Génération d’un grand nombre de progéniteurs myéloïdes et précurseurs des cellules dendritiques de murin la moelle osseuse à l’aide d’une nouvelle cellule stratégie de tri

Résumé

Ici, nous fournissons une méthode permettant d’identifier et d’isoler un grand nombre de GM-CSF, piloté par des cellules myéloïdes à l’aide de tri de cellules haute vitesse. On peuvent identifier cinq populations distinctes (progéniteurs myéloïdes communs, progéniteurs de granulocytes/macrophages, monocytes, macrophages dérivés de monocytes et macrophages dérivés de monocytes DCs) basé sur l’expression Ly6C et CD115.

Résumé

Cultures des macrophages dérivés de cellules dendritiques (RCSCND) générés à partir de moelle osseuse de souris à l’aide de Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) ont récemment été reconnus plus hétérogènes qu’auparavant. Ces cultures contiennent systématiquement RCSCND dérivées de monocytes et macrophages (moMac) et même des cellules moins développées telles que les monocytes. Le but du présent protocole est de fournir une méthode cohérente pour l’identification et la séparation des nombreux types de cellules présents dans ces cultures à mesure qu’ils développent, afin que leurs fonctions spécifiques peuvent être davantage étudiées. La stratégie triage présentée ici sépare de cellules tout d’abord en quatre populations basées sur l’expression de Ly6C et CD115, qui sont exprimés transitoirement par les cellules comme ils se développent dans la culture GM-CSF-driven. Ces quatre populations comprennent des progéniteurs myéloïdes communs ou CMP (Ly6C, CD115), progéniteurs de granulocytes/macrophage ou GMP (Ly6C +, CD115-), monocytes (Ly6C +, CD115 +) et les macrophages dérivés de monocytes ou moMac (Ly6C-, CD115 +). CD11c est également ajouté à la stratégie de tri pour distinguer deux populations au sein de la Ly6C-, CD115-population : CMP (CD11c-) et RCSCND (CD11c +). Enfin, deux populations peuvent être plus distinguées au sein de le Ly6C, CD115 + population en se basant sur le niveau de MHC classe expression II. MoMacs expriment des niveaux inférieurs du CMH de classe II, alors qu’un précurseur des DC de macrophages dérivés de monocytes (moDP) exprime plus MHC classe II. Cette méthode permet l’isolation fiable de plusieurs populations distinctes développemental en nombre suffisante pour une variété d’analyses fonctionnelles et du développement. Nous mettons en évidence une telle lecture fonctionnelle, les réponses différentielles de ces types de cellules à une stimulation par Pathogen-Associated profils moléculaires (PAMPs).

Introduction

Mise en culture des cellules de moelle épinière murin avec la cytokine Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) est largement utilisé comme une méthode pour générer des cellules dendritiques macrophages dérivés de monocytes (RCSCND ; également connu sous le nom DC inflammatoire) dans un grand nombre ^{1, 2,3,4,5}. Ces cellules ont été extrêmement utiles pour une variété d’études de cellules dendritiques (DC) fonction ^6,7,8. En règle générale, ces cellules de la moelle épinière murin sont cultivés pendant 6 à 8 jours et sont ensuite utilisés pour l’étude de la fonction des cellules dendritiques ⁵. Ces cultures avaient longtemps été considérée comme essentiellement homogènes, composé d’une majorité de RCSCND différenciée. Plus récemment, il est devenu clair qu’à la fin de cette période de culture de 6 à 8 jours, il existe en effet de nombreux RCSCND, ainsi qu’un large sous-ensemble de différenciée macrophages dérivés de monocytes (moMacs) ^9,10,11. Nos études ont étendu ces résultats démontrant que les autres sous-ensembles de moins développés de cellules, telles que RCSCND précurseurs (moDP) et les monocytes, restent dans les cultures à faible fréquence même après 7 jours, ¹⁰. Ainsi, des études de la fonction des cellules dendritiques (DC) à l’aide de cellules générées par ce système pourraient refléter les réponses d’une cohorte plus large de types de cellules que précédemment apprécié.

