curto prazo foram usados principalmente para esta finalidade como eles dão uma indicação rápida de sensibilidade da espécie. No entanto, em seu ambiente natural, os organismos são expostos por períodos muito mais longos e ciclos de vida completo ou até mesmo várias gerações podem ser afetada². Além disso, organismos em ambientes poluídos normalmente estão expostos a mais de um fator de estresse em um momento, que pode interagir uns com os outros, possivelmente resultando em efeitos sinérgicos³. Portanto, testes de toxicidade concentrações seguro calculado com base na aguda, o único fator de estresse podem subestimar os riscos reais impostos por substâncias tóxicas em ambientes naturais. É, portanto, aconselhável também estudar os efeitos crônicos e várias gerações de concentrações subletais de substâncias tóxicas em um contexto ambientalmente relevante, como defendido pela Comissão Europeia^4,5 e da EPA (Unidos Agência de proteção ambiental dos Estados)^6,7. Especialmente na investigação de vertebrados, os custos em termos de tempo, dinheiro e mão de obra são elevados ao realizar estudos de exposição crônica e multigeracionais devido a expectativa de vida relativamente longa de vertebrados em comparação com organismos invertebrados modelo. Portanto, é aconselhável escolher o mais apropriado organismo modelo de peixe, dependendo a pergunta de pesquisa. Além disso, uma grande variedade de espécies de vertebrados deve estar disponível para testar a generalidade das respostas em toda espécie de ser capaz de se adaptar a regulamentação baseada nas espécies mais sensíveis. Por enquanto, há uma necessidade de desenvolver novos protocolos eficientes com espécies de vertebrados modelo caracterizados por ciclos de vida curtos para diminuir os custos da realização de exposições crônicas e várias gerações em vertebrados^7,8.

O turquesa killies Nothobranchius furzeri é um modelo interessante de peixe para uso em tais experimentos de exposição a longo prazo por causa de seu tempo de maturação curto e o ciclo de vida (tempo de geração de menos de 4 semanas⁹). Isto significa que os pontos de extremidade ecologicamente relevantes como tempo de maturação e de fecundidade podem ser estudados dentro de um curto espaço de tempo em comparação com outros modelos de peixe⁷. Além disso, estes peixes produzem ovos resistentes à seca, dormentes que permanecem viáveis por vários anos, quando armazenada em condições normais, eliminando assim a necessidade de uma cultura contínua⁹. Em estudos ecotoxicológicos, isto também implica que replicar peixe pode tudo ser incubado no mesmo momento, resultando em sincronia de tempo para todos os animais, mesmo entre lotes de ovos produzidos em momentos diferentes. Recomendamos utilizar o laboratório cepa GRZ para realizar experimentos de exposição. Esta cepa executa bem em condições de laboratório, é homozigota (exceto cromossomos sexuais) e o genoma é bem caracterizada^10,11.

Em estudos ecotoxicológicos, é importante selecionar o apropriado intervalo de concentrações. Vários métodos complementares podem ser usados para este fim. O intervalo de concentração nominal pode basear-se a sensibilidade de uma espécies relacionadas, tais como Nothobranchius guentheri¹². Alternativamente, a escala pode basear a sensibilidade de modelos padrão de peixes, como o peixe-zebra (Danio rerio)² , que têm uma sensibilidade comparável à maioria das substâncias tóxicas (Philippe et al (em revisão)). Em combinação, com essas duas opções, uma gama de encontrar o experimento deve ser conduzida para selecionar o intervalo de concentração nominal. Para o teste agudo, pesquisadores devem procurar para tratamentos de concentração com 100% de mortalidade, mortalidade intermediária e 0% de mortalidade após 24 h de exposição para a toxicidade. Para o teste crônica, é aconselhável executar a gama de encontrar o experimento por duas semanas para verificar se a mortalidade larval na condição com as maiores concentrações de teste não exceda 10% durante este período de referência.

