JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן אנו מספקים שיטה לזיהוי ובידוד מספר גדול של GM-CSF מונע התאים מיאלואידית באמצעות מיון תא במהירות גבוהה. ניתן לזהות חמש אוכלוסיות נפרדות (אבות מיאלואידית נפוצות גרנולוציט/מקרופאג אבות, ומונוציטים, נגזר מונוציט מקרופאגים, נגזר מונוציט DCs) מבוסס על הביטוי Ly6C ו- CD115.

Abstract

תרבויות נגזר מונוציט תאים דנדריטים (moDC) המופקים מח עצם העכבר באמצעות גרנולוציט-מקרופאג המושבה מגרה פקטור (GM-CSF) הוכרו לאחרונה להיות הטרוגניות יותר מאשר בעבר מוערך. תרבויות אלה מכילים באופן שגרתי moDC גם נגזר מונוציט מקרופאגים (moMac), ואפילו כמה תאים פחות מפותחת כמו ומונוציטים. המטרה של פרוטוקול זה נועד לספק שיטה עקבית עבור זיהוי והפרדה של סוגי תאים רבים נוכח בתרבויות אלו כפי שהם מפתחים, כך הפונקציות הספציפיות שלהם עשויים ייחקר בהמשך. האסטרטגיה מיון המוצגים כאן מפריד תאים תחילה לתוך ארבע אוכלוסיות בהתבסס על הביטוי של Ly6C ו CD115, אשר שניהם באים לידי ביטוי transiently על ידי תאים כפי שהם מפתחים בתרבות מונחה-GM-CSF. אוכלוסיות אלה ארבעה כוללות אבות מיאלואידית נפוצות או CMP (Ly6C-, CD115-.), אבות גרנולוציט/מקרופאג או GMP (Ly6C +, CD115-.), ומונוציטים (Ly6C +, CD115 +), ו מקרופאגים נגזר מונוציט או moMac (Ly6C-, CD115 +.). CD11c נוספה גם אסטרטגיית המיון כדי להבחין בין שתי האוכלוסיות בתוך ה Ly6C-, CD115-האוכלוסייה: CMP (CD11c-), moDC (CD11c +). לבסוף, שתי האוכלוסיות עשויים להבחין נוסף בתוך ה Ly6C-, CD115 + אוכלוסייה בהתבסס על הרמה של מחלקה MHC II הביטוי. MoMacs אקספרס רמות נמוכות יותר של מחלקה MHC II, בעוד הקדמה DC נגזר מונוציט (moDP) מבטא גבוה יותר מחלקה MHC II. שיטה זו מאפשרת בידוד אמין מספר אוכלוסיות שונות מבחינת במספרים מספיק עבור מגוון רחב של ניתוחים פונקציונליים וההתפתחותי. אנחנו מדגישים אחד כזה פונקציונלי את המחוון דיפרנציאלית התגובות אחד מסוגי התאים גירוי עם דפוסים מולקולרית של Pathogen-Associated (PAMPs).

Introduction

Culturing תאי מח עצם מאתר עם ציטוקינים גרנולוציט-מקרופאג המושבה מגרה פקטור (GM-CSF) נעשה שימוש נרחב ככל שיטה לייצר נגזר מונוציט תאים דנדריטים (moDC; ידוע גם בשם DC דלקתיות) מספרים גדולים 1, 2,3,4,5. תאים אלה היה שימושי ביותר במגוון רחב של מחקרים של תא דנדריטי (DC) פונקציה 6,7,8. בדרך כלל, אלו תאים במח העצם מאתר בתרבית למשך 6-8 ימים הינם ואז משמשים למחקר של הפונקציה תא דנדריטי 5. תרבויות אלה היו מזמן נחשב בעיקר הומוגנית, המורכב רוב moDC הבדיל. לאחרונה, כבר ברור כי בסוף תקופה זו תרבות 6-8 יום, ישנם רבים אכן moDC, כמו גם משנה גדולה מתוך הבדיל נגזר מונוציט מקרופאגים (moMacs) 9,10,11. מחקרים שלנו עוד יותר הרחיבו ממצאים אלה מדגימים כי קבוצות אחרות משנה של תאים פחות מפותח, כמו סימנים מקדימים moDC (moDP) ומונוציטים, יישארו בתרבויות בתדר נמוך גם לאחר 7 ימים 10. לכן, מחקרים של תאים דנדריטים (DC) פונקציה באמצעות תאים שנוצרו על-ידי מערכת זו יכול לשקף את התגובות של קבוצה רחבה יותר של סוגי תאים מאשר בעבר מוערך.