Nous avons appris beaucoup de choses de l’étude de GM-CSF-généré RCSCND relatives à la fonction de ces cellules au stade final de différenciation ^12,13,14. Toutefois, nous comprenons beaucoup moins sur la voie du développement de ces cellules ^2,15,16 et de comment et quand ils présentent des fonctions telles que : réactivité à Pathogen Associated Molecular Modèles (PAMPs), phagocytose, antigène traitement et présentation ¹³et activité anti-bactérienne. Un protocole pour l’isolement d’un grand nombre de classiques progéniteurs axée sur les Flt3L DC et de précurseurs a été rapporté ¹⁷. Isolement de ces populations distinctes a été réalisée à l’aide de carboxyfluorescéine succinimidyl ester (CFSE)-coloration des cellules de moelle osseuse (pour suivre la Division des cellules) et de la culture en Flt3L pendant 3 jours. Cellules étaient alors appauvrit les cellules positives linage et triés en populations ancêtre et précurseur basées sur CD11c expression ¹⁷. Une autre approche par groupe de Leenen pour identifier les progéniteurs précoces de DC en culture GM-CSF-driven devait trier les cellules basées sur CD31 et Ly6C ¹⁸. Le but initial était de créer une méthode similaire pour l’obtention des progéniteurs et précurseurs du GM-CSF-driven RCSCND. Les types de cellules spécifiques générées par le GM-CSF, nous avons adapté l’approche et la stratégie basée sur l’expression des molécules qui ont été exprimées au début et plus tard des stades de développement de tri. En fin de compte, nous avons déterminé que Ly6C, CD115 (CSF-1 receptor), et CD11c ont été les meilleurs marqueurs pour distinguer ces cellules type ¹⁰.

Ici, nous présentons une méthode pour isoler des cellules à plusieurs étapes distinctes de développement le long de la voie de la différenciation par le GM-CSF : monocyte progéniteur myéloïde commun (CMP), Granulocyte-Macrophage progénitrices (GMP), macrophages dérivés de monocytes (MoMac) et les macrophages dérivés de monocytes DC (RCSCND). La population de moMac peut être plus séparée basés sur le niveau de MHC classe expression II, révélant un RCSCND précurseur population (moDP) ¹⁰. Nous utilisons une cellule de fluorescence-lancée à grande vitesse tri stratégie (FACS) afin d’isoler ces 5 populations basées sur l’expression de Ly6C, CD115 et CD11c. Ensuite, nous démontrons l’examen de ces cellules dans des essais fonctionnels révélant leurs réponses à la stimulation de PAMP.

Protocole

Tout travail animal a été approuvé par le Comité de l’emploi et de Auburn University Institutional Animal Care conformément aux recommandations énoncées dans le Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire de la National Institutes of Health.

1. préparation pour la collecte de la moelle osseuse

1. Préparer 250 mL de milieu complet en ajoutant une solution de milieu de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 additionné de sérum de veau foetal de 10 %, 2 mM de glutamine et 50 µM 2-mercaptoéthanol à la partie supérieure d’une unité de fiole 0,22 µm filtre à vide et vide.
   Remarque : Le milieu complet peut être stocké à 4 ° C pendant 2 mois.
2. Préparer les solution d’éthanol à 70 % en mélangeant 350 mL d’éthanol à 100 % avec 150 mL stérile H₂O dans un ballon jaugé de 500 mL.
3. Set de centrifuger à 4 ° C.
4. Stériliser les pinces, bistouri et ciseaux dans l’éthanol à 70 %.
5. À l’aide d’une pipette sérologique, ajouter 5 mL de support complet pour trois boîtes de Petri de 60 mm.
6. À l’aide d’une pipette sérologique, ajouter 30 mL de médias complet dans un tube conique de 50 mL.

