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  • Resumen
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  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Aquí proporcionamos un método para la identificación y aislamiento de grandes cantidades de GM-CSF por células mieloides con clasificación de celda de alta velocidad. Pueden identificarse cinco poblaciones distintas (progenitores mieloides comunes, progenitores de granulocitos/macrófagos, monocitos, macrófagos derivados de monocitos y DCs derivados de monocitos) basado en la expresión Ly6C y CD115.

Resumen

Cultivos de células dendríticas derivadas de monocitos (moDC) generadas a partir de médula ósea de ratón usando Factor de estimulante de Colonia del Granulocyte-macrófago (GM-CSF) han sido reconocidos recientemente para ser más heterogéneos que apreciado previamente. Estas culturas habitualmente contienen moDC derivados de monocitos y macrófagos (moMac) e incluso algunas menos desarrolladas células tales como monocitos. El objetivo de este protocolo es proporcionar un método coherente para la identificación y separación de los diversos tipos de células presentes en estas culturas que se desarrollan, por lo que sus funciones específicas pueden ser investigada más a fondo. La estrategia de clasificación presentada aquí separa las células primero en cuatro poblaciones basadas en expresión de Ly6C y CD115, los cuales se expresan transitoriamente por las células que se desarrollan en la cultura impulsada por el GM-CSF. Estas cuatro poblaciones incluyen comunes progenitores mieloides o CMP (Ly6C, CD115), progenitores de granulocitos/macrófagos o GMP (Ly6C +, CD115), monocitos (Ly6C +, CD115 +) y macrófagos derivados de monocitos o moMac (Ly6C-, CD115 +). CD11c se agrega también a la estrategia de clasificación para distinguir dos poblaciones dentro del Ly6C, CD115-población: CMP (CD11c-) y moDC (CD11c +). Finalmente, dos poblaciones pueden ser distinguidas más lejos dentro del Ly6C, CD115 + población basado en el nivel de expresión II de la clase de MHC. MoMacs expresan bajos niveles de MHC de clase II, mientras que un precursor DC derivados de monocitos (moDP) expresa mayor MHC de clase II. Este método permite el aislamiento fiable de varias poblaciones con distinta en números suficiente para una variedad de análisis funcionales y de desarrollo. Destacamos una tal lectura funcional, la respuesta diferencial de estos tipos celulares a la estimulación con patrones moleculares Pathogen-Associated (PAMPs).

Introducción

Cultivo de células de médula ósea murina con la citoquina Factor de estimulante de Colonia del Granulocyte-macrófago (GM-CSF) es ampliamente utilizado como un método para generar células dendríticas derivadas de monocitos (moDC; también conocido como DC inflamatoria) en gran número 1, 2,3,4,5. Estas células han sido extremadamente útiles en una variedad de estudios de la función de células dendríticas (DC) 6,7,8. Normalmente, estas células de médula ósea murina se cultivan para 6-8 días y luego se utilizan para el estudio de las células dendríticas función 5. Estas culturas habían sido considerado como sobre todo homogéneas, compuesto por una mayoría de moDC diferenciado. Más recientemente, ha quedado claro que al final de este período de cultivo de 6 a 8 días, hay de hecho muchos moDC, así como un subconjunto grande de macrófagos derivados de monocitos diferenciado (moMacs) 9,10,11. Nuestros propios estudios han ampliado estos resultados demostrando que otros subconjuntos de menos células desarrolladas, como precursores de moDC (moDP) y monocitos, siendo en las culturas a baja frecuencia incluso después de 7 días 10. Así, los estudios de la función de células dendríticas (DC) con células generadas por este sistema podrían reflejar las respuestas de una cohorte más amplia de tipos de células que previamente apreciado.

Hemos aprendido mucho del estudio de moDC de GM-CSF-generan relacionadas con la función de estas células en la fase final de diferenciación 12,13,14. Sin embargo, entendemos que significativamente menos por la vía del desarrollo de estas células 2,15,16 y de cómo y cuándo exhibir específicas funciones tales como: capacidad de respuesta a patógenos asociados moleculares Patrones (PAMPs), fagocitosis, procesamiento y presentación de antígeno 13y actividad antibacteriana. Un protocolo para el aislamiento de un gran número de progenitores basada en Flt3L DC convencionales y precursores ha sido reportado 17. Aislamiento de estas poblaciones distintas se logró utilizando carboxyfluorescein succinimidyl éster (CFSE)-tinción de las células de la médula ósea (para seguimiento de células divisorias) y la cultura en Flt3L por 3 días. Las células fueron agotadas de las células positivas de linaje y clasificó en poblaciones progenitoras y precursoras en la expresión de CD11c 17. Otro enfoque por grupo de Leenen identificar progenitores tempranos de DC en la cultura impulsada por el GM-CSF fue ordenar las células partiendo de CD31 y Ly6C 18. El objetivo inicial era crear un método similar para la obtención de progenitores y precursores de moDC de GM-CSF-conducido. Debido a los tipos de células específicos generados por GM-CSF, adaptamos el enfoque y estrategia basada en la expresión de las moléculas que se expresan en etapas tempranas y posteriores de desarrollo de la clasificación. Finalmente determinamos que Ly6C, CD115 (receptor CSF-1), y CD11c fueron los mejores marcadores para distinguir estas células tipos de 10.

