JoVE Logo
Autoren
Kontakt

Anmelden

Zum Anzeigen dieser Inhalte ist ein JoVE-Abonnement erforderlich. Melden Sie sich an oder starten Sie Ihre kostenlose Testversion.

In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier bieten wir eine Methode zum Identifizieren und isolieren große Zahlen von GM-CSF myeloische Zellen unter Verwendung von high-Speed Zellsortierung angetrieben. Fünf verschiedene Populationen (gemeinsame myeloischen Vorläuferzellen, Vorläuferzellen der Granulozyten/Makrophagen, Monozyten, Monocyte abgeleitet Makrophagen und Monocyte abgeleitet DCs) können identifiziert werden, basierend auf Ly6C und CD115 Ausdruck.

Zusammenfassung

Kulturen der Monocyte-abgeleitete Dendritische Zellen (MoDC) generiert aus Maus Knochenmark mit Granulozyten-Makrophagen-Kolonie stimulierende Faktor (GM-CSF) haben vor kurzem erkannt worden, heterogener als zuvor geschätzt werden. Diese Kulturen enthalten routinemäßig MoDC sowie Monocyte-abgeleiteten Makrophagen (MoMac) und sogar einige weniger entwickelten Zellen wie Monozyten. Das Ziel dieses Protokolls ist es, bieten eine einheitliche Methode zur Identifizierung und Trennung von den vielen Zelltypen in diesen Kulturen, wie sie sich entwickeln, so dass ihre spezifischen Funktionen weiter untersucht werden können. Die hier vorgestellten sortierungsstrategie trennt Zellen zuerst in vier Populationen basierend auf Ausdruck der Ly6C und CD115, die vorübergehend von Zellen exprimiert werden, wie sie in der GM-CSF-orientierte Kultur zu entwickeln. Diese vier Populationen gehören gemeinsame myeloischen Vorläuferzellen CMP (Ly6C, CD115), Granulozyten/Makrophagen Stammväter oder GMP (Ly6C +, CD115), Monozyten (Ly6C +, CD115 +), und Monocyte-abgeleiteten Makrophagen oder MoMac (Ly6C, CD115 +). CD11c ist auch hinzugefügt, um die Sortierung Strategie, zwei Populationen innerhalb der Ly6C-CD115-Bevölkerung zu unterscheiden: CMP (CD11c-) und MoDC (CD11c +). Zu guter Letzt können zwei Populationen innerhalb der Ly6C-CD115 + Bevölkerung basierend auf der Ebene der MHC-Klasse II Ausdruck weiter unterschieden werden. MoMacs express untere Ebenen der MHC-Klasse II, während ein Monocyte abgeleitet-DC-Vorläufer (MoDP) höheren MHC Klasse II drückt. Diese Methode ermöglicht die sichere Trennung von mehreren Entwicklungsgeschichtlich verschiedene Populationen in Zahlen für eine Vielzahl von Funktions- und Entwicklungsstörungen Analysen ausreichend. Wir zeigen eine solche funktionelle auslesen, die differenzierten Antworten dieser Zelltypen auf Stimulation mit Pathogen-Associated molekulare Muster (PAMPs).

Einleitung

Kultivierung der murinen Knochenmarkzellen mit dem Zytokin ist Granulozyten-Makrophagen-Kolonie stimulierende Faktor (GM-CSF) als eine Methode verbreitet Monocyte-abgeleitete Dendritische Zellen (MoDC; auch bekannt als entzündliche DC) in großer Zahl 1zu generieren, 2,3,4,5. Diese Zellen sind sehr nützlich in einer Vielzahl von Studien von dendritischen Zellen (DC) Funktion 6,7,8gewesen. In der Regel diese murinen Knochenmarkzellen für 6-8 Tage kultiviert werden und dienen dann zur Studie von dendritischen Zellen Funktion 5. Diese Kulturen war lange vor allem homogen, bestehend aus einer Mehrheit von differenzierten MoDC betrachtet worden. Vor kurzem, ist deutlich geworden, dass am Ende dieser 6 – 8 Tage Kultur gibt es in der Tat viele MoDC, sowie einen großen Teil der differenzierten Monocyte abgeleiteten Makrophagen (MoMacs) 9,10,11. Unsere eigenen Studien haben diese Ergebnisse zeigen, dass andere Teilmengen von weniger entwickelten Zellen, wie MoDC Vorstufen (MoDP) und Monozyten, in den Kulturen bei niedriger Frequenz auch nach 7 Tagen 10 bleibenweiter ausgebaut. Somit konnten Studien von dendritischen Zellen (DC)-Funktion, die mit Zellen, die durch dieses System erzeugt die Antworten einer größeren Kohorte von Zelltypen reflektieren, als bisher angenommen.