2. collecte des cellules de la moelle épinière murin

1. Euthanasier une souris C57BL/6 de CO₂ narcose selon les règles établies par les directives de American Veterinary Medical Association (AVMA) 2013 sur l’euthanasie.
2. Retirez et dépouiller les pattes arrière.
   1. Saturer les pattes et le torse avec 75 % d’éthanol et faire des coupes peu profondes à travers la peau autour de l’articulation de la hanche avec des ciseaux courbes tissu. À l’aide de pinces, tirer fermement la peau de la hanche vers le bas vers la cheville, révélant le muscle. Utiliser des ciseaux pour enlever le lambeau de peau.
   2. Enlever la patte arrière tout en sectionnant l’os juste au-dessus de l’articulation du fémur/hanche.
      NOTE : En plus de la zone de stérilisation, l’éthanol va aider à fournir des coupes nettes et empêcher les cheveux de contaminer les échantillons.
   3. Si les pieds seront transférées vers un nouvel emplacement pour la récolte de la moelle osseuse, plonger les pieds dans les médias.
3. Travaillant dans une cabinet de biosécurité stérile, transférer les jambes à l’un des plats Petri préalablement préparée.
4. Utiliser des ciseaux pour couper le juste au-dessous de la cheville et soigneusement Enlevez autant du tissu conjonctif musculaire et élastique que possible. Transférer l’OS nettoyés à la deuxième boîte de Pétri préparés.
   Remarque : Bien qu’il n’est pas nécessaire d’enlever tout le muscle, trop de tissu restant peut rendre difficile à débusquer la moelle osseuse.
5. Séparer le fémur, genou et tibia.
   1. À l’aide de pinces, tenir la jambe au niveau du genou et localisez la moelle.
      Remarque : la moelle osseuse doit être visible comme une ligne rouge pâle à l’intérieur de la cavité osseuse dans la partie supérieure du fémur et vers la fin du tibia.
      1. À l’aide de ciseaux, faire trois incisions comme suit.
         1. Couper le tibia juste au-dessus où la moelle apparaît à la fin.
         2. Couper juste en dessous de l’articulation du genou.
         3. Coupez juste au-dessus de l’articulation du genou.
         4. Si l’articulation de la hanche est toujours connectée sur le fémur, couper juste en dessous de l’articulation de la hanche.
      2. Trois fragments de retour à la boîte de Pétri et répétez ce processus sur l’autre jambe.
6. Rincer la moelle osseuse du fémur et du tibia.
   1. Remplissez une seringue de 10 mL avec support complet du tube conique de 50 mL et du capuchon avec aiguilles 23 G.
   2. En tenant l’OS avec une pince au-dessus de la troisième boîte de Pétri préparés, introduire l’aiguille dans le canal osseux et pousser les médias à travers, débusquer les cellules (qui peuvent apparaître comme un « bouchon » intact ou plusieurs groupes). Répétez jusqu'à ce qu’aucun plus de la couleur ne peut être vu à travers l’OS. Remplissez la seringue contenant du milieu comme nécessaire.
7. Écraser les épiphyses.
   1. Tandis que toujours dans la deuxième boîte de Pétri, tenir la rotule fermement avec une pince et réduire en purée les genoux avec l’embout de la seringue. Continuez jusqu'à ce que les épiphyses ne sont plus rouges.
8. À l’aide de la seringue, transférer les cellules de la deuxième et la troisième boîte de Pétri pour le tube de 50 mL. Éclatement des touffes de pipetage doucement verticalement. Essayez de ne pas générer des bulles. Centrifuger à 250 x g à 4 ° C pendant 10 min.
9. Lyse des globules rouges
   1. Retirer le liquide surnageant avec pipette sérologique, déloger pellet effleurement et lyse des globules rouges en incubant dans 1 mL de tampon de lyse ACK (chlorure d’Ammonium-Potassium) pendant 1 min à température ambiante.
   2. À l’aide d’une pipette sérologique, ajouter 40 mL de tampon HBSS (Hanks Balanced Salt Solution).
10. À l’aide d’une pipette sérologique, filtrer les cellules si une passoire de cellule 70 µm dans un nouveau tube conique de 50 mL. Centrifuger à 250 x g à 4 ° C pendant 10 min.
11. À l’aide d’une pipette sérologique, retirez le surnageants et laver les cellules avec 40 mL de médias complet. Centrifuger à 250 x g à 4 ° C pendant 10 min.
    Remarque : À ce stade, lymphocytes positifs lignée peuvent être enlevés par FACS ou purification colonne magnétique. Toutefois, les lymphocytes ne sont pas maintenues à long terme dans la culture. Bien qu’un grand nombre de cellules positives de lignée est présent dans la Ly6C-CD115-population dans la moelle osseuse ex vivo, presque tous sont absents par jour 5 (Figure 2).
12. À l’aide d’une pipette sérologique, éliminer le surnageant et les cellules de moelle osseuse dans les médias complets 10 ng/ml de recombinant mouse GM-CSF à une densité de 1 x 10⁶ cellules/mL de la culture.
    Remarque : En général, 4 x 10⁷ cellules total peuvent être récoltées après la lyse des globules rouges. Cependant, s’attendre à aussi peu que 2 × 10-⁷ pour les débutants et jusqu'à 5 x 10⁷ cellules pour les pêcheurs expérimentés.
13. À l’aide d’une pipette sérologique, les cellules de transfert aux plaques de culture de tissus et incuber à 37 ° C à 5 % de CO₂. Si des graines à l’aide d’une plaque 24 puits, chacun avec 2 mL de suspension cellulaire.
14. Toutes les 48 h, utiliser une pipette sérologique pour retirer la moitié des médias et les remplacer par des supports complets neufs et GM-CSF.
    NOTE : Cultures peuvent être conservées jusqu'à 9 jours. Cependant, la composition change au fil du temps. Pour plus d’informations, voir la Section 3.