O protocolo pode servir como uma base para realizar a exposição aguda e crônica aos poluentes de origem hídrica em s. furzeri, examinando os efeitos potenciais de estressores tanto a nível individual e celular. Também pode ser usada para executar a pesquisa multi estressor para acomodar uma maior relevância ecológica, mistura de diferentes compostos tóxicos ou estudar efeitos interativos entre poluição e outros factores de stress naturais (por exemplo, predação) ou antropogênicas estressores (por exemplo, o aquecimento devido às alterações climáticas).

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de ética da Kortenberg.

1. incubação e manutenção geral de furzeri s.

1. Preparar peixe médio (pH 7), a uma temperatura de 14 ° C e adicionar água purificada do tipo II, com adicionado sais padronizadas, com uma condutividade de 600 µS/cm (24 ° C).
2. Selecione a linha de laboratório GRZ (Gona-Rhe-Zhou) que foram armazenados sob condições padronizadas¹³ovos. Selecione os ovos na fase DIII (ou seja, prontos para eclodir), reconhecíveis pela presença de olhos de ouro⁹ e suavemente transferi-los com um macio par de pinças para um tanque de 2L de plástico (não mais do que aproximadamente 30 ovos por tanque).
   Nota: Para ter um número suficiente de organismos teste saudável, chocar ovos duas vezes tantas como o número de larvas de peixes necessários.
3. Adicionar 1 cm do meio de peixe a 12 ° C e deixe a temperatura da água gradualmente convergem para a temperatura ambiente (24 ° C)⁹. Peixe eclodirão dentro as primeiras 12 horas.
4. Após 24h, alimentar os filhotes uma dose concentrada de recém nascidos Artemianauplii (para mais detalhes sobre a frequência e a quantidade de comida, consulte protocolo de criação de Polačik et al . 2016⁹) e aumentar a profundidade de água de 5 cm por adicionando o meio do peixe.
5. Após 36 h, alimentar os filhotes mais uma dose concentrada de recém nascidos de náuplios de Artemia e adicionar meio peixe para aumentar a profundidade de água de 10 cm.
6. Incubar os recipientes de peixes sob condições de temperatura constante (por exemplo, em uma incubadora, a sala de clima ou o banho de água aquecida) sob um 14 h:10 h regime de luz: escuro.
7. Antes do início do experimento, recipientes de peixe complexo (sem peixes) com a exposição composto por preenchê-los com a maior concentração de meio de exposição e deixá-lo durante a noite a fim de limitar a transferência de substâncias tóxicas para o recipiente no real experimento.
8. 48 h após a eclosão, selecione larvas flutuantes saudáveis para começar o experimento exposição. Descartar a chamada barriga-controles deslizantes que não foram capazes de encher a sua bexiga natatória e, consequentemente, ter uma flutuabilidade prejudicada (continuamente afundar até o fundo).

2. a curto prazo protocolo de exposição

Nota: Pesquisadores devem apontar para pelo menos 20 repetições (20 peixes em frascos separados) por tratamento. Além de um tratamento completo controle, um controle solvente deve ser incluído se a solução estoque do composto é preparada usando um solvente. O controle do solvente deve conter a quantidade de solvente, igualando a concentração de solvente na maior concentração de exposição.

1. Prepare os recipientes experimentais (frascos de vidro de 0,5 L) rotulá-los e preenchê-los com o meio de exposição adequado (diferentes concentrações tóxicas). Adicione o composto para obter a concentração correta.
2. Transferi as larvas (para pós-incubação 48 h) individualmente para os recipientes (1 peixe por contêiner para monitorização individual).
   Nota: Peixes são expostos individualmente para minimizar potenciais efeitos de confundimento de interação social como a competição por comida e agressão. No entanto, peixes podem interagir visualmente de acordo com padrões éticos para o uso de animais de laboratório.
3. Acompanhar esta exposição aguda para uma duração de até 2 semanas. Durante esse tempo, alimentar os peixes ad libitum com náuplios de Artemia , duas vezes por dia, 7 dias por semana.
4. Atualize o meio todos os dias para manter a qualidade da água e para minimizar os efeitos potenciais de degradação de compostos. Monitorar as variáveis chave de água (níveis de oxigênio dissolvido devem exceder 80%, condutividade deve variar entre 600 e 700 µS/cm, pH entre 7,8 e 8,2 dureza (como CaCO₃) entre 350 e 450 mg/L, que se encontra dentro do intervalo de condições ideais de criação para furzeri s. ⁹). Colher amostras de água antes e depois de atualizar o meio para determinar as concentrações de compostos reais.
5. Pontos de extremidade
   1. Verifique o peixe para a mortalidade, stress (por exemplo, o comportamento aberrante: nadar de cabeça para baixo) ou doença diariamente (manhã, tarde). Consulte a publicação de Shedd et al (1999) ¹² para obter detalhes sobre a observação da mortalidade, stress ou doença.
   2. Calcular LC₅₀ valores baseados na mortalidade usando curvas dose-resposta (Ritz e Streibig, 2005) em pontos de tempo diferentes. Use a função de drm no pacote RDC em v3.2.3 R (R desenvolvimento Core Team, 2016) ou abordagens estatísticas semelhantes.

3. protocolo de exposição crônica

Nota: Visam um mínimo de 25 peixes/condição no início do experimento, para minimizar as chances de uma sexo-relação enviesada e para acomodar a mortalidade de fundo potencial devido a causas naturais (i. e. mortalidade relacionada à idade).