Wir haben sehr viel gelernt aus der Studie von GM-CSF-generierte MoDC in Bezug auf die Funktion dieser Zellen in der Endphase der Differenzierung 12,13,14. Wir verstehen jedoch deutlich weniger über der Entwicklung weg von diesen Zellen 2,15,16 und des wie und wann sie spezifische weisen Funktionen wie: Reaktionsfähigkeit auf Pathogen Associated Molecular Muster (PAMPs), Phagozytose, Antigen Verarbeitung und Präsentation 13und antibakterielle Aktivität. Ein Protokoll für die Isolierung einer großen Zahl von konventionellen Flt3L angetrieben DC Stammväter und Vorläufer wurde gemeldeten 17. Isolierung von diesen unterschiedlichen Populationen wurde erreicht mit Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CFSE-)-gebeizt Knochenmarkzellen (um teilenden Zellen zu verfolgen) und Kultur in Flt3L für 3 Tage. Zellen wurden aus positiven Zellen erschöpft und in Vorläufer und Wegbereiter Populationen basierend auf CD11c Ausdruck 17sortiert. Ein anderer Ansatz von Leenen Gruppe, frühen Vorfahren der DC in der GM-CSF-orientierte Kultur zu identifizieren war, basierte auf CD31 und Ly6C 18Zellen Sortieren. Das ursprüngliche Ziel war die Schaffung eine ähnliche Methode für den Erhalt der Stammväter und Vorstufen von GM-CSF-orientierte MoDC. Aufgrund der spezifischen Zelltypen von GM-CSF generiert passten wir das Konzept und Sortierung Strategie basierend auf Ausdruck der Moleküle, die in frühen und späteren Phasen der Entwicklung zum Ausdruck gebracht wurden. Wir bestimmt letztlich, Ly6C, CD115 (CSF-1-Rezeptor), und CD11c wurden die besten Marker für diese Zelle Unterscheidung 10Typen.

Hier präsentieren wir eine Methode zur Isolierung von Zellen auf mehrere Phasen der Entwicklung den Weg der Differenzierung, angetrieben von GM-CSF: gemeinsame myeloischen Vorläuferzellen (CMP), Granulozyten-Makrophagen Vorläuferzellen (GMP), Monocyte, Monocyte-abgeleiteten Makrophagen (MoMac) und DC (MoDC) Monocyte-abgeleitet. Die MoMac Bevölkerung kann weitere basierend auf Ebene der MHC-Klasse II Ausdruck getrennt werden enthüllt eine MoDC Vorläufer Bevölkerung (MoDP) 10. Wir nutzen eine High-Speed-Fluoreszenz-aktivierte Zelle Sortieren (FACS) Strategie um diese 5 Populationen anhand der Ausdruck Ly6C, CD115 und CD11c zu isolieren. Wir zeigen dann die Prüfung dieser Zellen im funktionellen Assays enthüllt ihre Reaktionen auf PAMP Stimulation.

Protokoll

Alle tierische Arbeit wurde von der Auburn University institutionelle Animal Care und Nutzung hat in Übereinstimmung mit den Empfehlungen für die Pflege und Verwendung von Labortieren von den National Institutes of Health in der Anleitung aufgeführten genehmigt.