Aquí, presentamos un método para el aislamiento de las células en varias etapas distintas de desarrollo a lo largo de la vía de diferenciación impulsada por GM-CSF: monocito Progenitor mieloide común (CMP), Progenitor del Granulocyte-macrófago (GMP), macrófagos derivados de monocitos (MoMac) y DC (MoDC) derivados de monocitos. La población de moMac puede más separada en base a nivel de expresión II, clase de MHC revelando un moDC precursor población (moDP) 10. Utilizamos un celular activado por fluorescencia alta velocidad clasificación estrategia (FACS) para aislar a estas 5 poblaciones basadas en expresión de CD11c, Ly6C y CD115. Entonces demostramos el examen de estas células en ensayos funcionales revelando sus respuestas a la estimulación de PAMP.

Protocolo

Todo trabajo animal fue aprobado por la Auburn University institucional Animal Care y uso según las recomendaciones indicadas en la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los institutos nacionales de salud.

1. preparación para la recolección de médula ósea

  1. Preparar medios completo 250 mL mediante la adición de una solución de medio de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado con suero de ternera fetal 10%, glutamina 2 mM y 50 μm 2-Mercaptoetanol en la parte superior de una unidad de matraz 0.22 μm filtro de vacío y aplicar vacío.
    Nota: Medio completo puede conservarse a 4 ° C hasta 2 meses.
  2. Mezclar 350 mL de etanol al 100% con 150 mL estéril H2O en un matraz de 500 mL para preparar solución de etanol 70%.
  3. Set centrifugar a 4 ° C.
  4. Esterilización fórceps, bisturí y tijeras en etanol al 70%.
  5. Con una pipeta serológica, añadir 5 mL de medio completo a tres platos de Petri de 60 mm.
  6. Con una pipeta serológica, Añadir 30 mL de medio completo a un tubo cónico de 50 mL.

2. colección de células de médula ósea murina

  1. Eutanasia a un ratón C57BL/6 por CO2 narcosis con arreglo a las reglas establecidas por las directrices de la Asociación Médica Veterinaria americana (AVMA) de 2013 sobre la eutanasia.
  2. Retire y tira de las patas traseras.
    1. Saturar las patas traseras y el torso con etanol al 75% y realizar cortes superficiales a través de la piel alrededor de la articulación de la cadera con tijeras curvas del tejido. Con unas pinzas, tire firmemente la piel de la cadera hacia abajo hacia el tobillo, revelando el músculo. Use tijeras para quitar la aleta de la piel.
    2. Retirar la pierna entera cortando a través del hueso justo por encima de la articulación del fémur, cadera.
      Nota: Además de la zona de esterilización, el etanol ayuda proporciona cortes limpios y evitar que el pelo contamine las muestras.
    3. Si las piernas se trasladará a una nueva ubicación para la recolección de médula ósea, sumergir las piernas en los medios de comunicación completa.
  3. Trabajar en un gabinete de bioseguridad estéril, transferir las piernas a uno de los platos de Petri previamente preparado.
  4. Utilice tijeras para cortar el justo debajo de los tobillos y con cuidado quitar tanto de los tejidos muscular y elástica posible. Transferir el hueso limpio para el segundo plato de Petri preparado.
    Nota: Aunque no es necesario quitar todo el músculo, demasiado tejido restante puede hacerlo difícil eliminar la médula ósea.
  5. Separar el fémur, la rodilla y la tibia.
    1. Con unas pinzas, sujetar la pierna en la rodilla y localizar la médula.
      Nota: la médula ósea debe verse como una tenue línea roja dentro de la cavidad ósea en la parte superior del fémur y hacia el final de la tibia.
      1. Con unas tijeras, hacer tres cortes como sigue.
        1. Cortar la tibia justo por encima de donde aparece la médula para terminar.
        2. Corte justo por debajo de la articulación de la rodilla.
        3. Corte justo por encima de la articulación de la rodilla.
        4. Si la articulación de la cadera todavía está conectada con el fémur, cortar justo por debajo de la articulación de la cadera.
      2. Retomar los tres fragmentos de la placa de Petri y repita este proceso en la otra pierna.
  6. Al ras de la médula del fémur y la tibia.
    1. Llene una jeringa de 10 mL con medios completo del tubo cónico de 50 mL y tapa con aguja de 23 G.
    2. Sujeta el hueso con el fórceps sobre el tercer plato de Petri preparado, inserte la aguja en el canal óseo y empuje de los medios de comunicación a través de lavado las células (que pueden surgir como un "enchufe" intacto o varios clusters). Repita hasta que no más color se puede ver a través del hueso. Vuelva a llenar la jeringa con los medios de comunicación según sea necesario.
  7. Aplastar las epífisis.
    1. Mientras que en la segunda placa de Petri, sujete firmemente el casquillo de la rodilla con unas pinzas y puré las rodillas con la punta de la jeringa. Continúe hasta que las epífisis no son rojas.
  8. Usando la jeringa, transferir las células de la segunda y tercera caja Petri para el tubo de 50 mL. Desintegración grumos transfiriendo suavemente hacia arriba y hacia abajo. Trate de no generar burbujas. Centrifugar a 250 x g a 4 ° C durante 10 minutos.
  9. Lyse células de sangre rojas
    1. Retirar el sobrenadante con pipeta serológica desalojar pellets por chasquear y lyse las células de sangre rojas por incubación en 1 mL de tampón de lisis ACK (amonio cloruro de potasio) durante 1 min a temperatura ambiente.
    2. Con una pipeta serológica, añadir 40 mL de tampón HBSS (Hanks equilibrada solución de sal).
  10. Utilizando una pipeta serológica, filtrar las células aunque un colador de célula 70 μm en un tubo cónico de 50 mL nuevo. Centrifugar a 250 x g a 4 ° C durante 10 minutos.
  11. Con una pipeta serológica, eliminar las células sobrenadante y lavar con 40 mL de medio completo. Centrifugar a 250 x g a 4 ° C durante 10 minutos.
    Nota: En esta fase, los linfocitos positivos linaje pueden eliminarse por FACS o purificación magnética de la columna. Sin embargo, los linfocitos no se mantienen a largo plazo en la cultura. Aunque un gran número de células positivas de linaje está presente en la población Ly6C-CD115 en la médula ósea ex vivo, casi todos están ausentes por día 5 (figura 2).
  12. Con una pipeta serológica, quite el sobrenadante y las células de médula ósea en medios completo con 10 ng/mL de GM-CSF recombinante del ratón a una densidad de 1 x 106 células/mL de la cultura.
    Nota: Por lo general, 4 x 107 células totales se pueden cosechar después de lisis de glóbulos rojos. Sin embargo, esperar tan poco como 2 x 107 para principiantes y hasta 5 x 107 células para cosechadoras experimentados.
  13. Con una pipeta serológica, transferir las células a las placas de cultivo de tejidos e incubar a 37 ° C en 5% CO2. Si usando una placa de 24 pocillos, semilla cada uno con 2 mL de la suspensión celular.
  14. Cada 48 h, utilice una pipeta serológica para quitar la mitad de los medios de comunicación y sustituir por medio completo fresco y GM-CSF.
    Nota: Las culturas pueden ser guardadas durante 9 días. Sin embargo, la composición cambia con el tiempo. Para más información vea la sección 3.

3. elegir día de clase

  1. Como composiciones de población celular cambian con el tiempo, seleccione un día que produce el mayor número de células deseadas.
  2. Ver tabla 1 para la clase de post producción celular prevista para cada una de las poblaciones después de 3, 5 y 7 días de la cultura en GM-CSF por 1 x 107 células.

4. estrategia de tinción

  1. Utilizar pequeñas alícuotas de células para preparar muestras de control. Incluir un control sin manchas, muestras de control de compensación teñidas con anticuerpos fluorescentes solamente una cada uno, y fluorescencia-menos-uno controla en que los anticuerpos se añaden excepto uno, al control de fluorescencia no específica en ese canal. Si uso etiquetado indirecta, incluye primaria secundaria solo, solo y tanto primaria como secundaria.
    Nota: Ficoeritrina (PE) y allophycocyanin (APC) con la etiqueta anticuerpos proporcionan distinta separación con sangrado mínimo sobre cuando se utilizan juntos. Sin embargo, si el fluorocromo opciones son limitadas, CD115 se expresa en un nivel relativamente bajo, mientras que Ly6C se expresa en niveles muy altos. Por lo tanto, más brillantes fluorocromos son deseables para anti-CD115 y anti-Ly6C fluorocromos son elegidos para evitar sangrado.
  2. Preparar 100 mL de tampón de lavado FACS (FWB) mediante la mezcla de 97 mL de solución salina de refrigerada Dulbecco tampón fosfato (DPBS) con 3 mL de suero de ternera fetal en un tubo cónico de 50 mL y colocar en un baño de hielo.
  3. Utilice una pipeta para suavemente pero a fondo, pipetear las células arriba y abajo para desplazar las células ligeramente adherentes.
  4. Mediante una pipeta serológica, transferir las células a un tubo cónico de 50 mL. Centrifugar a 250 x g a 4 ° C durante 10 minutos.
    1. Si volumen celular superior a 50 mL, transferir las células al número necesario de tubos y combinan en el paso de la tinción.
  5. Suavemente retirar el sobrenadante y lavar las células pildoradas añadiendo 30 mL de FWB con una pipeta serológica. Centrifugue a 250 x g a 4 ° C durante 10 minutos y repetir el lavado.
    Nota: Si se espera que la muerte celular alta, las células se pueden lavar con FWB con tan bajo como 0.5% de suero de ternero fetal (FCS). Esto evitará aglutinación celular.
  6. Suspender y mancha las células por anticuerpos fabricante.
    1. Suspender 5 x 107 células en 1 mL de FWB y añadir 2 μg de anti Ly6C y anti-CD115 con fluoróforos (de elección del investigador). Para distinguir más lejos CMP de moDC (ambos son Ly6C - y CD115-), agregar 2 μg de anticuerpos anti-CD11c (CMP son CD11c–; moDC son CD11c+). Incubar durante 30 min en hielo.
      Nota: Figura 3 se generó utilizando Ly6C-PE y CD115-APC.
  7. Con una pipeta serológica, añadir 10 mL de FWB y centrifugue a 250 x g a 4 ° C durante 10 minutos.
  8. Suavemente retirar el sobrenadante y lavar las células pildoradas añadiendo 30 mL de FWB con una pipeta serológica. Centrifugue a 250 x g a 4 ° C durante 10 minutos y repetir el lavado.
  9. Antes de suspender las células, la película tubo a fin de desalojar la pelotilla. Utilice una pipeta serológica para suspender las células 1 x 107 células/ml de FWB y filtrar con filtro de 35 μm de la célula. Utilice una pipeta serológica para transferir células filtradas en tubo de polipropileno y coloque en hielo hasta que esté listo para ordenar.
    Nota: Si el polipropileno está disponible, pueden utilizarse tubos de poliestireno recubierto de proteína (leche descremada en polvo o FCS) para reducir el atascamiento.

5. sistema basado en muestras de Control de puertas

Nota: Para evitar la interrupción de la célula debido a la presión de la corriente de flujo de alta velocidad, utilice una boquilla de 100 – 130 μm para la clasificación de la célula.

  1. Ejecutar el control sin mancha (ver paso 4.1) a través del clasificador de la célula y una puerta para excluir los desechos pequeños (baja dispersión hacia adelante; FSC) y altamente granulares (dispersión de alta presión; Partículas SSC).
    1. Para analizar sólo los estadios (monocitos, moMac/MoDP y MoDC), aplicar control para incluir sólo las celdas más grandes (alto FSC).
    2. Si se utilizan las manchas de la viabilidad, utilizarlos para excluir acontecimientos manchados, no viables (un ejemplo se ilustra en la figura 1).
  2. Ejecutar los ejemplos de control fluorescente único a través del clasificador de la célula y ajustar la compensación según sea necesario.
  3. Correr una muestra de la muestra multi-labeled. Observar cuatro poblaciones distintas: Ly6C + CD115-(GMPs), Ly6C + CD115 + (monocitos), Ly6C-CD115 + (moMacs/moDP) y Ly6C-CD115 - (CMP/moDCs). Aplicar una puerta para aislar cada una de las cuatro poblaciones principales.
    Nota: CMPs y moDC comparten el fenotipo de CD115 Ly6C. Sin embargo, pueden diferenciarse en base a la expresión de CD11c: CMP carecen de CD11c, mientras que MoDCs expresa CD11c.

6. colección de poblaciones aisladas

  1. Preparar tubos agregando suficiente FCS para alcanzar al menos el 20% concentración final cuando esté lleno. Por ejemplo, si utiliza tubos de 5 mL, añadir 1 mL de FCS antes de la clasificación y retire el tubo cuando se alcanza el volumen total de 5 mL.
  2. Para evitar absorción de facturación y el anticuerpo de membrana, mantener todas las muestras (mezclado y ordenadas) a 4 ° C a lo largo de la clase.
    1. Si esto no es posible, mantenga el tubo que contiene las células para ordenarse en el hielo tanto como sea posible y transferir alícuotas al clasificador según sea necesario.
    2. Además, transferir muestras ordenadas para cada 20-30 min de hielo.
  3. Después de que el número de células se han recogido, utilice una pipeta serológica para transferir las células a un tubo cónico nuevo. Centrifugar a 250 x g a 4 ° C durante 10 minutos.
    1. Confirmar la pureza con el análisis de la especie en pequeñas alícuotas de cada población recogido.
  4. Eliminar el sobrenadante, suspensión en 10 mL de FWB y centrifugue a 250 x g a 4 ° C durante 10 minutos Repita para un total de dos lavados.
    Nota: Puede ser difícil quitar el sobrenadante sin el desalojamiento de la pelotilla. Colocar una punta de pipeta a una línea de vacío puede ayudar con la eliminación. Si esto no está disponible, se recomienda recoger el sobrenadante en un tubo fresco en caso de disociación de la pelotilla.
  5. Quite el sobrenadante después del segundo lavado.
  6. Si el diseño experimental del usuario dicta las células volver a cultivarse, siga los pasos 2.12-2.14. De lo contrario, si las células se utilizará para el análisis inmediato, preparar células según protocolo deseado.
    Nota: Un ejemplo de análisis funcional típico se incluye en la figura 4.

Resultados

En un esfuerzo por mantener tantos canales disponibles para el análisis como posibles, viables las células habitualmente fueron seleccionados basados en la dispersión hacia delante y lateral, excluyendo eventos muy pequeños y muy granulares (una puerta típica se aplica a todos lo punto parcelas en figura 1A). Para determinar si esta estrategia bloquea excluye confiablemente las células muertas, manchó con 7-Amino actinomicina D (7-AAD) (

Discusión

Este protocolo facilita el aislamiento de GM-CSF-conducido progenitoras y precursoras tipos celulares en una cantidad suficiente para varios tipos de análisis incluyendo ensayos bioquímicos, análisis de la función celular in vitro, o la instilación in vivo. Este método representa un avance significativo en el campo del desarrollo de células dendríticas derivadas de monocitos, lo que permite el aislamiento fiable e identificación de células en esta vía de desarrollo, así como los tipos de cé...

Divulgaciones

Los autores no tienen de revelar los conflictos.

Agradecimientos

Estamos muy agradecidos por la asistencia técnica de Alison iglesia Bird en el Auburn Universidad de medicina veterinaria de flujo citometría de planteles escolares, para la financiación de los NIH para EHS R15 R15 AI107773 y al programa de Biología Molecular en la Universidad de Auburn y celular para la financiación de investigación de verano para PBR.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
RPMI 1640Corning15-040-CV
Fetal Calf Serum (FCS)HyCloneSV30014.04to supplement complete medium and FWB
GlutaMAXGibco35050to supplement complete medium
2-mercaptoethanol (2-ME)MP Biomedical190242to supplement complete medium
75 mM Vacuum FilterThermo Scientific156-4045to sterilize complete media
ACK Lysis BufferLonza10-548Eto lyse red blood cell
HBSS bufferCorning21-020-CMto rescue leukocytes after red blood cell lysis
Phosphate Buffered Saline (PBS), Dulbecco'sLonza17-512Fmust be endotoxin free; chilled at 4 °C
35 µm Cell filterFalcon352235to break apart clumps before running through cytometer.
GM-CSFBiosourcePMC2011usable concentration of 10 ng/mL
Tissue cultured treated plateVWR10062-896for bone marrow cells after harvest
Anti-Ly6C, Clone HK1.4Biolegend128018
Anti-CD115, Clone AFS98Tonbo Bioscience20-1152-U100
Anti-CD11c, Clone HL3BD Biosciences557400to differeniate CMP and MoDCs
MoFlo XPD Flow CytometerBeckman CoulterML99030
BD Accuri C6BD Biosciences660517
100% EthanolPharmco-Aaper111000200CSPP
60 mm Petri DishCorning, Inc353002
50 mL Conical tubeVWR21008-242
C57BL/6 MiceThe Jackson Laboratory000664Female; 10-20 weeks old
Biosafety HoodThermo Scientific8354-30-0011
10 mL SyringeBD Biosciences301604
23 G needleBD Biosciences305145
Centrifuge 5810 Reppendorf22625501
FlowJo Software v10BD BiosciencesVersion 10flowjo.com

Referencias

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