1. Incubação (ver seção 1)
2. Fase I (2 dias pós-incubação-16 dias pós-incubação)
   1. Seguir o protocolo, conforme descrito no ponto 2.1-2.4
   2. Como durante a segunda fase do experimento, o Médio irá degradar ao longo da semana (nenhum refresco, veja abaixo). Armazene a quantidade necessária de média para uma semana em grandes recipientes inertes para permitir semelhante degradação do composto.
3. Fase II (16 dias pós-incubação-final)
   1. Preparar 2L experimental frascos de vidro por complexantes-los com o composto. Encha os frascos com o meio de exposição correta e adicionar um tubo de ar para ventilar o frasco. Casa peixe individualmente esses vidrinhos para o restante do experimento. Permita a interação visual acomodar padrões éticos.
   2. Atualize o meio uma vez por semana. Transfira o peixe com uma rede para um novo frasco contendo o mesmo meio de exposição. Colher amostras de água todos os dias durante uma semana para monitorar a degradação do composto em cada tratamento de concentração. Calcule uma curva de degradação para cada tratamento se múltiplos estressores são testados (por exemplo, toxicidade de um composto em regimes de temperatura diferente). Medir parâmetros abióticos (pH, temperatura, oxigênio % dissolvido, condutividade) três vezes por semana.
   3. Desde 2 dias pós-incubação (dph) até 23 dph, alimente os peixes duas vezes por dia, 7 dias por náuplios de Artemia ad libitum semana. De 24 dph - 37 dph, complemente a dieta de anúncio libitumArtemia com larvas de Chironomus picadas. De 38 dph em, alimente os peixes duas vezes por dia, 7 dias por semana ad libitum congelado Chironomus larvas.
4. Pontos de extremidade
   1. Diariamente Verifique o peixe para mortalidade, stress ou doença¹².
   2. Para determinar o crescimento, medir o tamanho do corpo em uma base semanal (9 dph - 16 dph - 21 dph -...) através da transferência de peixe para um prato de petri preenchido com média de seu reservatório. Tirar fotos de tamanho calibrado de 4-5 do peixe de cima (em uma altura fixa) e analisá-los digitalmente usando um programa de medição espacial (por exemplo, ImageJ).
      Nota: Para os peixes adultos, use um prato de petri maior para minimizar o estresse da manipulação, mantendo todos os peixes submergidos durante todo o processo de medição.
   3. Para maturação masculina, inspecione visualmente o peixe diariamente para a coloração de dph 15 em diante. Verifique se as aletas para os primeiros sinais de coloração nupcial (característica sexual secundária). Usar o primeiro dia em que é visível como um proxy para o tempo de maturação masculino.
   4. Um par de peixe não-sexados com machos do grupo de tratamento mesmo ou machos não-experimentais, três vezes por semana de 30 dph em diante a fim de determinar o tempo de maturação de fêmeas (o dia que o primeiro ovo é depositado). Para tal, utilize o desova protocolo descrito no 3.4.5.
   5. Para a fecundidade, casal maduro fêmeas com machos maduros 3 vezes / semana de dph 30 em diante, dentro de seus tratamentos utilizando um esquema de cruzamento.
      1. Preparar um tanque de desova (1 L) para cada par, usando o meio de exposição do aquário masculino suplementado com substrato de desova (areia fina < 500 µm).
      2. Transferir o macho e a fêmea para o tanque de desova e permitir que eles desovam durante duas horas. Minimize a actividade humana ou perturbação ao redor dos recipientes desova durante este processo.
      3. Depois, gentilmente transferi peixes volta para seus recipientes originais de habitação, sem mistura desnecessária de água, que seria giro os ovos no substrato desova.
      4. Filtre os ovos por derramando o substrato de desova sobre uma 500 µm malha. Conte com o ovo e transferi-los (usando uma pinça macia) de musgo de turfa úmido em placas de Petri^9,14.
      5. Remova ovos mortos diariamente. Depois de uma semana, o selo o Petri prato com filme de selagem e armazená-lo em uma temperatura controlada incubadora a 28 ° C e um 14:10 h luz: escuro ciclo de desenvolvimento imediato à fase DIII (ou seja, prontos para eclodir após cerca de três semanas). Para armazenamento a longo prazo, armazene os ovos a 17 ° C na escuridão constante, sobre os quais ovos entram a fase dormente e permanecem viáveis por vários anos. Quando peixes provenientes desses ovos dormentes para experimentos de recrutamento, transferi os ovos dormentes para condições de 28 ° C com 14:10 h luz: escuro ciclo por aproximadamente três semanas permitir o desenvolvimento da fase de DIII.
   6. Medir o máximo térmico crítico (CTmax) (uma medida de desempenho¹⁵) de peixes adultos.
      1. Usar um banho de água aquecida a uma taxa constante de 0,33 ° C/min e em que a água é circulada continuamente. Adicione vários aquários de 1 L para cada peixe individual.
         Nota: Dadas as restrições de espaço no banho de água, é necessário trabalhar em várias séries. Diferenças de potencial em condições entre séries devem ter em conta quando a realização de análises estatísticas, incluindo a 'série', como um fator aleatório.
      2. Inicie o julgamento, adicionando os peixes no aquário quando a água do aquário tiver atingido a temperatura de criação experimental do peixe (geralmente de 28 ° C). Monitore a temperatura nas aquários de 1L do banho CTmax cada 5min com um termómetro digital (escala de 0.1 ° C).
      3. Termine o julgamento, quando o peixe não consegue manter uma posição dorso-ventralmente vertical ou começa a contorcer-se fortemente^16,17. Medir a temperatura do aquário de 1 L, que é a temperatura crítica máxima. O peixe de volta para seu alojamento experimental para recuperação de transferência.
   7. Medir o peso (precisão de 0,1 mg) do peixe no último dia do experimento acariciando-seco e transferindo-o em um barco de pesagem. Nota: Todos os peixes devem ser mensurados a quatro horas após a última alimentação para padronizar o peso do alimento no trato intestinal.
   8. Eutanásia o peixe usando 0.1% tricaina.

4. protocolo de exposição transgeracional

Nota: Para medir transgeracional efeitos dos poluentes sobre s. furzeri, segui o protocolo de exposição crônica descrito acima para a primeira geração.

1. Duas vezes por semana, verificar o desenvolvimento dos ovos produzidos (ou seja, a segunda geração) armazenado a 28 ° C 14:10 condições de ciclo de luz: escuro h inspecionando os pratos de petri para embriões na fase de DIII (ver Polačik et al 2016.⁹). Quando mais de 50 repetições de cada tratamento parental estão totalmente desenvolvidas, chocar seguindo o protocolo em 1.1.
2. Expor um peixe saudável, flutuante para exatamente a mesma configuração e tratamento como o peixe parental.

Resultados

Os resultados da exposição aguda do furzeri s. para diferentes concentrações de cobre, calculado como em 2.5.2, mostrar relações cleardose-resposta (Figura 1). Há um aumento da mortalidade, com o aumento da concentração tóxica. Valores de LC₅₀ diminuem ao longo do tempo, significando que, com a diminuição de concentrações, mais o tempo passa antes 50% do Replica morrer. Para resultados detalhados sobre a exposição aguda e c...

Discussão

Este trabalho descreve um bioensaio novo usando Nothobranchius furzeri, um organismo modelo emergente, para estudar o indivíduo e combinados a longo prazo efeitos de substâncias tóxicas e outros estressores. Os protocolos apresentados foram aplicados com êxito para medir a sensibilidade da espécie para uma matriz de substâncias tóxicas (cobre, cádmio, 3,4-dicloroanilina e Clorpirifós). Devido ao seu ciclo de vida rápido, este modelo de vertebrados permite a avaliação da subletais e transgeracional ef...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
purified water Type 1 (milli Q)	Millipore
Sea Salt	Instant Ocean
2L plastic tank	SAVIC		Always separate material for control and toxicity treatments
1L plastic tank (spawning)	Avamoplast		Always separate material for control and toxicity treatments
nets	Aqua bilzen		Always separate material for control and toxicity treatments
2L glass jars	Sepac-Flacover		Always separate material for control and toxicity treatments
0,5L glass jars	Sepac-Flacover		Always separate material for control and toxicity treatments
Artemia eggs	Ocean Nutrition
chironomus	Ocean Nutrition		frozen
tricaine	Sigma aldrich
petri dishes	VWR
Parafilm	VWR
pipettes	MLS
tweezers	FST
500 µm mesh sieve	/		self-made
microcentrifuge tube (2ml)	BRAND		To store fish in freezer
glass vials	Sigma aldrich		For water analysis
weighing boat	MLS
Jiffy 7c pellets	Jiffy
water bath	Gilac		for Ctmax
liquid nitrogen	Air liquide
digital thermometer	Testo AG	testo 926
HETO therm heater	Anker Schmitt
calibrated balance	Mettler-Toledo AG
camera	/
platform for camera	/		self-made
Multiparameter kit	HACH
Freezer (-80°C)	Panasonic Ultra low temperature freezer
Name	Company	Catalog Number	Comments
Fysio
homogenisation buffer	VWR		0.1 M TRIS–HCl, pH 8.5, 15 % polyvinyl pyrrolidone, 153 µM MgSO4 and 0.2 % Triton X-100
chloroform:methanol	Sigma Aldrich
glyceryl tripalmitate	Sigma Aldrich
amyloglucosidase	Sigma Aldrich	A7420
glucose assay reagent	Sigma Aldrich	G3293
Biorad protein dye	VWR
96-well microtiter plate	Greiner Bio-one
384 microtiter plates	Greiner Bio-one
2 ml glass tubes	Fiers		For fat analysis
2,5ml eppendorf tubes	VWR
homogeniser	Ultra-turrax TP 18/10
photospectrometer	Infinite M200 TECAN
heater for glass tubes	Hach COD REACTOR
centrifuge	Eppendorf Centrifuge 5415 R
Incubator	Bumako