למדנו הרבה מאוד מן המחקר של GM-CSF-שנוצר moDC הנוגעים הפונקציה של תאים אלה בשלבים האחרונים של בידול 12,13,14. עם זאת, אנו מבינים באופן משמעותי פחות על מסלול התפתחותי אלה תאים15, 2,16 , של איך ומתי הם מציגים ספציפי פונקציות כגון: היענות הפתוגן הקשורים מולקולרית דפוסי (PAMPs), phagocytosis, עיבוד והצגת אנטיגן 13ועל פעילות אנטי בקטריאלי. פרוטוקול עבור בידוד של מספרים גדולים של אבות DC מבוססת Flt3L המקובלת, מבשרי כבר דווח על 17. בידוד של אוכלוסיות שונות אלה הושג באמצעות אסתר succinimidyl carboxyfluorescein (CFSE)-צבעונית תאים במח העצם (כדי לעקוב אחר תאים החלוקה) ותרבות Flt3L במשך 3 ימים. התאים היו אז דלה של תאים חיובית linage, מתמיינים קדמון לאוכלוסייה קודמן בהתבסס על הביטוי CD11c 17. גישה אחרת על ידי הקבוצה של Leenen כדי לזהות מוקדם המוצא לאגס התרבותי DC בתרבות מונחה-GM-CSF היה כדי למיין התאים בהתאם CD31 ו- Ly6C 18. המטרה הראשונית היתה ליצור שיטה דומה עבור קבלת אבות סימנים מקדימים של moDC מונחה-GM-CSF. בשל סוגי תאים מסוים שנוצר על ידי GM-CSF, שינינו את הגישה ומיון אסטרטגיה המבוססת על הביטוי של מולקולות שבאו לידי ביטוי מוקדם ומאוחר יותר שלבי ההתפתחות. בסופו של דבר קבענו את זה Ly6C, CD115 (קולטן CSF-1), CD11c היו הסמנים הטוב ביותר עבור הבחנה תא אלו סוגי 10.

כאן, אנו מציגים שיטה עבור בידוד של תאים-מספר שלבים של פיתוח לאורך מסלול של בידול מונע על ידי GM-CSF: נפוץ מיאלואידית קדמון (CMP), גרנולוציט-מקרופאג קדמון (GMP), מונוציט, נגזר מונוציט מקרופאג (MoMac), נגזר מונוציט DC (MoDC). האוכלוסייה moMac יכול להיות עוד יותר הפרדה המבוססת על רמה של מחלקה MHC II ביטוי, חשיפת האוכלוסייה (moDP) קודמן 10moDC. אנו מנצלים במהירות גבוהה תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) אסטרטגיה כדי לבודד אוכלוסיות אלה 5 מבוסס על הביטוי של Ly6C, CD115 ו- CD11c. ואז נדגים את הבדיקה של תאים אלה במבחני פונקציונלי חושף את התגובות שלהם PAMP גירוי.

Protocol

כל העבודה בעלי חיים אושרה על ידי אובורן אוניברסיטת אכפת חיה מוסדיים ועל שימוש הוועדה בהתאם להמלצות המפורטות במדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה של מכוני הבריאות הלאומיים.

1. הכנה איסוף מוח עצם.

  1. להכין 250 מ ל מדיה מלאה על-ידי הוספת פתרון של רוזוול פארק אנדרטת המכון (RPMI) 1640 בינוני עם סרום עגל עוברית 10%, 2 מ מ גלוטמין ו 50 מיקרומטר מרקפטואתנול לחלק העליון של יחידת 0.22 של הבקבוק מסנן ואקום מיקרומטר, ולהחיל על ואקום.
    הערה: בינוני מלא ניתן לאחסן ב 4 ° C עד 2 חודשים.
  2. הכן 70% אתנול פתרון על ידי ערבוב 350 מ ל 100% אתנול עם 150 מ סטרילי H2O בבקבוקון 500 מ"ל.
  3. צנטריפוגה set כדי 4 ° C.
  4. לחטא מלקחיים, אזמל, מספריים ב-70% אתנול.
  5. באמצעות פיפטה סרולוגית, הוסף 5 מ של מדיה מלאה שלוש צלחות פטרי 60 מ מ.
  6. שימוש של פיפטה סרולוגית, להוסיף 30 מ של התקשורת מלאה צינור חרוטי 50 מ.

2. אוסף של תאים במח העצם מאתר

  1. המתת חסד עכבר C57BL/6 על ידי הרדמה2 CO לפי הכללים שנקבעו על-ידי המנחים אמריקאי וטרינרי רפואי האגודה (AVMA) 2013 על המתת חסד.
  2. להסיר, להסיר את הרגליים האחוריות.
    1. להרוות את הרגליים האחוריות ואת הגוף עם 75% אתנול, ולבצע חתכים דרך העור סביב מפרק הירך עם מספריים רקמה מעוקל. באמצעות מלקחיים, בחוזקה לנתץ את העור מן הירך לכיוון הקרסול, חשיפת השריר. להשתמש במספריים כדי להסיר את תוספת העור.
    2. הסר את כל הרגל על ידי חיתוך דרך העצם מעל מפרק הירך/הירך.
      הערה: בנוסף חיטוי האזור, האתנול לסייע במתן חתכים נקיים, למנוע זיהום הדגימות שיער.
    3. אם הרגליים יועברו למיקום חדש עבור מח עצם קציר, להטביע את הרגליים בתקשורת מלאה.
  3. עובד אבטחה סטרילי ארון, להעביר את הרגליים לאחת המנות המוכנות בעבר פטרי.
  4. להשתמש במספריים לחתוך הצדיק מתחת לקרסול, ובזהירות להסיר כמה של רקמת חיבור שרירים ו אלסטית ככל האפשר. להעביר את העצם נקי הפטרי מוכן השני.
    הערה: למרות שזה לא הכרחי להסיר את כל השרירים, מדי רקמות הנותרים יכולים להקשות. להוריד את מח העצם.
  5. הפרד את עצם הירך, הברך, שוקה.
    1. באמצעות מלקחיים, החזק את הרגל בברך ואתר את מח העצם.
      הערה: מח עצם צריך להיות גלוי כמו קו אדום חלש בפנים חלל העצם בחלק העליון של עצם הירך, לקראת סוף עצם השוקה.
      1. בעזרת מספריים, לבצע שלושה חתכים כדלקמן.
        1. חותכים בשוקיים מעל בה מח העצם מופיע כדי לסיים.
        2. לחתוך מתחת הברך.
        3. לחתוך קצת מעל הברך.
        4. אם עדיין מקושר מפרק הירך עצם הירך, לחתוך מתחת מפרק הירך.
      2. להחזיר הרסיסים שלושה הפטרי וחזור על התהליך הזה על הרגל השנייה.
  6. ריקון מח עצם הירך, שוקה.
    1. ממלאים מזרק 10 מ"ל עם מדיה להשלים צינור חרוטי 50 מ ל, ואת המחט 23 גרם.
    2. מחזיק את העצם עם מלקחיים מעל הפטרי השלישי מוכן, להוסיף את המחט לתוך התעלה עצם ודחף מדיה דרך, לשטוף החוצה את התאים (אשר עשויות להתגלות ללא פגע "הכנס" או כמו מספר אשכולות). חזור עד אין יותר צבע ניתן לראות דרך העצם. מילוי מחדש את המזרק עם המדיה לפי הצורך.
  7. למחוץ את epiphyses.
    1. אמנם עדיין בצלוחית הפטרי השני, להחזיק את הכובע הברך בחוזקה עם מלקחיים, מועכים את הברכיים עם קצה המזרק. ממשיכים עד epiphyses כבר לא אדום.
  8. באמצעות המזרק, להעביר את התאים השני והשלישי הפטרי הצינור 50 מ. הפרידה את הגושים על ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה. לא לנסות ליצור בועות. צנטריפוגה ב x 250 g ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  9. Lyse כדוריות דם אדומות
    1. להסיר את תגובת שיקוע עם פיפטה סרולוגית, לסלק צניפה על ידי מצליף, ואת lyse כדוריות דם אדומות על ידי המקננת ב 1 מ"ל ACK (אמוניום כלוריד-אשלגן) פירוק מאגר עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. בעזרת פיפטה סרולוגית, להוסיף 40 מ של מאגר HBSS (הנקס מאוזנת תמיסת מלח).
  10. שימוש של פיפטה סרולוגית, לסנן את התאים למרות מסננת תא מיקרומטר 70 לתוך צינור חרוטי 50 מ. צנטריפוגה ב x 250 g ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  11. באמצעות פיפטה סרולוגית, להסיר תאים supernatant, תשטוף עם 40 מ"ל של התקשורת מלאה. צנטריפוגה ב x 250 g ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    הערה: בשלב זה, שושלת היוחסין לימפוציטים חיובי ניתן להסיר באמצעות FACS או עמודה מגנטית טיהור. עם זאת, לימפוציטים לא נשמרות לטווח ארוך בתרבות. למרות מספר רב של תאים חיוביים שושלת היוחסין נמצאים ב- Ly6C-CD115-האוכלוסייה מח העצם ex-vivo, כמעט כולם נעדרים ביום 5 (איור 2).
  12. באמצעות פיפטה סרולוגית, הסר את תגובת שיקוע ולאחר התרבות התאים במח העצם בתקשורת מלאה עם 10 ננוגרם למ"ל של העכבר רקומביננטי GM-CSF-צפיפות של עונה 1 פרק 106 תאים/מ ל....
    הערה: בדרך כלל, 4 x 107 תאים הכולל ניתן לקצור לאחר פירוק תאי הדם האדומים. עם זאת, לצפות רק 2 x 107 למתחילים עד 5 x 107 תאים עבור תבואות מנוסים.
  13. באמצעות פיפטה סרולוגית, להעביר את התאים תרביות רקמה צלחות, דגירה ב 37 ° C 5% CO2. אם באמצעות צלחת 24-ובכן, זרע אחד עם 2 מ"ל של התא השעיה.
  14. כל 48 שעות, להשתמש פיפטה סרולוגית להסיר חצי של המדיה ולהחליף עם מדיה שלם טרי ו- GM-CSF.
    הערה: תרבויות יכולה להישאר ערה עד 9 ימים. עם זאת, הרכב משתנה לאורך זמן. לקבלת מידע נוסף, ראה סעיף 3.

3. בחירת יום מיון

  1. כאשר תא האוכלוסייה יצירות להשתנות לאורך זמן, בחר ביום המניבה את המספר הגבוה ביותר של התאים הרצויים.
  2. עיין בטבלה 1 עבור המיון פוסט התשואה הצפויה תא לכל אחת האוכלוסיות לאחר 3, 5 ו- 7 ימים של התרבות ב- GM-CSF לכל עונה 1 פרק 107 תאים.

4. צביעת אסטרטגיה

  1. השתמש aliquots קטן של תאים כדי להכין דגימות הבקרה. כוללות פקד וללא רבב, דגימות הבקרה פיצוי מוכתם רק פלורסנט סוג נוגדן אחד כל אחת, ושולט זריחה-מינוס-אחד באילו נוגדנים כל נוספים. חוץ מאחד, כדי לשלוט על ידי קרינה פלואורסצנטית שאינם ספציפיים בערוץ זה. אם באמצעות תיוג עקיפה, כולל ראשי משני לבד, לבד, ואת שניהם ראשיים ומשניים.
    הערה: Phycoerythrin (PE) allophycocyanin (APC) מתויג נוגדנים לספק הפרדה ברורה עם דימום מינימלי מעל בעת השימוש בהן ביחד. עם זאת, אם fluorochrome האפשרויות מוגבלות, CD115 מתבטא ברמה נמוכה יחסית, בעוד Ly6C מתבטא ברמות גבוהות מאוד. לכן, fluorochromes בהיר רצוי עבור אנטי-CD115, fluorochromes אנטי-Ly6C הם נבחרו כדי למנוע דימום.
  2. הכן 100 מ של מאגר שטיפת FACS (FWB) על ידי ערבוב 97 מ ל תמיסת פוספט buffered צוננת של Dulbecco (DPBS) עם 3 מ"ל של עגל עוברית נסיוב צינור חרוטי 50 מ ל, ולמקם באמבט קרח.
  3. להשתמש על פיפטה פיפטה בעדינות, אך ביסודיות, תאים למעלה ולמטה כדי לסלק תאים חסיד באופן רופף.
  4. שימוש של פיפטה סרולוגית, העברת תאים צינור חרוטי 50 מ. צנטריפוגה ב x 250 g ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    1. אם נפח התאים עולה 50 מ ל, להעביר המספר הדרוש של צינורות תאים ומשלבים בשלב מוכתמים.
  5. בעדינות יוצקים את תגובת שיקוע, לשטוף את התאים pelleted על-ידי הוספת 30 מ של FWB עם פיפטה סרולוגית. צנטריפוגה ב x 250 g ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות וחזור בכביסה.
    הערה: אם מוות תאים גבוה צפוי, תאים יכולים להישטף עם FWB עם המתחילים 0.5% עגל עוברית סרום (FCS). פעולה זו תמנע תא הצליעה.
  6. להשעות, כתם תאים לפי הוראות היצרן נוגדן.
    1. להשעות 5 x 107 תאים 1 מ"ל של FWB ולהוסיף 2 µg כל של אנטי-Ly6C, אנטי-CD115 המסומנת את fluorophores (של הבחירה של החוקר). לבידול נוסף CMP moDC (שתיהן Ly6C - ו CD115-), להוסיף 2 µg של נוגדנים אנטי-CD11c (CMP הם CD11c–; moDC הם CD11c+). תקופת דגירה של 30 דקות על קרח.
      הערה: איור 3 נוצר באמצעות Ly6C-PE ו- CD115-APC.
  7. שימוש של פיפטה סרולוגית, להוסיף 10 מ ל FWB, צנטריפוגה x 250 g ב- 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  8. בעדינות יוצקים את תגובת שיקוע, לשטוף את התאים pelleted על-ידי הוספת 30 מ של FWB עם פיפטה סרולוגית. צנטריפוגה ב x 250 g ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות וחזור בכביסה.
  9. לפני השעיית תאים, קפיצי צינור ביסודיות כדי לסלק את גלולה. השתמש פיפטה סרולוגית כדי להשהות את תאי-עונה 1 פרק 107 תאים למ"ל של FWB, לסנן דרך מסנן תא 35-מיקרומטר. השתמש פיפטה סרולוגית כדי להעביר תאים מסוננים לתוך צינור פוליפרופילן, ומניחים על הקרח עד מוכנים למיון.
    הערה: אם פוליפרופילן אינו זמין, צינורות פוליסטירן חלבון מצופה (ללא שומן חלב יבש או FCS) יכול לשמש כדי להפחית את הכריכה.

5. הגדרת שערים בהתבסס על דגימות הבקרה

הערה: כדי למנוע לשבירת תאים עקב הלחץ של הנחל זרימה מהיר, השתמש זרבובית מיקרומטר 100-130 למיון התא.

  1. להפעיל את פקד וללא רבב (ראה שלב 4.1) דרך סדרן התא, ולהחיל שער כדי לא לכלול את הריסות (פיזור קדמי נמוך; FSC) וגרגרים מאוד (פיזור גבוהים יחסית; חלקיקי האס).
    1. כדי לנתח רק בשלבים מאוחרים יותר (monocytes, moMac/MoDP ו- MoDC), החל gating רק לכלול תאים גדול יותר (FSC גבוהה).
    2. אם נעשה שימוש הכדאיות כתמים, השתמש ברשימות אלה כדי לא לכלול מוכתם, כלכלית אירועים (דוגמה מודגם באיור1).
  2. להריץ את דגימות הבקרה ניאון יחיד סדרן התא, והתאם פיצוי לפי הצורך.
  3. הפעל מדגם של המדגם התווית על-ידי ריבוי. להתבונן ארבע אוכלוסיות נפרדות: Ly6C + CD115-(Gmp), Ly6C + CD115 + (monocytes), Ly6C-CD115 + (moMacs/moDP), ו- Ly6C-CD115 - (CMPs/moDCs). החל שער כדי לבודד כל אחת מארבע הגדולות.
    הערה: CMPs ו- moDC לשתף את Ly6C-CD115-פנוטיפ. עם זאת, הם ניתן להבחין בהתבסס על הביטוי CD11c: CMP חוסר CD11c, ואילו MoDCs אקספרס CD11c.

6. אוסף של אוכלוסיות מבודדות

  1. להכין אוסף טורפדו על ידי הוספת FCS מספיק כדי להשיג לפחות 20% ריכוז סופי כשהם מתמלאים. לדוגמה, אם משתמש מ ל צינורות, להוסיף 1 מ"ל של FCS לפני מיון, להסיר את הצינור, כאשר הוא מגיע הנפח הכולל 5 מ.
  2. למניעת ספיגת מחזור ונוגדן ממברנה, שמור כל דוגמאות (מעורבב וממוינות) ב 4 ° C במהלך המיון.
    1. אם הדבר אינו אפשרי, לשמור על הצינור המכילות את התאים ניתן למיין על הקרח ככל האפשר ולהעביר aliquots בסדרן כנדרש.
    2. בנוסף, העברת ממוין דגימות קרח כל 20-30 דקות.
  3. לאחר שנאסף מספר התאים הרצוי, השתמש פיפטה סרולוגית כדי להעביר את התאים צינור חרוטי. צנטריפוגה ב x 250 g ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    1. לאשר טוהר עם מיון שלאחר ניתוח על aliquots קטן מתוך כל אוכלוסיה שנאספו.
  4. הסר את תגובת שיקוע, להשעות ב 10 מ"ל של FWB, צנטריפוגה ב x 250 g ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות חוזר עבור סכום של שני מנקי.
    הערה: זה יכול להיות קשה להסיר את כל תגובת שיקוע ללא הם מוציאים בגדר. הצמדת טיפ פיפטה קו ואקום יכול לעזור עם הסרת. אם זו אינה זמינה, הוא הציע תגובת שיקוע ייאספו בשפופרת טריים במקרה של דיסוציאציה גלולה.
  5. הסר את תגובת שיקוע לאחר לשטוף את השני.
  6. אם עיצוב ניסיוני של המשתמש מכתיבה התאים להיות תרבותי מחדש, בצע את השלבים 2.12 – 2.14. אחרת, אם תאים ישמש לצורך בדיקה באופן מיידי, להכין תאים לפי הנוהל הרצוי.
    הערה: דוגמה אופיינית אנליזה פונקציונלית נכללת באיור 4.

תוצאות

במאמץ לשמור על כמה שיותר ערוצים זמינים עבור ניתוח כתאי אפשרי, קיימא באופן שגרתי נבחרו על סמך פיזור קדימה ואת הצד, למעט אירועים קטנים מאוד, מאוד ממוקדת (שער טיפוסי מוחל על כל הנקודה מגרשים ב איור 1A). כדי לקבוע אם אסטרטגיה זו חסימה באופן אמין שלא ייכללו תאים מ?...

Discussion

פרוטוקול זה מאפשר בידוד של מונחי-GM-CSF קדמון, קודמן סוגי תאים במספרים מספיק עבור מספר סוגי ניתוחים כולל מבחני הביוכימי, מבחני תפקוד התאים בתוך חוץ גופיתאו החדרה בתוך vivo. שיטה זו מייצגת התקדמות משמעותית בתחום של פיתוח נגזר מונוציט תא דנדריטי, המאפשר את אמין בידוד וזיהוי של תאים בתחי...

Disclosures

המחברים לך אין קונפליקטים לחשוף.

Acknowledgements

אנחנו אסירי תודה על הסיוע הטכני של אליסון הכנסייה ציפור-אובורן אוניברסיטת בית הספר של רפואה וטרינרית לזרום Cytometry המתקן, עבור מימון NIH EHS R15 R15 AI107773, סלולר וביולוגיה מולקולרית לתוכנית ב אוניברסיטת אובורן במשך הקיץ מחקר מימון PBR.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
RPMI 1640Corning15-040-CV
Fetal Calf Serum (FCS)HyCloneSV30014.04to supplement complete medium and FWB
GlutaMAXGibco35050to supplement complete medium
2-mercaptoethanol (2-ME)MP Biomedical190242to supplement complete medium
75 mM Vacuum FilterThermo Scientific156-4045to sterilize complete media
ACK Lysis BufferLonza10-548Eto lyse red blood cell
HBSS bufferCorning21-020-CMto rescue leukocytes after red blood cell lysis
Phosphate Buffered Saline (PBS), Dulbecco'sLonza17-512Fmust be endotoxin free; chilled at 4 °C
35 µm Cell filterFalcon352235to break apart clumps before running through cytometer.
GM-CSFBiosourcePMC2011usable concentration of 10 ng/mL
Tissue cultured treated plateVWR10062-896for bone marrow cells after harvest
Anti-Ly6C, Clone HK1.4Biolegend128018
Anti-CD115, Clone AFS98Tonbo Bioscience20-1152-U100
Anti-CD11c, Clone HL3BD Biosciences557400to differeniate CMP and MoDCs
MoFlo XPD Flow CytometerBeckman CoulterML99030
BD Accuri C6BD Biosciences660517
100% EthanolPharmco-Aaper111000200CSPP
60 mm Petri DishCorning, Inc353002
50 mL Conical tubeVWR21008-242
C57BL/6 MiceThe Jackson Laboratory000664Female; 10-20 weeks old
Biosafety HoodThermo Scientific8354-30-0011
10 mL SyringeBD Biosciences301604
23 G needleBD Biosciences305145
Centrifuge 5810 Reppendorf22625501
FlowJo Software v10BD BiosciencesVersion 10flowjo.com

References

  1. Zhan, Y., Xu, Y., Lew, A. M. The regulation of the development and function of dendritic cell subsets by GM-CSF: more than a hematopoietic growth factor. Mol Immunol. 52, 30-37 (2012).
  2. Zhan, Y., et al. The inflammatory cytokine, GM-CSF, alters the developmental outcome of murine dendritic cells. Eur J Immunol. , (2012).
  3. van de Laar, L., Coffer, P. J., Woltman, A. M. Regulation of dendritic cell development by GM-CSF: molecular control and implications for immune homeostasis and therapy. Blood. 119, 3383-3393 (2012).
  4. Steinman, R. M., Inaba, K. Myeloid dendritic cells. J Leukoc Biol. 66, 205-208 (1999).
  5. Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 176, 1693-1702 (1992).
  6. Steinman, R. M., Pack, M., Inaba, K. Dendritic cell development and maturation. Adv Exp Med Biol. , 1-6 (1997).
  7. Pierre, P., et al. Developmental regulation of MHC class II transport in mouse dendritic cells. Nature. 388, 787-792 (1997).
  8. Steinman, R. M., Witmer-Pack, M., Inaba, K. Dendritic cells: antigen presentation, accessory function and clinical relevance. Adv Exp Med Biol. , 1-9 (1993).
  9. Na, Y. R., Jung, D., Gu, G. J., Seok, S. H. GM-CSF Grown Bone Marrow Derived Cells Are Composed of Phenotypically Different Dendritic Cells and Macrophages. Mol Cells. 39, 734-741 (2016).
  10. Rogers, P. B., Driessnack, M. G., Hiltbold Schwartz, E. Analysis of the developmental stages, kinetics, and phenotypes exhibited by myeloid cells driven by GM-CSF in vitro. PLoS One. 12, e0181985 (2017).
  11. Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42, 1197-1211 (2015).
  12. Alloatti, A., Kotsias, F., Magalhaes, J. G., Amigorena, S. Dendritic cell maturation and cross-presentation: timing matters!. Immunol Rev. 272, 97-108 (2016).
  13. Jakubzick, C. V., Randolph, G. J., Henson, P. M. Monocyte differentiation and antigen-presenting functions. Nat Rev Immunol. 17, 349-362 (2017).
  14. Mbongue, J. C., Nieves, H. A., Torrez, T. W., Langridge, W. H. The Role of Dendritic Cell Maturation in the Induction of Insulin-Dependent Diabetes Mellitus. Frontiers in immunology. 8, 327 (2017).
  15. Shortman, K., Naik, S. H. Steady-state and inflammatory dendritic-cell development. Nat Rev Immunol. 7, 19-30 (2007).
  16. Xu, Y., Zhan, Y., Lew, A. M., Naik, S. H., Kershaw, M. H. Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking. J Immunol. 179, 7577-7584 (2007).
  17. Naik, S. H. Generation of large numbers of pro-DCs and pre-DCs in vitro. Methods Mol Biol. 595, 177-186 (2010).
  18. Nikolic, T., de Bruijn, M. F., Lutz, M. B., Leenen, P. J. Developmental stages of myeloid dendritic cells in mouse bone marrow. Int Immunol. 15, 515-524 (2003).
  19. Hettinger, J., et al. Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor. Nat Immunol. 14, 821-830 (2013).
  20. Fogg, D. K., et al. A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells. Science. 311, 83-87 (2006).
  21. Traver, D., et al. Development of CD8{alpha}-Positive Dendritic Cells from a Common Myeloid Progenitor. Science. 290, 2152-2154 (2000).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

138GM SCFmacrophage

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved