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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui forniamo un metodo per identificare e isolare un numero elevato di GM-CSF guidato cellule mieloidi utilizzando l'ordinamento delle cellule ad alta velocità. Cinque popolazioni distinte (comune dei progenitori mieloidi, progenitori del granulocita/macrofago, monociti, macrofagi monocito-derivati e DCs monocito-derivato) possono essere identificati sulla base di Ly6C e CD115 espressione.

Abstract

Colture di cellule dentritiche monocito-derivate (moDC) generate dal midollo osseo di topo usando fattore stimolante della Colonia del Granulocyte-macrofago (GM-CSF) recentemente sono stati riconosciuti per essere più eterogeneo quanto precedentemente apprezzato. Queste culture contengono ordinariamente moDC pure monocito-derivate macrofagi (moMac) e anche alcune cellule meno sviluppate come monociti. L'obiettivo del presente protocollo è quello di fornire un metodo coerente per l'identificazione e la separazione tra i molti tipi di cellule presenti in queste culture come si sviluppano, in modo che loro specifiche funzioni possono essere ulteriormente approfonditi. L'ordinamento strategia presentata qui separa cellule in primo luogo in quattro popolazioni basati sull'espressione di Ly6C e CD115, entrambi i quali sono espressi transitoriamente dalle cellule come si sviluppano nella cultura di GM-CSF-guidato. Questi quattro popolazioni includono comuni dei progenitori mieloidi o CMP (Ly6C-, CD115-), dei progenitori del granulocita/macrofago o GMP (Ly6C +, CD115-), monociti (Ly6C +, CD115 +) e macrofagi monocito-derivati o moMac (Ly6C-, CD115 +). CD11c viene aggiunto anche alla strategia di ordinamento per distinguere due popolazioni entro il Ly6C-, CD115-popolazione: CMP (CD11c-) e moDC (CD11c +). Infine, due popolazioni possono essere ulteriormente distinto all'interno del Ly6C-, CD115 + popolazione sulla base del livello di espressione II MHC di classe. MoMacs esprimere livelli più bassi di MHC di classe II, mentre un precursore di DC monocito-derivate (moDP) esprime maggiore MHC di classe II. Questo metodo consente l'isolamento affidabile delle diverse popolazioni inerente allo sviluppo distinte nei numeri sufficiente per una varietà di analisi funzionale e sviluppo. Evidenziamo una tale lettura funzionale, le risposte differenziali di questi tipi di cellule alla stimolazione con Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs).

Introduzione

Coltura delle cellule del midollo osseo murino con la citochina fattore stimolante della Colonia del Granulocyte-macrofago (GM-CSF) è ampiamente usato come un metodo per generare cellule dentritiche monocito-derivate (moDC; anche conosciuto come infiammatorie DC) in gran numero 1, 2,3,4,5. Queste cellule sono stati estremamente utili in una varietà di studi di cellule dendritiche (DC) funzione 6,7,8. In genere, queste cellule del midollo osseo murino sono coltivate per 6-8 giorni e vengono quindi utilizzate per lo studio di cellule dendritiche funzione 5. Queste culture erano stato a lungo considerate per lo più omogenee, costituito da una maggioranza di moDC differenziato. Più recentemente, è diventato chiaro che alla fine di questo periodo di cultura di 6 – 8 giorni, ci sono infatti molti moDC, come pure un grande sottoinsieme di macrofagi monocito-derivati differenziati (moMacs) 9,10,11. Nostri studi hanno esteso ulteriormente questi risultati dimostrando che altri sottoinsiemi di meno cellule sviluppate, quali precursori moDC (moDP) e monociti, rimangono nelle culture a bassa frequenza anche dopo 7 giorni 10. Così, gli studi di funzione di cellule dendritiche (DC) utilizzando le cellule generate da questo sistema potrebbero riflettere le risposte di una coorte più ampia di tipi di cellule che precedentemente apprezzato.

Abbiamo imparato molto dallo studio di GM-CSF-generato moDC relativa alla funzione di queste cellule nelle fasi finali di differenziazione 12,13,14. Tuttavia, ci rendiamo conto significativamente meno circa la via dello sviluppo di queste cellule 2,15,16 e di come e quando essi presentano specifiche funzioni come: la risposta di Pathogen Associated Molecular Modelli (PAMPs), fagocitosi, antigene elaborazione e presentazione 13e attività anti-batterica. Un protocollo per l'isolamento di un gran numero di convenzionali basate su Flt3L DC progenitori e precursori è stato segnalato 17. Isolamento di queste popolazioni distinte è stata ottenuta utilizzando carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-macchiato le cellule del midollo osseo (per tenere traccia di divisione delle cellule) e la cultura in Flt3L per 3 giorni. Le cellule erano quindi impoverite di cellule positive linage e ordinate in popolazioni progenitore e precursore basati su CD11c espressione 17. Un altro approccio di gruppo di vittoria per identificare i primi progenitori di DC in GM-CSF-driven cultura doveva ordinare celle basate su CD31 e Ly6C 18. L'obiettivo iniziale era quello di creare un metodo simile per l'ottenimento dei progenitori e precursori di GM-CSF-driven moDC. A causa dei tipi cellulari specifici generati da GM-CSF, abbiamo adattato l'approccio e l'ordinamento di strategia basata sull'espressione di molecole che sono state espresse alle fasi iniziali e successive di sviluppo. Abbiamo determinato in ultima analisi, che Ly6C, CD115 (recettore CSF-1), e CD11c erano i migliori marcatori per distinguere queste cellule tipi 10.

Qui, presentiamo un metodo per l'isolamento delle cellule alle diverse fasi di sviluppo lungo la via della differenziazione guidato da GM-CSF: monocito progenitore mieloide comune (CMP), progenitore del Granulocyte-macrofago (GMP), dei macrofagi monocito-derivati (MoMac) e monocito-derivate DC (MoDC). La popolazione di moMac possa essere ulteriormente suddivise basata sul livello di MHC classe espressione II, rivelando un moDC precursore della popolazione (moDP) 10. Utilizziamo una cella ad alta velocità di fluorescenza-attivato l'ordinamento di strategia (FACS) per isolare questi 5 popolazioni basate sull'espressione di Ly6C e CD115 CD11c. Dimostriamo quindi l'esame di queste cellule in saggi funzionali, rivelando le loro risposte alla stimolazione di PAMP.

Protocollo

Tutto il lavoro animale è stato approvato dal comitato di uso e Auburn University istituzionale Animal Care in conformità con le raccomandazioni descritte nella Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health.

1. preparazione per la raccolta del midollo osseo

  1. Preparare il supporto completo di 250 mL aggiungendo una soluzione di medium di Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 supplementato con 10% siero fetale del vitello, la glutamina 2mm e 50 µM 2-mercaptoetanolo alla parte superiore di un'unità di boccetta di 0,22 µm filtro del vuoto e applicare il vuoto.
    Nota: Terreno completo possa essere memorizzato a 4 ° C fino a 2 mesi.
  2. Preparare soluzione di etanolo 70% con 350 mL di etanolo al 100% con 150 mL sterile H2O in una beuta da 500 mL.
  3. Set centrifuga a 4 ° C.
  4. Sterilizzare pinze, bisturi e forbici in etanolo al 70%.
  5. Utilizzando una pipetta sierologica, aggiungere 5 mL di multimediale completo a tre piastre di Petri da 60 mm.
  6. Utilizzando una pipetta sierologica, aggiungere 30 mL di multimediale completo di una provetta conica da 50 mL.

2. raccolta di cellule del midollo osseo murino

  1. Eutanasia un mouse C57BL/6 di CO2 narcosi secondo le regole stabilite dalle linee guida della associazione medica veterinaria americana (AVMA) del 2013 sull'eutanasia.
  2. Rimuovere e zampe posteriori della striscia.
    1. Saturare le zampe posteriori e il torso con etanolo al 75% e fare tagli poco profondi attraverso la pelle intorno all'articolazione dell'anca con le forbici curve del tessuto. Usando il forcipe, tirare con forza la pelle dal fianco verso il basso verso la caviglia, rivelando il muscolo. Usare le forbici per rimuovere il lembo di pelle.
    2. Rimuovere il piedino posteriore intero tagliando attraverso l'osso appena sopra il femore/anca.
      Nota: Oltre alla sterilizzazione della zona, l'etanolo sarà di aiuto nel fornire tagli puliti e impedire che capelli contaminare i campioni.
    3. Se le gambe saranno trasferite in una nuova posizione per la raccolta del midollo osseo, immergere le gambe in completa per i media.
  3. Lavorando in una cappa di biosicurezza sterile, trasferire le gambe a uno dei piatti Petri precedentemente preparato.
  4. Usare le forbici per tagliare appena sotto la caviglia e attentamente rimuovere tanto del tessuto connettivo del muscolo ed elastico come possibile. Trasferire l'osso pulito di Petri preparate secondo.
    Nota: Anche se non è necessario rimuovere tutti i muscoli, troppo tessuto rimanente può rendere difficile scovare il midollo osseo.
  5. Separare il femore, ginocchio e tibia.
    1. Usando il forcipe, tenere la gamba al ginocchio e individuare il midollo.
      Nota: il midollo osseo dovrebbe essere visibile come una sottile linea rossa all'interno della cavità dell'osso nella parte superiore del femore e verso la fine della tibia.
      1. Utilizzando le forbici, fare tre tagli come segue.
        1. Tagliare la tibia appena sopra dove il midollo viene visualizzata alla fine.
        2. Tagliare appena sotto l'articolazione del ginocchio.
        3. Taglio appena sopra l'articolazione del ginocchio.
        4. Nel caso in cui l'articolazione dell'anca è ancora collegato al femore, tagliare appena sotto l'articolazione dell'anca.
      2. Tornare i tre frammenti di Petri e ripetere questa procedura su altro braccio.
  6. A livello del midollo osseo dal femore e la tibia.
    1. Riempire una siringa da 10 mL con completo supporto dalla provetta conica da 50 mL e tappo con ago 23G.
    2. Tenendo l'osso con forcipe sopra il terzo piatto di Petri preparato, inserire l'ago nel canale osseo e spingere media attraverso, vampate di calore fuori le cellule (che possono emergere come una "spina" intatta o come diversi cluster). Ripetere fino a quando nessun altro colore può essere visto attraverso l'osso. Riempire la siringa con media come necessario.
  7. Schiacciare l'epifisi.
    1. Mentre ancora la seconda capsula di Petri, tenere saldamente la protezione del ginocchio con il forcipe in poltiglia le ginocchia con la punta della siringa. Continuare fino a quando l'epifisi non sono più rosso.
  8. Usando la siringa, trasferire le cellule da di Petri seconda e la terza per il tubo da 50 mL. Rottura a ciuffi pipettando delicatamente su e giù. Cercate di non generare bolle. Centrifuga a 250 x g a 4 ° C per 10 min.
  9. Lisare cellule rosse del sangue
    1. Rimuovere il surnatante con una pipetta sierologica, sloggiare pellet scorrendo e lisare cellule di anima rosse incubando in 1 mL di tampone di lisi ACK (ammonio-cloruro-potassio) per 1 min a temperatura ambiente.
    2. Utilizzando una pipetta sierologica, aggiungere 40 mL di tampone HBSS (soluzione salina bilanciata Hanks).
  10. Utilizzando una pipetta sierologica, filtrare le cellule anche se un colino di cella 70 µm in una nuova provetta conica 50 mL. Centrifuga a 250 x g a 4 ° C per 10 min.
  11. Utilizzando una pipetta sierologica, rimuovere il surnatante e lavare le cellule con 40 mL di completa per i media. Centrifuga a 250 x g a 4 ° C per 10 min.
    Nota: In questa fase, linfociti positivi lignaggio possono essere rimosso da FACS o purificazione colonna magnetica. Tuttavia, i linfociti non vengono mantenuti a lungo termine nella cultura. Anche se un gran numero di cellule positive lignaggio è presente nella Ly6C-CD115-popolazione in midollo osseo ex vivo, quasi tutti sono assenti dal giorno 5 (Figura 2).
  12. Utilizzando una pipetta sierologica, rimuovere il supernatante e coltura di cellule del midollo osseo in multimediale completo con 10 ng/mL del mouse ricombinante GM-CSF ad una densità di 1 x 106 cellule/mL.
    Nota: In genere, 4 x 107 cellule totali possono essere raccolto dopo la lisi delle cellule di anima rosse. Tuttavia, si aspettano appena 2 x 107 per i principianti e fino a 5 x 107 cellule per Mietitrebbie per esperti.
  13. Utilizzando una pipetta sierologica, trasferire le cellule alle piastre di coltura del tessuto e incubare a 37 ° C in 5% CO2. Se utilizzando una piastra a 24 pozzetti, sementi ogni bene con 2 mL di sospensione cellulare.
  14. Ogni 48 h, utilizzare una pipetta sierologica per rimuovere la metà dei media e sostituire con fresco multimediale completo e GM-CSF.
    Nota: Le culture possono essere conservate fino a 9 giorni. Tuttavia, la composizione cambia nel tempo. Per ulteriori informazioni, vedere la sezione 3.

3. scegliere il giorno di sorta

  1. Composizioni di popolazione delle cellule variano nel tempo, selezionare un giorno che produce il maggior numero di celle desiderate.
  2. Vedi tabella 1 per l'ordinamento di post di rendimento cella prevista per ciascuna delle popolazioni dopo 3, 5 e 7 giorni di cultura in GM-CSF per 1 x 107 cellule.

4. strategia di colorazione

  1. Utilizzare piccole aliquote di cellule per preparare campioni di controllo. Includere un controllo non macchia, campioni di controllo di compensazione macchiati con un solo anticorpo fluorescente ciascuno, e fluorescenza-minus-one controlla in quali tutti gli anticorpi vengono aggiunti tranne uno, al controllo per fluorescenza aspecifica in quel canale. Se usando etichettatura indiretta, includono primaria secondaria da solo, da solo e sia primario e secondario.
    Nota: Ficoeritrina (PE) e gli anticorpi allophycocyanin (APC) etichettate forniscono distinta separazione con spurgo minimo sopra quando utilizzati insieme. Tuttavia, se fluorocromo opzioni sono limitate, CD115 è espresso ad un livello relativamente basso, mentre Ly6C è espressa a livelli molto elevati. Pertanto, più luminosi fluorocromi sono desiderabili per anti-CD115 e anti-Ly6C fluorocromi sono scelti per evitare sanguinare sopra.
  2. Preparare 100 mL di FACS Wash Buffer (FWB) mescolando 97 mL di soluzione fisiologica tamponata con fosfato di Dulbecco refrigerati (DPBS) con 3 mL di siero fetale di vitello in una provetta conica da 50 mL e mettere in un bagno di ghiaccio.
  3. Utilizzare una pipetta per delicatamente, ma a fondo, pipettare cellule su e giù per rimuovere eventuali cellule senza bloccare aderenti.
  4. Utilizzando una pipetta sierologica, trasferire le cellule in una provetta conica da 50 mL. Centrifuga a 250 x g a 4 ° C per 10 min.
    1. Se il volume delle cellule supera i 50 mL, trasferire cellule il numero necessario di provette e combinare nella fase di colorazione.
  5. Delicatamente versare il sovranatante e lavare le cellule pellettate aggiungere 30 mL di FWB con una pipetta sierologica. Centrifugare a 250 x g a 4 ° C per 10 min e ripetere il lavaggio.
    Nota: Se si prevede che la morte delle cellule di alta, le cellule possono essere lavate con FWB con à partir de 0,5% siero fetale di vitello (FCS). Ciò impedirà di agglutinamento delle cellule.
  6. Sospendere e macchia cellule per le istruzioni del produttore dell'anticorpo.
    1. Sospendere 5 x 107 cellule in 1 mL di FWB e aggiungere 2 µ g di anti-Ly6C e anti-CD115 etichettati con fluorofori (a scelta del ricercatore). Per distinguere ulteriormente CMP da moDC (entrambi sono Ly6C - e CD115-), aggiungere 2 µ g di anticorpi anti-CD11c (CMP sono CD11c-; moDC sono CD11c+). Incubare per 30 min in ghiaccio.
      Nota: Nella figura 3 è stato generato utilizzando Ly6C-PE e CD115-APC.
  7. Utilizzando una pipetta sierologica, aggiungere 10 mL di FWB e centrifugare a 250 x g a 4 ° C per 10 min.
  8. Delicatamente versare il sovranatante e lavare le cellule pellettate aggiungere 30 mL di FWB con una pipetta sierologica. Centrifugare a 250 x g a 4 ° C per 10 min e ripetere il lavaggio.
  9. Prima di sospendere le cellule, scatti la provetta accuratamente per sloggiare il pellet. Utilizzare una pipetta sierologica per sospendere le cellule a 1 x 107 cellule/mL di FWB e filtrare su filtro cella 35-µm. Utilizzare una pipetta sierologica per trasferire filtrate cellule in provetta in polipropilene e metterli su ghiaccio fino al momento di ordinare.
    Nota: Se non è disponibile in polipropilene, provette di polistirene di proteina rivestita (latte in polvere senza grassi o FCS) possono essere usati per ridurre associazione.

5. impostare porte sulla base di campioni di controllo

Nota: Per evitare la rottura delle cellule a causa della pressione del flusso flusso ad alta velocità, utilizzare un ugello di 100 – 130 µm per l'ordinamento delle cellule.

  1. Eseguire il controllo senza macchia (Vedi punto 4.1) attraverso il classificatore celle e applicare un cancello per escludere piccoli detriti (minore dispersione avanti; FSC) e altamente granulare (dispersione di high-side; Particelle SSC).
    1. Per analizzare solo gli stadi (monociti, moMac/MoDP e MoDC), applicare gating per includere solo le più grandi cellule (alta FSC).
    2. Se vengono utilizzate attuabilità macchie, utilizzare questi per escludere eventi macchiati, non vitali (un esempio è illustrato nella Figura 1).
  2. Eseguire gli esempi di singolo controllo fluorescente attraverso il classificatore celle e regolare la compensazione come necessario.
  3. Eseguire un campione del campione multi-etichettati. Osservare quattro popolazioni distinte: Ly6C + CD115-(GMP), Ly6C + CD115 + (monociti), Ly6C-CD115 + (moMacs/moDP) e Ly6C-CD115 - (CMPs/MoDC). Applicare un cancello per isolare ciascuna delle quattro principali popolazioni.
    Nota: CMPs e moDC condividono il Ly6C-CD115-fenotipo. Tuttavia, possono essere differenziati basato sull'espressione di CD11c: CMP mancanza CD11c, mentre MoDC esprimono CD11c.

6. raccolta di popolazioni isolate

  1. Preparare le provette di raccolta aggiungendo abbastanza FCS per raggiungere almeno il 20% concentrazione finale quando è pieno. Ad esempio, se utilizzando provette da 5 mL, aggiungere 1 mL di FCS prima dell'ordinamento e rimuovere il tubo quando raggiunge 5 mL di volume totale.
  2. Per evitare l'assorbimento di fatturato e dell'anticorpo di membrana, è possibile mantenere tutti i campioni (misto e ordinati) a 4 ° C in tutta la specie.
    1. Se questo non è possibile, mantenere la provetta contenente le cellule per essere ordinato su ghiaccio per quanto possibile e trasferire il sorter aliquote secondo le necessità.
    2. Inoltre, campioni di trasferimento ordinato per ghiaccio ogni 20 – 30 min.
  3. Dopo il numero desiderato di cellule è state raccolte, è possibile utilizzare una pipetta sierologica per trasferire le cellule ad un nuovo tubo conico. Centrifuga a 250 x g a 4 ° C per 10 min.
    1. Confermare la purezza con analisi post-ordinamento su piccole aliquote da ogni popolazione raccolti.
  4. Eliminare il surnatante, sospendere in 10 mL di FWB e centrifugare a 250 x g a 4 ° C per 10 min. Ripetere per un totale di due lavaggi.
    Nota: Può essere difficile da rimuovere tutto il supernatante senza sloggiare il pellet. Allegando un puntale una linea del vuoto può aiutare con la rimozione. Se questo non è disponibile, è suggerito che il surnatante raccolti in una nuova provetta in caso di dissociazione di pellet.
  5. Rimuovere il supernatante dopo il secondo lavaggio.
  6. Se il disegno sperimentale dell'utente detta nuovamente le cellule coltivate, passaggi 2.12 – 2,14. In caso contrario, se le cellule verranno utilizzate per l'analisi immediata, preparare cellule secondo protocollo desiderato.
    Nota: Un esempio di analisi funzionale tipica è incluso nella Figura 4.

Risultati

Nel tentativo di mantenere il numero di canali disponibili per l'analisi come possibile, celle possibili sono stati selezionati ordinariamente basato su dispersione avanti e laterali, escluse eventi molto piccoli e molto granulari (un tipico cancello viene applicato a tutti il punto appezzamenti in Figura 1A). Per determinare se questa strategia di gating escluso in modo affidabile le cellule morte, abbiamo macchiato con 7-Amino actinomicina D (7-AAD) (

Discussione

Questo protocollo facilita l'isolamento di tipi GM-CSF-driven progenitore e precursore delle cellule in numero sufficiente per diversi tipi di analisi tra cui analisi biochimiche, analisi di funzione cellulare in vitroo in vivodi instillazione. Questo metodo rappresenta un significativo passo avanti nel campo dello sviluppo delle cellule dendritiche monocito-derivate, consentendo l'affidabile isolamento e identificazione di cellule presto in questa via di sviluppo, come pure quei tipi di cellula differe...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nessun conflitto di divulgare.

Riconoscimenti

Siamo grati per l'assistenza tecnica da Alison Chiesa uccello alla Auburn University scuola di medicina veterinaria flusso Cytometry Facility, per finanziamenti dal NIH per EHS R15 R15 AI107773 e per il cellulare e il programma di biologia molecolare all'Università di Auburn di estate finanziamento della ricerca di PBR.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
RPMI 1640Corning15-040-CV
Fetal Calf Serum (FCS)HyCloneSV30014.04to supplement complete medium and FWB
GlutaMAXGibco35050to supplement complete medium
2-mercaptoethanol (2-ME)MP Biomedical190242to supplement complete medium
75 mM Vacuum FilterThermo Scientific156-4045to sterilize complete media
ACK Lysis BufferLonza10-548Eto lyse red blood cell
HBSS bufferCorning21-020-CMto rescue leukocytes after red blood cell lysis
Phosphate Buffered Saline (PBS), Dulbecco'sLonza17-512Fmust be endotoxin free; chilled at 4 °C
35 µm Cell filterFalcon352235to break apart clumps before running through cytometer.
GM-CSFBiosourcePMC2011usable concentration of 10 ng/mL
Tissue cultured treated plateVWR10062-896for bone marrow cells after harvest
Anti-Ly6C, Clone HK1.4Biolegend128018
Anti-CD115, Clone AFS98Tonbo Bioscience20-1152-U100
Anti-CD11c, Clone HL3BD Biosciences557400to differeniate CMP and MoDCs
MoFlo XPD Flow CytometerBeckman CoulterML99030
BD Accuri C6BD Biosciences660517
100% EthanolPharmco-Aaper111000200CSPP
60 mm Petri DishCorning, Inc353002
50 mL Conical tubeVWR21008-242
C57BL/6 MiceThe Jackson Laboratory000664Female; 10-20 weeks old
Biosafety HoodThermo Scientific8354-30-0011
10 mL SyringeBD Biosciences301604
23 G needleBD Biosciences305145
Centrifuge 5810 Reppendorf22625501
FlowJo Software v10BD BiosciencesVersion 10flowjo.com

Riferimenti

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