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Resumo

Aqui nós fornecemos um método para identificar e isolar um grande número de GM-CSF dirigido pilhas myeloid usando a classificação de células de alta velocidade. Cinco populações distintas (comuns progenitores mieloides progenitoras granulócitos/macrófagos, monócitos, macrófagos derivados de monócitos e DCs derivados de monócitos) podem ser identificadas com base na expressão Ly6C e CD115.

Resumo

Culturas de derivados de monócitos células dendríticas (moDC) geradas a partir da medula óssea de rato usando colônia Granulócito-macrófago estimulando Factor (GM-CSF) têm sido reconhecidas recentemente para ser mais heterogêneo do que anteriormente apreciado. Essas culturas rotineiramente contêm moDC também derivados de monócitos macrófagos (moMac) e até mesmo alguns menos desenvolvidas células como monócitos. O objetivo do presente protocolo é fornecer um método consistente para identificação e separação dos diversos tipos de célula presentes nestas culturas como desenvolvem, para que suas funções específicas podem ser mais investigadas. A estratégia de classificação apresentada aqui separa células primeiro em quatro populações com base na expressão de Ly6C e CD115, ambos os quais são expressas transitoriamente pelas células desenvolvem-se na cultura de GM-CSF-driven. Essas quatro populações incluem comuns progenitores mieloides ou CMP (Ly6C, CD115), progenitores de granulócitos/macrófagos ou GMP (Ly6C +, CD115-), monócitos (Ly6C +, CD115 +) e macrófagos derivados de monócitos ou moMac (Ly6C-, CD115 +). CD11c também é adicionado para a estratégia de classificação para distinguir duas populações dentro da Ly6C-, CD115-população: CMP (CD11c-) e moDC (CD11c +). Finalmente, duas populações podem distinguir ainda mais dentro da Ly6C-, CD115 + população com base no nível de classe de MHC expressão II. MoMacs express níveis inferiores de MHC-classe II, enquanto um precursor de DC derivados de monócitos (moDP) expressa a maior classe de MHC II. Este método permite o isolamento confiável de várias populações distintas desenvolvente em números suficiente para uma variedade de análises funcionais e do desenvolvimento. Destaca-se uma tal leitura funcional, as diferenciais respostas estes tipos de células a estimulação com Pathogen-Associated padrões moleculares (PAMPs).

Introdução

Cultivo de células de medula murino com a citocina fator de estimular colônia granulócitos-macrófagos (GM-CSF) é amplamente utilizado como um método para gerar células dendríticas derivadas de monócitos (moDC; também conhecido como DC inflamatória) em grande número 1, 2,3,4,5. Estas células têm sido extremamente útil em uma variedade de estudos de células dendríticas (DC) função 6,7,8. Normalmente, estas células de medula murino são cultivadas por 6-8 dias e são então utilizadas para o estudo de células dendríticas função 5. Essas culturas tinham sido consideradas principalmente homogêneas, constituído por uma maioria de moDC diferenciada. Mais recentemente, tornou-se claro que no final deste período de cultura dia 6 – 8, há certamente muitas moDC, bem como um grande subconjunto de macrófagos derivados de monócitos diferenciadas (moMacs) 9,10,11. Nossos próprios estudos estenderam ainda mais estes resultados demonstrando que outros subconjuntos de menos células desenvolvidas, tais como precursores moDC (moDP) e monócitos, permaneçam nas culturas com pouca frequência, mesmo depois de 7 dias 10. Assim, estudos da função de células dendríticas (DC) usando células geradas por este sistema podem refletir as respostas de uma coorte mais ampla de tipos de células que anteriormente apreciado.

Temos aprendido muito com o estudo de GM-CSF-gerado moDC relacionadas com a função destas células em fase final de diferenciação 12,13,14. No entanto, compreendemos significativamente menos sobre o caminho do desenvolvimento destas células, 2,15,16 e de como e quando eles apresentam específicas funções, tais como: capacidade de resposta ao patógeno associado Molecular Padrões (PAMPs), fagocitose, 13, de processamento e apresentação do antígeno e atividade anti-bacteriana. Um protocolo para a isolação de um grande número de progenitores de orientado a Flt3L DC convencionais e precursores tem sido relatado 17. Isolamento dessas populações distintas foi conseguido usando carboxyfluorescein succinimidil éster (CFSE)-manchado de células da medula óssea (para controlar a divisão de células) e cultura em Flt3L por 3 dias. As células foram então depleção de células positivas de linhagem e classificadas em progenitoras e precursor das populações com base na expressão de CD11c 17. Outra abordagem pelo grupo do Leenen para identificar primeiros progenitores de DC na cultura de GM-CSF-driven foi classificar as células com base em CD31 e Ly6C 18. O objetivo inicial era criar um método semelhante para a obtenção de progenitores e precursores de GM-CSF-driven moDC. Devido os tipos de célula específica gerados pelo GM-CSF, adaptamos a abordagem e triagem de estratégia baseada na expressão de moléculas que foram expressas em fases iniciais e posteriores do desenvolvimento. Em última análise, determinámos que Ly6C, CD115 (CSF-1 receptor), e CD11c foram os melhores marcadores para distinguir estas células tipos 10.

Aqui, apresentamos um método para isolamento de células em várias fases distintas de desenvolvimento ao longo da via de diferenciação impulsionada pela GM-CSF: monócito Progenitor mieloide comum (CMP), Granulócito-macrófago Progenitor (GMP), macrófagos derivados de monócitos (MoMac) e monócitos-derivado DC (MoDC). A população de moMac pode ser ainda mais segregada com base no nível de classe de MHC expressão II, revelando um precursor de moDC população (moDP) 10. Nós utilizamos uma célula de alta velocidade de fluorescência-ativado classificação estratégia (FACS) para isolar esses 5 populações com base na expressão de Ly6C, CD115 e CD11c. Em seguida demonstramos o exame dessas células em ensaios funcionais, revelando suas respostas à estimulação PAMP.

Protocolo

Todo o trabalho animal foi aprovado pelo Comitê de uso e Auburn University institucional Cuidado Animal em conformidade com as recomendações descritas no guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório do institutos nacionais da saúde.

1. preparação para coleta de medula óssea

  1. Preparar a mídia completa 250 mL pela adição de uma solução de meio de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado com soro fetal bezerro de 10%, glutamina 2 mM e 50 µM 2-Mercaptoetanol ao topo de uma unidade de balão de vácuo filtro µm 0.22 e aplicar vácuo.
    Nota: O meio completo pode ser armazenado a 4 ° C por até 2 meses.
  2. Prepare a solução de etanol 70% misturando 350 mL de etanol a 100% com 150 mL estéril H2O em um balão de 500 mL.
  3. Conjunto de centrifugação a 4 ° C.
  4. Esterilize pinças, bisturi e tesouras em etanol a 70%.
  5. Usando uma pipeta sorológica, adicione 5 mL de mídia completa para três pratos de Petri 60mm.
  6. Usando uma pipeta sorológica, adicione 30 mL de mídia completa para um tubo cónico de 50 mL.

2. conjunto de células de medula murino

  1. Eutanásia em um rato C57BL/6 por narcose de CO2 em conformidade com as regras estabelecidas pelo 2013 americano veterinária Medical Association (AVMA) orientações sobre a eutanásia.
  2. Remover e tira as patas traseiras.
    1. Saturar as patas traseiras e o tronco com 75% de etanol e faça cortes superficiais através da pele ao redor da articulação do quadril com uma tesoura de tecido curvo. Usando a pinça, puxe com firmeza a pele do quadril para baixo em direção ao tornozelo, revelando o músculo. Use a tesoura para remover o retalho de pele.
    2. Remova a pata traseira inteira cortando o osso logo acima da articulação do fêmur/quadril.
      Nota: Além de esterilizar a área, o etanol vai ajudar no fornecimento de cortes limpos e impedir a contaminando as amostras de cabelo.
    3. Se as pernas vão ser transferidas para um novo local para a colheita de medula óssea, mergulhe os pés nos meios de comunicação completos.
  3. Trabalhando em uma armário de biossegurança estéril, transferi as pernas para um dos pratos de Petri previamente preparado.
  4. Use a tesoura para cortar a apenas abaixo do tornozelo e cuidadosamente Retire o máximo de tecido conjuntivo muscular e elástico quanto possível. Transferi o osso limpo para o segundo prato de Petri preparado.
    Nota: Embora não seja necessário remover todos os músculos, muito tecido restante pode tornar difícil expulsar a medula óssea.
  5. Separe o fêmur, o joelho e a tíbia.
    1. Usando fórceps, segure a perna no joelho e localize a medula.
      Nota: a medula óssea deve ser visível como uma ténue linha vermelha no interior da cavidade óssea na parte superior do fêmur e da tíbia no final.
      1. Usando a tesoura, fazer três cortes como segue.
        1. Corte a tíbia logo acima onde a medula aparece acabar.
        2. Corte logo abaixo da articulação do joelho.
        3. Corte logo acima da articulação do joelho.
        4. Se a articulação do quadril ainda está conectada ao fêmur, corte logo abaixo da articulação do quadril.
      2. Retornar os três fragmentos para o prato de Petri e repita este processo na outra perna.
  6. Irrigue a medula óssea do fêmur e tíbia.
    1. Encha uma seringa de 10 mL com mídia completa do tubo cónico de 50 mL e tampa com agulha 23G.
    2. Segurando o osso com fórceps acima o terceiro prato de Petri preparada, inserir a agulha dentro do canal ósseo e empurre a mídia através de, expulsando as células (que podem surgir como um "plug" intacta ou como vários clusters). Repita até que não mais cor pode ser visto através do osso. Encha a seringa com a mídia, se necessário.
  7. Esmaga as epífises.
    1. Enquanto ainda na segunda placa de Petri, segure o joelho com fórceps e amasse os joelhos com a ponta da seringa. Continue até que as epífises não são mais vermelhos.
  8. Usando a seringa, transferi as células do segundo e terceiro prato de Petri para o tubo de 50 mL. Separação por touceiras suavemente pipetando acima e para baixo. Não tente gerar bolhas. Centrifugar a 250 x g a 4 ° C por 10 min.
  9. Lisar células vermelhas do sangue
    1. Remover o sobrenadante com pipeta sorológica, desalojar pelota por agredir e lyse pilhas de sangue vermelhas incubando em 1 mL de tampão de Lise ACK (amónio-cloreto-potássio) por 1 min à temperatura ambiente.
    2. Usando uma pipeta sorológica, adicione 40 mL de tampão HBSS (Hanks equilibrada solução salina).
  10. Usando uma pipeta sorológica, filtre as células embora um coador de célula 70 µm para um novo tubo cónico de 50 mL. Centrifugar a 250 x g a 4 ° C por 10 min.
  11. Usando uma pipeta sorológica, remova o sobrenadante e lavar as células com 40 mL de mídia completa. Centrifugar a 250 x g a 4 ° C por 10 min.
    Nota: Nesta fase, linfócitos positivos de linhagem podem ser removidos por FACS ou purificação magnética da coluna. No entanto, linfócitos não são mantidos a longo prazo em cultura. Embora um grande número de células de linhagem positivas está presente na Ly6C-CD115-população em medula óssea ex vivo, quase todos estão ausentes por dia 5 (Figura 2).
  12. Usando uma pipeta sorológica, remover o sobrenadante e cultura de células da medula óssea na mídia completa com 10 ng/mL de recombinação mouse GM-CSF em uma densidade de 1 x 106 células/mL.
    Nota: Normalmente, 4 x 107 células total podem ser colhidas após a lise de células vermelhas do sangue. No entanto, esperar que tão pouco como 2 x 107 para iniciantes e até de 5 x 107 células para colheitadeiras experientes.
  13. Usando uma pipeta sorológica, transferir as células para placas de cultura de tecidos e incubar a 37 ° C em 5% CO2. Se usando uma placa de 24, cada semente bem com 2 mL de suspensão de células.
  14. Todos os 48 h, use uma pipeta sorológica para remover metade dos meios de comunicação e substituir com mídia completa fresca e GM-CSF.
    Nota: Culturas podem ser mantidas de 9 dias. No entanto, a composição muda ao longo do tempo. Obter mais informações, consulte a secção 3.

3. escolha o dia de sorte

  1. Como composições de população celular mudam ao longo do tempo, selecione um dia que produz o maior número de células desejados.
  2. Consulte a tabela 1 para o tipo de post de rendimento esperado de célula para cada uma das populações depois de 3, 5 e 7 dias de cultura em GM-CSF por 1 x 107 células.

4. estratégia de coloração

  1. Use pequenas alíquotas de células para preparar amostras de controle. Incluir um controle imaculado, amostras de controlo de compensação manchados com somente um anticorpo fluorescente cada, e fluorescência-menos-um controla no quais todos os anticorpos são adicionados exceto um, para controle de fluorescência específico em que canal. Se usando rotulagem indirecta, incluem primário secundário sozinho, sozinho e tanto primário e secundário.
    Nota: Ficoeritrina (PE) e allophycocyanin (APC) com a tag anticorpos fornecem separação distinta com sangramento mínimo sobre de quando usados juntos. No entanto, se o fluorocromo opções são limitadas, CD115 é expresso em um nível relativamente baixo, enquanto Ly6C é expressa em níveis muito elevados. Portanto, fluorochromes mais brilhantes são desejáveis para anti-CD115 e anti-Ly6C fluorochromes são escolhidos para evitar sangramento.
  2. Preparar 100 mL de tampão de lavagem FACS (FWB) misturando 97 mL de solução salina de tampão fosfato de Dulbecco refrigerados (DPBS) com 3 mL de soro de vitela fetal em um tubo cónico de 50 mL e coloque num banho de gelo.
  3. Use uma pipeta para suavemente, mas completamente, pipetar células acima e para baixo para desalojar qualquer células frouxamente aderentes.
  4. Usando uma pipeta sorológica, transferi as células para um tubo cónico de 50 mL. Centrifugar a 250 x g a 4 ° C por 10 min.
    1. Se o volume celular excede 50 mL, transferir células para o número necessário de tubos e combinar no passo coloração.
  5. Delicadamente decantar o sobrenadante e lavar as células peletizadas adicionando 30ml de FWB com uma pipeta sorológica. Centrifugar a 250 x g a 4 ° C por 10 min e repita a lavagem.
    Nota: Se a morte celular alta é esperada, as células podem ser lavadas com FWB com tão baixo quanto 0,5% de soro de vitela fetal (FCS). Isso impedirá que a aglutinação de células.
  6. Suspender e mancha células as instruções do fabricante do anticorpo.
    1. Suspender a 5 x 107 células em 1 mL de FWB e adicionar 2 µ g cada de anti-Ly6C e anti-CD115 rotulado com o fluorophores (de escolha do pesquisador). Para distinguir CMP moDC (ambos são Ly6C - e CD115-), adicionar 2 µ g de anticorpos anti-CD11c (CMP são CD11c–; moDC são CD11c+). Incube durante 30 min no gelo.
      Nota: Figura 3 foi gerado usando o Ly6C-PE e CD115-APC.
  7. Usando uma pipeta sorológica, adicione 10 mL de FWB e centrifugar a 250 x g a 4 ° C por 10 min.
  8. Delicadamente decantar o sobrenadante e lavar as células peletizadas adicionando 30ml de FWB com uma pipeta sorológica. Centrifugar a 250 x g a 4 ° C por 10 min e repita a lavagem.
  9. Antes de suspender as células, agite o tubo cuidadosamente para desalojar a pelota. Use uma pipeta sorológica para suspender as células em 1 x 107 células/mL de FWB e filtrar através de filtro de célula de 35 µm. Use uma pipeta sorológica para transferir células filtradas em tubo de polipropileno e colocar no gelo até que esteja pronto para classificar.
    Nota: Se não estiver disponível no polipropileno, tubos de poliestireno revestido de proteína (leite seco desnatado ou FCS) podem ser usados para reduzir a ligação.

5. definir portas com base em amostras de controlo de

Nota: Para evitar o rompimento da pilha devido à pressão do fluxo de alta velocidade de fluxo, use um 100 – 130 µm bocal para classificação de célula.

  1. Executar o controle imaculado (consulte a etapa 4.1) através do classificador da pilha e aplicar um portão para excluir pequenos detritos (baixa dispersão para a frente; FSC) e altamente granular (dispersão de lado de alta; Partículas de CCD).
    1. Para analisar apenas os estagios (monócitos, moMac/MoDP e MoDC), aplica gating para incluir apenas células maiores (FSC alta).
    2. Se as manchas de viabilidade estão sendo usadas, usá-los para excluir os eventos manchados, inviáveis (um exemplo é ilustrado na Figura 1).
  2. Executar os exemplos de controle único fluorescente através do classificador da pilha e ajuste a compensação conforme necessário.
  3. Execute uma amostra da amostra multi-rotulados. Observar quatro populações distintas: Ly6C + CD115-(GMPs), Ly6C + CD115 + (monócitos), Ly6C-CD115 + (moMacs/moDP) e Ly6C-CD115 - (CMPs/moDCs). Aplica um portão para isolar cada uma das quatro grandes populações.
    Nota: CMPs e moDC compartilham o Ly6C-CD115-fenótipo. No entanto, eles podem ser diferenciados com base na expressão de CD11c: CMP falta CD11c, Considerando que MoDCs express CD11c.

6. coleção de populações isoladas

  1. Prepare os tubos para colheita, acrescentando bastante FCS para atingir pelo menos 20% concentração final quando estiver cheia. Por exemplo, se usar tubos de 5 mL, adicionar 1 mL de FCS antes de classificação e remover o tubo quando ele atinge o volume total de 5 mL.
  2. Para evitar a absorção de volume de negócios e anticorpo de membrana, manter todas as amostras (misturado e classificados) a 4 ° C em todo o tipo.
    1. Se isto não for possível, mantenha o tubo contendo as células para ser classificado no gelo, tanto quanto possível e transferir alíquotas para o classificador, conforme necessário.
    2. Além disso, amostras de transferência classificada a cada 20-30 minutos de gelo.
  3. Depois o número desejado de células foram recolhido, use uma pipeta sorológica para transferir as células para um novo tubo cónico. Centrifugar a 250 x g a 4 ° C por 10 min.
    1. Confirme a pureza com análise pós-tipo em pequenas alíquotas de cada população coletada.
  4. Remover o sobrenadante, suspensão em 10 mL de FWB e centrifugar 250 x g a 4 ° C por 10 min. repetir para um total de duas lavagens.
    Nota: Pode ser difícil de remover todo o sobrenadante sem desalojar a pelota. Anexar uma ponta da pipeta para uma linha de vácuo pode ajudar com a remoção. Se este não estiver disponível, sugere-se que o sobrenadante ser coletado em um tubo fresco em caso de dissociação da pelota.
  5. Remova o sobrenadante após a segunda lavagem.
  6. Se o desenho experimental do usuário dita as células re-ser cultivadas, siga os passos 2.12 – 2.14. Caso contrário, se as células serão utilizadas para análise imediata, prepare células de acordo com o protocolo desejado.
    Nota: Um exemplo de análise funcional típico é incluído na Figura 4.

Resultados

Em um esforço para manter tantos canais disponíveis para análise como células viáveis, possíveis rotineiramente foram selecionados com base na dispersão para a frente e lateral, excluindo eventos muito pequenos e muito granulares (um portão típico é aplicado a todos o ponto parcelas na figura 1A). Para determinar se esta estratégia associada confiantemente excluído as células mortas, nós manchada com o 7-Amino actinomicina D (7-AAD) (

Discussão

Este protocolo facilita o isolamento de GM-CSF-driven progenitor e precursor tipos de células em número suficiente para vários tipos de análises, incluindo ensaios bioquímicos, ensaios de função celular em vitro, ou instilação em vivo. Este método representa um avanço significativo no campo do desenvolvimento de células dendríticas derivadas de monócitos, permitindo o isolamento confiável e identificação de células no início deste caminho do desenvolvimento, bem como os tipos de célu...

Divulgações

Os autores não têm nenhum conflito para divulgar.

Agradecimentos

Somos gratos pela assistência técnica da Alison Igreja pássaro em Auburn Universidade escola de medicina veterinária Flow Cytometry instalação de, para financiamento do NIH de EHS R15 R15 AI107773 e para o celular e o programa de Biologia Molecular na Universidade de Auburn para o verão de financiamento da investigação ao PBR.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
RPMI 1640Corning15-040-CV
Fetal Calf Serum (FCS)HyCloneSV30014.04to supplement complete medium and FWB
GlutaMAXGibco35050to supplement complete medium
2-mercaptoethanol (2-ME)MP Biomedical190242to supplement complete medium
75 mM Vacuum FilterThermo Scientific156-4045to sterilize complete media
ACK Lysis BufferLonza10-548Eto lyse red blood cell
HBSS bufferCorning21-020-CMto rescue leukocytes after red blood cell lysis
Phosphate Buffered Saline (PBS), Dulbecco'sLonza17-512Fmust be endotoxin free; chilled at 4 °C
35 µm Cell filterFalcon352235to break apart clumps before running through cytometer.
GM-CSFBiosourcePMC2011usable concentration of 10 ng/mL
Tissue cultured treated plateVWR10062-896for bone marrow cells after harvest
Anti-Ly6C, Clone HK1.4Biolegend128018
Anti-CD115, Clone AFS98Tonbo Bioscience20-1152-U100
Anti-CD11c, Clone HL3BD Biosciences557400to differeniate CMP and MoDCs
MoFlo XPD Flow CytometerBeckman CoulterML99030
BD Accuri C6BD Biosciences660517
100% EthanolPharmco-Aaper111000200CSPP
60 mm Petri DishCorning, Inc353002
50 mL Conical tubeVWR21008-242
C57BL/6 MiceThe Jackson Laboratory000664Female; 10-20 weeks old
Biosafety HoodThermo Scientific8354-30-0011
10 mL SyringeBD Biosciences301604
23 G needleBD Biosciences305145
Centrifuge 5810 Reppendorf22625501
FlowJo Software v10BD BiosciencesVersion 10flowjo.com

Referências

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