3. choisir le jour du tri

1. Compositions de la population de cellules changer au fil du temps, sélectionner un jour qui donne le plus grand nombre de cellules souhaitées.
2. Voir le tableau 1 pour le genre de post de rendement cellule prévue pour chacune des populations après 3, 5 et 7 jours de culture en GM-CSF par 1 x 10⁷ cellules.

4. stratégie de coloration

1. Petites parties aliquotes de cellules permet de préparer des échantillons de contrôle. Inclure un contrôle non coloré, des échantillons de contrôle de compensation colorées avec un seul anticorps fluorescent, et fluorescence-moins-un contrôle dans laquelle les anticorps sont ajoutés, sauf un, au contrôle de fluorescence non spécifique dans ce canal. Si l’utilisation indirecte d’étiquetage, notamment primaires secondaires seul, seul et primaire et secondaire.
   NOTE : Phycoérythrine (PE) et les anticorps allophycocyanin (APC) Taggé offrent nette séparation avec purge minime sur utilisés ensemble. Toutefois, si le fluorochrome options sont limitées, CD115 s’exprime à un niveau relativement bas, tandis que Ly6C est exprimée à des niveaux très élevés. Par conséquent, plus lumineux fluorochromes sont souhaitables pour anti-CD115 et anti-Ly6C fluorochromes sont choisis pour éviter de saigner trop.
2. Préparer 100 mL de tampon de lavage FACS (FWB) en mélangeant 97 mL de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco réfrigérés (SPD) avec 3 mL de sérum de veau foetal dans un tube conique de 50 mL et placer dans un bain de glace.
3. Utiliser une pipette pour doucement, mais complètement, pipette de cellules de haut en bas pour déloger les cellules faiblement adhérentes.
4. À l’aide d’une pipette sérologique, transfert de cellules dans un tube conique de 50 mL. Centrifuger à 250 x g à 4 ° C pendant 10 min.
   1. Si le volume cellulaire dépasse 50 mL, cellules de transfert pour le nombre de tubes nécessaires et se combinent à l’étape de coloration.
5. Doucement, décanter le liquide surnageant et laver les cellules boulettes en ajoutant 30 mL de FWB avec une pipette sérologique. Centrifuger à 250 g à 4 ° C pendant 10 min et répéter le lavage.
   Remarque : Si la mort cellulaire élevée est attendue, les cellules peuvent être lavés avec FWB avec aussi peu que 0,5 % de sérum de veau foetal (FCS). Cela empêchera l’agglutination des cellules.
6. Suspendre et colorer des cellules par les instructions du fabricant de l’anticorps.
   1. Suspendre les cellules⁷ 5 x 10 dans 1 mL de FWB et ajouter 2 µg chaque anti-Ly6C et anti-CD115 étiquetés avec les fluorophores (de choix du chercheur). Pour distinguer plus loin le CMP du RCSCND (les deux sont Ly6C - et CD115-), ajouter 2 µg d’anticorps anti-CD11c (CMP sont CD11c^-; RCSCND sont CD11c⁺). Incuber pendant 30 minutes sur la glace.
      Remarque : La Figure 3 a été générée à l’aide de Ly6C-PE et CD115-APC.
7. À l’aide d’une pipette sérologique, ajouter 10 mL de FWB et centrifuger à 250 x g à 4 ° C pendant 10 min.
8. Doucement, décanter le liquide surnageant et laver les cellules boulettes en ajoutant 30 mL de FWB avec une pipette sérologique. Centrifuger à 250 g à 4 ° C pendant 10 min et répéter le lavage.
9. Avant de suspendre les cellules, feuilleter tube soigneusement pour déloger le culot. Utiliser une pipette sérologique pour suspendre des cellules à 1 x 10⁷ cellules/mL de FWB et filtrer sur filtre de cellule 35 µm. Utiliser une pipette sérologique pour transférer des cellules filtrés dans tube en polypropylène et placer sur la glace jusqu’au moment de trier.
   Remarque : Si polypropylène n’est pas disponible, protéine enduit (de lait sec ou FCS) tubes en polystyrène permet de réduire la liaison.

5. Réglez Gates fondées sur des échantillons de contrôle

Remarque : Pour ne pas perturber les cellules en raison de la pression de l’écoulement à grande vitesse, utiliser une buse de 100 – 130 µm pour le tri des cellules.

1. Exécuter le contrôle sans coloration (voir point 4.1) par le biais de la Trieuse cellules et appliquez une porte afin d’exclure les petits débris (faible dispersion vers l’avant ; FSC) et hautement granulaire (nuage de points du côté le plus haut ; Particules SSC).
   1. Pour analyser uniquement les stades avancés (monocytes, moMac/MoDP et RCSCND), appliquer gating pour inclure uniquement des cellules plus grandes (haute FSC).
   2. Si les taches de viabilité sont utilisés, utilisez-les pour exclure des événements tachés, non viables (un exemple est illustré à la Figure 1).
2. Exécuter les exemples de monocommande fluorescent dans le trieur de cellules et ajuster la compensation selon les besoins.
3. Exécuter un échantillon de l’échantillon marqué multi. Observer les quatre populations distinctes : Ly6C + CD115-(BPF), Ly6C + CD115 + (monocytes), Ly6C-CD115 + (moMacs/moDP) et Ly6C-CD115 - (CMPs/moDCs). Appliquer une porte pour isoler chacun des quatre principales populations.
   Remarque : SCPM et RCSCND partagent le Ly6C-CD115-phénotype. Toutefois, elles peuvent être différenciées sur la base CD11c expression : CMP manque CD11c, tandis que MoDCs express CD11c.

6. perception des Populations isolées

1. Préparer les tubes de prélèvement en ajoutant suffisamment FCS pour atteindre au moins 20 % concentration finale lorsqu’il est plein. Par exemple, si vous utilisez des tubes de 5 mL, ajouter 1 mL de FCS avant le tri et retirez le tube lorsqu’il atteint le volume total de 5 mL.
2. Pour empêcher l’absorption de chiffre d’affaires et les anticorps membranaires, conserver tous les échantillons (mélangé et tri) à 4 ° C tout au long de la sorte.
   1. Si ce n’est pas possible, gardez le tube contenant les cellules glace autant que possible être triés et transférer des aliquotes dans la trieuse de selon les besoins.
   2. En outre, les échantillons de transfert trié à la glace toutes les 20 à 30 min.
3. Après que le nombre de cellules ont été recueilli, utiliser une pipette sérologique pour transférer les cellules dans un nouveau tube conique. Centrifuger à 250 x g à 4 ° C pendant 10 min.
   1. Confirmer la pureté post-tri analyse sur petites parties aliquotes de chaque population recueillie.
4. Retirer le surnageant, suspension dans 10 mL de FWB et centrifuger à 250 x g à 4 ° C pendant 10 min. Repeat pour un total de deux lavages.
   Remarque : Il peut être difficile de retirer tout le liquide surnageant sans déloger le culot. Fixer un embout de la pipette sur une ligne vide peut aider avec l’enlèvement. Si ce n’est pas disponible, on croit percevoir le surnageant dans un nouveau tube en cas de dissociation de pellet.
5. Retirez le surnageant après le deuxième lavage.
6. Si le dispositif expérimental de l’utilisateur dicte les cellules re-être mis en culture, suivez les étapes 2.12 – 2.14. Dans le cas contraire, si cellules seront utilisés pour l’analyse immédiate, préparer les cellules selon le protocole désiré.
   Remarque : Un exemple d’analyse fonctionnelle typique est inclus dans la Figure 4.

Résultats

Dans un effort pour garder le maximum de canaux disponibles pour l’analyse sous forme de cellules possibles et viables ont été systématiquement choisis sur nuages de points avant et latéraux, à l’exclusion des événements très petites et très granulaires (une porte typique est appliquée à tous le point des parcelles dans la Figure 1 a). Pour déterminer si cette stratégie de blocage fiable exclut les cellules mortes, nous avons teinté avec 7-A...

Discussion

Ce protocole facilite l’isolement de GM-CSF-driven ancêtre et précurseur types cellulaires en nombre suffisant pour plusieurs types d’analyses dont les épreuves biochimiques, les tests de la fonction cellulaire in vitroou in vivode l’instillation. Cette méthode représente une avancée significative dans le domaine du développement des cellules dendritiques macrophages dérivés de monocytes, permettant l’isolation fiable et l’identification des cellules au début de cette voie de dévelo...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	Corning	15-040-CV
Fetal Calf Serum (FCS)	HyClone	SV30014.04	to supplement complete medium and FWB
GlutaMAX	Gibco	35050	to supplement complete medium
2-mercaptoethanol (2-ME)	MP Biomedical	190242	to supplement complete medium
75 mM Vacuum Filter	Thermo Scientific	156-4045	to sterilize complete media
ACK Lysis Buffer	Lonza	10-548E	to lyse red blood cell
HBSS buffer	Corning	21-020-CM	to rescue leukocytes after red blood cell lysis
Phosphate Buffered Saline (PBS), Dulbecco's	Lonza	17-512F	must be endotoxin free; chilled at 4 °C
35 µm Cell filter	Falcon	352235	to break apart clumps before running through cytometer.
GM-CSF	Biosource	PMC2011	usable concentration of 10 ng/mL
Tissue cultured treated plate	VWR	10062-896	for bone marrow cells after harvest
Anti-Ly6C, Clone HK1.4	Biolegend	128018
Anti-CD115, Clone AFS98	Tonbo Bioscience	20-1152-U100
Anti-CD11c, Clone HL3	BD Biosciences	557400	to differeniate CMP and MoDCs
MoFlo XPD Flow Cytometer	Beckman Coulter	ML99030
BD Accuri C6	BD Biosciences	660517
100% Ethanol	Pharmco-Aaper	111000200CSPP
60 mm Petri Dish	Corning, Inc	353002
50 mL Conical tube	VWR	21008-242
C57BL/6 Mice	The Jackson Laboratory	000664	Female; 10-20 weeks old
Biosafety Hood	Thermo Scientific	8354-30-0011
10 mL Syringe	BD Biosciences	301604
23 G needle	BD Biosciences	305145
Centrifuge 5810 R	eppendorf	22625501
FlowJo Software v10	BD Biosciences	Version 10	flowjo.com