1. Vorbereitung für Knochenmark-Sammlung

  1. Bereiten Sie 250 mL komplette Medien durch Zugabe einer Lösung von Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium mit 10 % fetalen Kälberserum, 2 mM Glutamin und 50 µM 2-Mercaptoethanol an die Spitze einer 0,22 µm Vakuumfilter Kolben Einheit ergänzt, und gelten Sie Vakuum.
    Hinweis: Komplette Medium kann bei 4 ° C bis zu 2 Monaten aufbewahrt werden.
  2. Bereiten Sie 70 % Ethanol Lösung durch Mischen von 350 mL 100 % Ethanol mit 150 mL sterile H2O in eine 500 mL-Flasche.
  3. Set Zentrifuge bis 4 ° C.
  4. Sterilisieren Sie, Pinzette, Skalpell und Schere in 70 % igem Ethanol.
  5. Fügen Sie mithilfe einer serologischen Pipette 5 mL komplette Medien zu drei 60 mm Petrischalen.
  6. Fügen Sie mithilfe einer serologischen Pipette 30 mL komplette Medien in ein 50 mL konische Röhrchen.

2. Sammlung von murinen Knochenmarkzellen

  1. Einschläfern Sie eine C57BL/6-Maus von CO2 Narkose gemäß der Regeln, die 2013 American Veterinary Medical Association (AVMA) Leitlinien zur Euthanasie.
  2. Entfernen Sie und Streifen Sie Hinterbeine.
    1. Sättigen Sie die Hinterbeine und Torso mit 75 % Ethanol und machen Sie flachen Schnitt durch die Haut rund um das Hüftgelenk mit gebogenen Gewebe Schere. Mit Pinzette, fest ziehen Sie die Haut aus der Hüfte nach unten in Richtung Knöchel, offenbart des Muskels. Mit einer Schere um die Hautlappen zu entfernen.
    2. Entfernen Sie das gesamte Hinterbein durch Durchtrennung des Knochens oberhalb des Femur/Hüftgelenks.
      Hinweis: Neben der Sterilisation der Gegend, das Ethanol wird Hilfe bei der Bereitstellung sauberer Schnitten und verhindert, dass Haare Kontamination der Proben.
    3. Wenn die Beine an einen neuen Speicherort für die Knochenmarkentnahme übertragen werden, Tauchen Sie die Beine in komplette Medien.
  3. Arbeiten in einem sterilen Biosafety Schrank, die Beine auf eines der zuvor vorbereiteten Petrischalen übertragen.
  4. Mit einer Schere schneiden Sie die gerade unterhalb des Knöchels und vorsichtig so viel Muskeln und elastische Bindegewebe wie möglich entfernen. Übertragen Sie die gereinigten Knochen auf der zweiten vorbereiteten Petrischale.
    Hinweis: Obwohl es nicht notwendig, den Muskel zu entfernen, kann zu viel verbleibende Gewebe zu spülen, das Knochenmark erschweren.
  5. Trennen Sie die Oberschenkel, Knie und Schienbein.
    1. Mit Pinzette, halten Sie das Bein am Knie und suchen Sie das Knochenmark.
      Hinweis: Knochenmark sollte als eine schwache rote Linie in den Knochenhohlraum an der Spitze des Oberschenkelknochens und gegen Ende des Schienbeins sichtbar sein.
      1. Mit Schere, machen Sie drei Schnitten wie folgt.
        1. Schneiden Sie die Tibia oberhalb wo das Knochenmark zu enden scheint.
        2. Schneiden Sie direkt unterhalb des Kniegelenks.
        3. Schneiden Sie oberhalb des Kniegelenks.
        4. Wenn das Hüftgelenk noch in den Oberschenkelknochen verbunden ist, schneiden Sie direkt unterhalb des Hüftgelenks.
      2. Die drei Fragmente, die Petrischale zurück und wiederholen Sie diesen Vorgang am anderen Bein.
  6. Spülen Sie Knochenmark von Femur und Tibia.
    1. Komplette Medien aus dem 50 mL konische Rohr und Verschluss eine 10 mL Spritze mit Nadel 23 G einfüllen.
    2. Halten Sie die Knochen mit der Pinzette oberhalb der dritten vorbereiteten Petrischale, Stechen Sie die Nadel in den knochenkanal und schieben Sie Medien durch ausspülen der Zellen (die als eine intakte "Stecker" oder als mehrere Cluster auftreten könnten). Wiederholen Sie, bis keine mehr Farbe durch den Knochen gesehen werden kann. Füllen Sie die Spritze mit Medien wie nötig.
  7. Zerdrücken Sie die Epiphysen.
    1. Während noch in der zweiten Petrischale die Kniescheibe mit Zange festhalten, und die Knie mit der Spitze der Spritze Maische. Fortgesetzt, bis die Epiphysen nicht mehr rot sind.
  8. Mit der Spritze, die Zellen aus der zweiten und dritten Petrischale auf der 50 mL Tube übertragen. Trennung von Klumpen durch sanft auf und ab pipettieren. Versuchen Sie nicht, die Bläschen zu erzeugen. Zentrifuge bei 250 X g bei 4 ° C für 10 Minuten.
  9. Lyse der roten Blutkörperchen
    1. Überstand mit serologischen Pipette entfernen, vertreiben Pellets durch streichen und lyse der roten Blutkörperchen durch Inkubation in 1 mL der ACK (Ammonium-Chlorid-Kalium) Lysis Puffer für 1 min bei Raumtemperatur.
    2. Fügen Sie mithilfe einer serologischen Pipette 40 mL HBSS (Hanks ausgewogen Salzlösung) Puffer.
  10. Mit einer serologischen Pipette, Filtern Sie die Zellen zwar ein 70 µm Zelle Sieb in ein neues 50 mL konische Röhrchen. Zentrifuge bei 250 X g bei 4 ° C für 10 Minuten.
  11. Mit einer serologischen Pipette entfernen Sie überstand und waschen Zellen mit 40 mL komplette Medien. Zentrifuge bei 250 X g bei 4 ° C für 10 Minuten.
    Hinweis: In diesem Stadium können Linie positive Lymphozyten durch FACS oder magnetische Spalte Reinigung entfernt werden. Lymphozyten werden jedoch nicht langfristig in Kultur beibehalten. Obwohl eine große Anzahl von Linie positive Zellen in der Ly6C-CD115-Bevölkerung im Knochenmark ex Vivovorhanden sind, fehlen fast alle bis zum Tag 5 (Abbildung 2).
  12. Mit einer serologischen Pipette, Entfernen des Überstands und Kultur die Knochenmarkzellen in komplette Medien mit 10 ng/mL rekombinanter Maus GM-CSF bei einer Dichte von 1 x 106 Zellen/mL.
    Hinweis: In der Regel 4 x 107 total Zellen nach Lyse der roten Blutkörperchen geerntet werden können. Jedoch erwarten, dass so wenig wie 2 x 107 für Anfänger und bis zu 5 x 107 Zellen für erfahrene Erntehelfer.
  13. Mit einer serologischen Pipette, die Zellen auf Gewebekultur Platten übertragen und Inkubation bei 37 ° C in 5 % CO2. Wenn jeder Samen mit einer 24-Well-Platte mit 2 mL Zellsuspension.
  14. Alle 48 h, verwenden einer serologischen Pipette, um Hälfte der Medien zu entfernen und ersetzen Sie durch frische komplette Medien- und GM-CSF.
    Hinweis: Kulturen können bis 9 Tage gehalten werden. Zusammensetzung ändert sich jedoch im Laufe der Zeit. Weitere Informationen finden Sie unter Abschnitt 3.

3. Wahl der Tag Art

  1. Wenn Zelle Bevölkerung Kompositionen im Laufe der Zeit ändern, wählen Sie einen Tag, der die höchste Anzahl der gewünschten Zellen ergibt.
  2. Siehe Tabelle 1 für die erwartete Zelle Ausbeute Post Art für jede der Bevölkerung nach 3, 5 und 7 Tage der Kultur in GM-CSF pro 1 x 107 Zellen.

(4) Färbung Strategie

  1. Verwenden Sie kleine aliquoten Zellen Kontrollproben vorzubereiten. Gehören eine ungefärbte Steuerung, Entschädigung Kontrollproben gebeizt mit jeweils nur eine fluoreszierende Antikörper und Fluoreszenz-Minus-eins steuert, in welcher alle Antikörper mit einer Ausnahme, Steuern für unspezifische Fluoreszenz in diesem Kanal hinzugefügt werden. Wenn mit indirekten Kennzeichnung umfassen primär allein, allein, Sekundär und sowohl primäre als auch sekundäre.
    Hinweis: Phycoerythrin (PE) und Allophycocyanin (APC) getaggt Antikörper bieten klare Trennung mit minimal bluten über, wenn Sie zusammen verwendet. Jedoch wenn Fluorochrom Möglichkeiten begrenzt sind, wird CD115 auf einem relativ niedrigen Niveau ausgedrückt, während Ly6C auf sehr hohem Niveau zum Ausdruck kommt. Daher sind wünschenswert für Anti-CD115, heller Fluorochromes und Anti-Ly6C Fluorochromes werden ausgewählt, um bluten zu verhindern.
  2. Bereiten Sie 100 mL von FACS Wash Buffer (FWB) durch Mischen 97 mL gekühlten Dulbecco Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (DPBS) mit 3 mL fetalen Kälberserum in einem 50 mL konische Röhrchen, und legen Sie in ein Eisbad.
  3. Verwenden Sie eine Pipette, um sanft, aber gründlich, pipette Zellen nach oben und unten, um alle Lose adhärenten Zellen verdrängen.
  4. Mit einer serologischen Pipette, Zellen auf eine 50 mL konische Rohr übertragen. Zentrifuge bei 250 X g bei 4 ° C für 10 Minuten.
    1. Wenn Zelle Volumen 50 mL übersteigt, übertragen Sie Zellen zu, um die notwendige Anzahl von Rohren und bei der Färbung Schritt kombinieren.
  5. Vorsichtig den überstand Gießen Sie ab und waschen Sie die gebeizte Zellen durch Zugabe von 30 mL der FWB mit einer serologischen Pipette. Bei 250 X g bei 4 ° C für 10 min zentrifugieren Sie, und wiederholen Sie die Wäsche.
    Hinweis: Bei hohen Zelltod zu erwarten ist, Zellen können gewaschen mit FWB mit so niedrig wie 0.5 % fetalen Kälberserum (FCS). Dies verhindert Verklumpung der Zelle.
  6. Aussetzen Sie und beflecken Sie Zellen pro Antikörper des Herstellers.
    1. Auszusetzen Sie 5 x 107 Zellen in 1 mL der FWB und fügen Sie 2 µg Anti-Ly6C und Anti-CD115 mit Fluorophore (nach Wahl des Forschers) gekennzeichnet. Um weitere CMP von MoDC unterscheiden (beide sind Ly6C- und CD115-), fügen Sie 2 µg Anti-CD11c Antikörper (CMP sind CD11c-; MoDC sind CD11c+). Inkubieren Sie für 30 min auf Eis.
      Hinweis: Abbildung 3 wurde mit Ly6C-PE und CD115-APC erstellt.
  7. Fügen Sie mithilfe einer serologischen Pipette 10 mL der FWB und Zentrifuge bei 250 X g bei 4 ° C für 10 Minuten.
  8. Vorsichtig den überstand Gießen Sie ab und waschen Sie die gebeizte Zellen durch Zugabe von 30 mL der FWB mit einer serologischen Pipette. Bei 250 X g bei 4 ° C für 10 min zentrifugieren Sie, und wiederholen Sie die Wäsche.
  9. Vor der Aussetzung der Zellen, flick Rohr gründlich, um die Pellets zu verdrängen. Verwenden Sie eine serologische Pipette Zellen 1 x 107 Zellen/ml der FWB auszusetzen, und durch 35 µm Zelle Filter filtern. Verwenden Sie eine serologische Pipette gefilterten Zellen in Polypropylen-Rohr übertragen und auf Eis legen, bis bereit zu sortieren.
    Hinweis: Polypropylen nicht verfügbar ist, können verbindliche reduzieren Protein beschichtet (fettfreie Trockenmilch oder FCS) Polystyrol Rohre verwendet werden.

5. Stellen Sie anhand der Kontrollproben Tore

Hinweis: Um Zellaufschluss durch den Druck des High-Speed-Durchfluss zu verhindern, verwenden Sie eine 100-130 µm Düse für Zellsortierung.

  1. Führen Sie die ungefärbte Kontrolle (siehe Punkt 4.1) durch die Zelle Sorter, und wenden Sie ein Tor um kleine Trümmer (niedrige forward Scatter; auszuschließen FSC) und sehr körnig (high-Side Scatter; SSC) Teilchen.
    1. Um nur den späteren Stadien (Monozyten, MoMac/MoDP und MoDC) zu analysieren, gelten Sie gating um nur größere Zellen (hohe FSC) erweitert.
    2. Wenn Lebensfähigkeit Flecken verwendet werden, verwenden Sie diese gefärbt, nicht lebensfähige Ereignisse ausschließen (ein Beispiel ist in Abbildung 1dargestellt).
  2. Der Cell Sorter einzelne fluoreszierende Kontrollproben durchlaufen, und Entschädigung nach Bedarf anpassen.
  3. Einen Probelauf der Multi-Label-Probe. Vier verschiedene Populationen zu beobachten: Ly6C + CD115-(GVP), Ly6C + CD115 + (Monozyten), Ly6C-CD115 + (MoMacs/MoDP), und Ly6C-CD115 - (CMPs/MoDCs). Wenden Sie ein Tor um jeden der vier großen Populationen zu isolieren.
    Hinweis: CMPs und MoDC teilen den Ly6C-CD115-Phänotyp. Jedoch können sie basierend auf CD11c Ausdruck differenziert werden: CMP fehlt CD11c, während MoDCs CD11c auszudrücken.

6. Erhebung von isolierten Populationen

  1. Bereiten Sie Röhrchen durch Zugabe von genügend FCS um mindestens 20 % zu erreichen Endkonzentration Wenn Sie voll. Beispielsweise wenn Sie 5 mL Röhrchen verwenden, fügen Sie 1 mL FCS vor dem Sortieren und entfernen Sie das Rohr zu, wenn es 5 mL Gesamtvolumen erreicht.
  2. Zur Vermeidung von Membran-Umsatz und Antikörper-Aufnahme halten Sie alle Proben (gemischt und sortiert) bei 4 ° C in der Art.
    1. Wenn dies nicht möglich ist, halten Sie das Rohr mit der Zellen, um Aliquote auf dem Sorter übertragen, je nach Bedarf und auf Eis so viel wie möglich sortiert werden.
    2. Darüber hinaus übertragen Sie sortierte Proben alle 20-30 Minuten zu Eis.
  3. Nachdem die gewünschte Anzahl von Zellen gesammelt wurden, verwenden einer serologischen Pipette, die Zellen auf eine neue konische Rohr übertragen. Zentrifuge bei 250 X g bei 4 ° C für 10 Minuten.
    1. Reinheit mit Post-Art Analyse auf kleine Aliquote aus jedem erfassten Bevölkerung zu bestätigen.
  4. Den überstand zu entfernen, in 10 mL der FWB und Zentrifuge bei 250 X g bei 4 ° C für 10 min. wiederholen für eine Gesamtmenge von zwei Wäschen auszusetzen.
    Hinweis: Es ist schwierig, den überstand zu entfernen, ohne die Pellets verdrängen. Anbringen einer PIPETTENSPITZE zu einer Vakuumleitung kann mit der Entfernung helfen. Wenn diese nicht verfügbar ist, wird vorgeschlagen, dass der Überstand in einem frischen Rohr bei Pellet Dissoziation gesammelt werden.
  5. Entfernen Sie den überstand nach der zweiten Wäsche.
  6. Wenn der Benutzer experimentelles Design die Zellen wieder kultiviert werden diktiert, Schritte 2.12 – 2.14. Andernfalls, wenn Zellen zur sofortigen Untersuchung verwendet werden, bereiten Sie Zellen nach gewünschten Protokoll.
    Hinweis: Ein Beispiel für typische Funktionsanalyse ist in Abbildung 4enthalten.

Ergebnisse

In dem Bemühen, so viele Kanäle wie möglich, lebensfähigen Zellen zur Analyse zur Verfügung zu halten wurden routinemäßig basierend auf vorderen und seitlichen streuen, ohne sehr klein und sehr granular Ereignisse (ein typisches Tor gilt für alles, was der Punkt in Abbildung 1AGrundstücke) ausgewählt. Um festzustellen, ob diese gating Strategie zuverlässig abgestorbene Zellen ausgeschlossen, gebeizt wir mit 7-Amino Actinomycin D (7-AAD) (

Diskussion

Dieses Protokoll ermöglicht Isolation der GM-CSF-orientierte Vorläufer und Wegbereiter Zelltypen in Zahlen für verschiedene Arten von Analysen einschließlich der biochemischen Tests, Tests der Zellfunktion in Vitrooder Instillation in Vivoausreichend. Diese Methode stellt einen bedeutenden Fortschritt auf dem Gebiet der Monocyte-abgeleitete Dendritische Zelle Entwicklung, ermöglichen die zuverlässige Isolierung und Identifizierung von Zellen in dieser Weg der Entwicklung als auch die differenziert...

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Konflikte offenzulegen.

Danksagungen

Wir sind dankbar für die technische Unterstützung von Alison Kirche Vogel an Auburn Universität Schule von Veterinärmedizin Flow Cytometry Einrichtung, für Mittel aus der NIH EHS R15 R15 AI107773 und für die Zell- und Molekularbiologie-Programm an der Auburn University für Sommer Forschungsförderung, PBR.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
RPMI 1640Corning15-040-CV
Fetal Calf Serum (FCS)HyCloneSV30014.04to supplement complete medium and FWB
GlutaMAXGibco35050to supplement complete medium
2-mercaptoethanol (2-ME)MP Biomedical190242to supplement complete medium
75 mM Vacuum FilterThermo Scientific156-4045to sterilize complete media
ACK Lysis BufferLonza10-548Eto lyse red blood cell
HBSS bufferCorning21-020-CMto rescue leukocytes after red blood cell lysis
Phosphate Buffered Saline (PBS), Dulbecco'sLonza17-512Fmust be endotoxin free; chilled at 4 °C
35 µm Cell filterFalcon352235to break apart clumps before running through cytometer.
GM-CSFBiosourcePMC2011usable concentration of 10 ng/mL
Tissue cultured treated plateVWR10062-896for bone marrow cells after harvest
Anti-Ly6C, Clone HK1.4Biolegend128018
Anti-CD115, Clone AFS98Tonbo Bioscience20-1152-U100
Anti-CD11c, Clone HL3BD Biosciences557400to differeniate CMP and MoDCs
MoFlo XPD Flow CytometerBeckman CoulterML99030
BD Accuri C6BD Biosciences660517
100% EthanolPharmco-Aaper111000200CSPP
60 mm Petri DishCorning, Inc353002
50 mL Conical tubeVWR21008-242
C57BL/6 MiceThe Jackson Laboratory000664Female; 10-20 weeks old
Biosafety HoodThermo Scientific8354-30-0011
10 mL SyringeBD Biosciences301604
23 G needleBD Biosciences305145
Centrifuge 5810 Reppendorf22625501
FlowJo Software v10BD BiosciencesVersion 10flowjo.com

Referenzen

  1. Zhan, Y., Xu, Y., Lew, A. M. The regulation of the development and function of dendritic cell subsets by GM-CSF: more than a hematopoietic growth factor. Mol Immunol. 52, 30-37 (2012).
  2. Zhan, Y., et al. The inflammatory cytokine, GM-CSF, alters the developmental outcome of murine dendritic cells. Eur J Immunol. , (2012).
  3. van de Laar, L., Coffer, P. J., Woltman, A. M. Regulation of dendritic cell development by GM-CSF: molecular control and implications for immune homeostasis and therapy. Blood. 119, 3383-3393 (2012).
  4. Steinman, R. M., Inaba, K. Myeloid dendritic cells. J Leukoc Biol. 66, 205-208 (1999).
  5. Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 176, 1693-1702 (1992).
  6. Steinman, R. M., Pack, M., Inaba, K. Dendritic cell development and maturation. Adv Exp Med Biol. , 1-6 (1997).
  7. Pierre, P., et al. Developmental regulation of MHC class II transport in mouse dendritic cells. Nature. 388, 787-792 (1997).
  8. Steinman, R. M., Witmer-Pack, M., Inaba, K. Dendritic cells: antigen presentation, accessory function and clinical relevance. Adv Exp Med Biol. , 1-9 (1993).
  9. Na, Y. R., Jung, D., Gu, G. J., Seok, S. H. GM-CSF Grown Bone Marrow Derived Cells Are Composed of Phenotypically Different Dendritic Cells and Macrophages. Mol Cells. 39, 734-741 (2016).
  10. Rogers, P. B., Driessnack, M. G., Hiltbold Schwartz, E. Analysis of the developmental stages, kinetics, and phenotypes exhibited by myeloid cells driven by GM-CSF in vitro. PLoS One. 12, e0181985 (2017).
  11. Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42, 1197-1211 (2015).
  12. Alloatti, A., Kotsias, F., Magalhaes, J. G., Amigorena, S. Dendritic cell maturation and cross-presentation: timing matters!. Immunol Rev. 272, 97-108 (2016).
  13. Jakubzick, C. V., Randolph, G. J., Henson, P. M. Monocyte differentiation and antigen-presenting functions. Nat Rev Immunol. 17, 349-362 (2017).
  14. Mbongue, J. C., Nieves, H. A., Torrez, T. W., Langridge, W. H. The Role of Dendritic Cell Maturation in the Induction of Insulin-Dependent Diabetes Mellitus. Frontiers in immunology. 8, 327 (2017).
  15. Shortman, K., Naik, S. H. Steady-state and inflammatory dendritic-cell development. Nat Rev Immunol. 7, 19-30 (2007).
  16. Xu, Y., Zhan, Y., Lew, A. M., Naik, S. H., Kershaw, M. H. Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking. J Immunol. 179, 7577-7584 (2007).
  17. Naik, S. H. Generation of large numbers of pro-DCs and pre-DCs in vitro. Methods Mol Biol. 595, 177-186 (2010).
  18. Nikolic, T., de Bruijn, M. F., Lutz, M. B., Leenen, P. J. Developmental stages of myeloid dendritic cells in mouse bone marrow. Int Immunol. 15, 515-524 (2003).
  19. Hettinger, J., et al. Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor. Nat Immunol. 14, 821-830 (2013).
  20. Fogg, D. K., et al. A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells. Science. 311, 83-87 (2006).
  21. Traver, D., et al. Development of CD8{alpha}-Positive Dendritic Cells from a Common Myeloid Progenitor. Science. 290, 2152-2154 (2000).

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Weitere Artikel entdecken

Immunologie und InfektionAusgabe 138dendritischen Zellen EntwicklungGM SCFgemeinsame myeloischen Vorl uferzellenVorl uferzellen der Granulozyten MakrophagenMonocyteMonocyte abgeleitete Dendritische ZellenMakrophagen Monocyte abgeleitethigh Speed Zellsortierung

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Kontakt

BIBLIOTHEKS-EMPFEHLUNG

JoVE-Newsletter

Forschung

Lehre

Autoren

Bibliothekare

ÜBER JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten