Métodos para la detección de amiloides siguiente infección de pulmonar endotelial células citotóxicas por Pseudomonas aeruginosa

Resumen

Se describen métodos sencillos para la demostración de la producción de amiloides citotóxicos después de la infección del endotelio pulmonar por Pseudomonas aeruginosa.

Resumen

Los pacientes que sobreviven la neumonía han elevado las tasas de mortalidad en los meses después del alta hospitalaria. Se ha presumido que la infección del tejido pulmonar durante la neumonía los resultados en la producción de citotoxinas larga vida que puede llevar a insuficiencia del órgano de extremo posterior. Hemos desarrollado en vitro ensayos para probar la hipótesis que citotoxinas son producidos durante la infección pulmonar. Las células endoteliales pulmonares aislado de rata y la bacteria Pseudomonas aeruginosa se utilizan como sistemas modelo, y la producción de cytoxins después de la infección de las células endoteliales por la bacteria se demuestra mediante cultivo celular seguido por cuantificación directa mediante los análisis de lactato deshidrogenasa y un novedoso método microscópico utilizando tecnología de ImageJ. La naturaleza amiloide de estas citotoxinas fue demostrada por thioflavin T enlace ensayos y por immunoblotting y immunodepletion usando anticuerpo anti-amiloide de A11. Posteriores análisis mediante immunoblotting demostraron que los tau y Aβ se producida y liberada por las células endoteliales después de la infección por p. aeruginosa. Estos métodos deben ser fácilmente adaptables a los análisis de muestras clínicas humanas.

Introducción

Los pacientes que sobreviven la neumonía han elevado las tasas de mortalidad en los meses siguientes hospital descarga^1,2,3,4,5,6. En la mayoría de los casos, la muerte se produce por algún tipo de insuficiencia de órgano, incluyendo renal, pulmonar, cardiaca, o hígados eventos como la carrera^5,6. Nunca se ha establecido la razón de la elevada tasa de mortalidad en esta población de pacientes.

La neumonía se clasifica como siendo ya sea adquirida en la comunidad o adquirida en el hospital (nosocomial) y los agentes causantes de neumonía incluyen bacterias, virus, hongos y productos químicos. Una de las principales causas de neumonía nosocomial es la bacteria Pseudomonas aeruginosa. P. aeruginosa es un organismo Gram-negativo que utiliza un sistema de secreción tipo III para transferir varias moléculas efectoras, como exoenzimas, directamente en el citoplasma de las células de destino^7,8. Durante la infección de células endoteliales pulmonares, las exoenzimas objetivo diversas proteínas intracelulares, incluyendo una forma endotelial de la proteína asociada a microtúbulos tau^9,10,11,12 , conduce a la ruptura de la barrera endotelial dando lugar a edema pulmonar severo, disminución de la función pulmonar y, a menudo, la muerte.

Como se indicó anteriormente, los pacientes que sobreviven la neumonía inicial han elevado las tasas de mortalidad en los primeros 12 meses después del alta hospitalaria. Un mecanismo potencial para explicar este fenómeno es que se genera algún tipo de toxina duradera durante la infección inicial que conduce a pobres resultados a largo plazo. Dos observaciones apoyan esta posibilidad. En primer lugar, cultivadas pulmonar las células endoteliales que son tratadas inicialmente con p. aeruginosa no proliferan por hasta una semana después de que las bacterias se destruyen con antibióticos¹³. Priones en segundo lugar, larga vida y agentes con las características del prión se han demostrado en varias enfermedades humanas y animales, particularmente las enfermedades asociadas con el sistema nervioso^14,15.

Nunca se han descrito métodos para examinar el potencial de producción de agentes citotóxicos duraderos durante la infección pulmonar. Aquí se describen una serie de ensayos simples en vitro que puede utilizarse para investigar producción de citotoxina y actividad después de la infección con un agente que causa común de neumonía, p. aeruginosa. Estos ensayos deben ser fácilmente adaptables para investigar la inducción de la citotoxina posible después de la infección con otros agentes causantes de neumonía, y los sobrenadantes que se generan también deberían ser útiles para investigar efectos de citotoxinas en todo órganos o animales. Por último, los ensayos que se describen aquí es muy probable que será adaptables a prueba de fluidos biológicos humanos y animales para la producción de citotoxinas en neumonía.

Protocolo

Todos los procedimientos animales fueron revisados y aprobados por el Comité de cuidado del Animal de la Universidad de Alabama del sur e institucional y se realizaron conforme a las regulaciones federales, estatales y locales. Cultivos primarios de células endoteliales microvasculares pulmonar rata (PMVECs) se obtuvieron del fondo para el núcleo de la célula cultura en el centro de la Universidad de Alabama del sur para la biología del pulmón. Las células fueron preparadas usando procedimientos previamente descritos¹⁶.

1. generación de sobrenadantes citotóxicos

Nota: Aquí, utilizamos dos cepas diferentes de p. aeruginosa: PA103, que cuenta con un sistema de secreción de tipo intacto III capaces de transferir las exoenzimas ExoU y ExoT a células diana durante la infección y ∆PcrV, que carece de un tipo de sistema de secreción III y es incapaz de transferir exoenzimas a células de destino después de la inoculación.

1. Bacterias en de placas de agar de Vogel-Bonner (VB)¹⁷ la raya y crecer durante la noche a 37 ° C.
   1. Para preparar platos, hacer la siguiente solución (sales de Vogel-Bonner, stock de x 10): medir 2 g de MgSO₄, 20 g ácido cítrico (ácido libre), 100 g de K₂PO₄y 35 g NaH₂PO₄. Añadir ddH₂O a 1 L y autoclave durante 15 min con escape lento.
   2. Coloque el agar 7,5 g en 450 mL ddH₂O y autoclave como el anterior.
   3. Después de autoclavar, coloque ambas soluciones en un baño de agua de 50 ° C para enfriar.
   4. Añadir 50 mL de la solución de sal común de 10 x VB en el agar.
   5. Añadir carbenicilina a 400 μg/mL (para las cepas de p. aeruginosa se utiliza) y mezclar bien agitando el frasco.
   6. Lugar 5 mL de la solución de agar VB en platos de cultivo estériles individuales, permitir que el agar solidifique y luego almacenar a 4 ° C hasta el día de la siembra bacteriana.
   7. En el día de la siembra bacteriana, caliente previamente las placas a 37 ° C y luego la raya las bacterias en la placa con un asa estéril. Coloque el plato en una incubadora de 37 ° C durante la noche.
2. Verificar la pureza PMVEC por la coloración positiva con fluorescente Griffonia simplicifolia lectinas y tinción negativa con fluorescentes lectina de Helix pomatia (un marcador de células endoteliales arteriales). Células de alícuotas y congelación en nitrógeno líquido.
3. Para los experimentos, mantener las células en el medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal 10% y crecen las células en una incubadora de 37 ° C con 5% CO₂. Utilizar células en pasajes 5-15.
   1. Para la generación de sobrenadantes citotóxicos, placa de 2 x 10⁶ células en platos individuales de 150 cm y crecer durante 3-4 días hasta alcanza la confluencia. Utilice dos placas por experimento (véase abajo).
   2. Para el análisis de sobrenadantes citotóxicos, placa de 1 x 10⁵ células en pocillos individuales de un pozo de 6 plato y creciendo durante cuatro días hasta alcanza la confluencia.
4. Para producir el sobrenadante, lavar uno de los platos de dos de 150 cm de PMVECs de paso 1.3.1 con solución salina con tampón fosfato, trypsinize y luego contar las células (utiliza un contador de células automatizado y seguir el protocolo del fabricante; véase Tabla de materiales). Lavar el otro plato de PMVECs con de Hank equilibrada solución de sal (HBSS) y luego infectar con cualquier cepa de p. aeruginosa en una multiplicidad de infección (MOI) de 20:1. Esto se logra como sigue:
   1. Para p. aeruginosa, OD₅₄₀ 0.25 = 2 x 10⁸ UFC/mL. Para preparar esta disolución, añadir 1 mL HBSS a una cubeta desechable de 1 mL. Raspar las suficientes bacterias de la placa que se preparó en el paso 1.1 hasta un OD₅₄₀ de 0,25 se obtiene cuando se mide con un espectrofotómetro. El siguiente paso le proporcionará un cálculo de cuánto se necesitará las bacterias.
   2. Una vez que se determina el número de PMVECs en la placa de cultivo (paso 1.4 anterior), determinar el número apropiado de bacterias en el plato de segunda, no tripsinizaron cultura que contiene las PMVECs. Por ejemplo, si se determina que el plato de cultura de PMVECs contiene 1.3 x 10⁷ células, entonces preparar 1.3 x 10⁷ células x 20 bacterias/celular x 1 mL/de 2 x 10⁸ UFC = bacterias 1,3 mL.
   3. Diluir el 1,3 mL de bacterias en HBSS hasta un volumen final de 20 mL, para que toda la superficie de un plato de 150 cm puede ser cubierto con el líquido, luego añadir las bacterias diluidas a la placa de PMVECs.
   4. Incubar los PMVECs inoculados con la bacteria a 37 ° C en un incubador 5% CO₂ para 4-5 h, hasta que las lagunas se observan formando en la monocapa de células cuando la placa se observa microscópicamente (ver figura 1 para el nivel adecuado de formación del boquete).
   5. Recoger el sobrenadante y luego centrifugar por 10 min a 2.000 x g en una centrífuga de mesa para eliminar los desechos celulares.
      Nota: Cualquier centrífuga de mesa capaz de generar g suficiente fuerza para que sedimenten las células unlysed y células grandes fragmentos se pueden utilizar para este paso.
   6. Vierta el sobrenadante en una jeringa que tiene un filtro de 0.2 μm unido a su extremo, entonces pasar el sobrenadante a través del filtro para eliminar las bacterias.
   7. Utilizar una alícuota del sobrenadante estéril a prueba de citotoxicidad (ver 2.1) y congelar el resto del sobrenadante a-80 ° C para su uso futuro.

2. Análisis de sobrenadantes citotóxicos

1. Ensayo de citotoxicidad
   1. Crecer PMVECs en pozo 6 platos hasta confluencia. Pozos de lavado una vez con HBSS, luego añadir 1,5 mL de sobrenadante esterilizado por filtro (recogido de cualquier células inoculadas PA103 o ∆PcrV) a pocillos individuales. Añadir HBSS estéril a otro así como control negativo.
   2. Coloque la placa en la incubadora de CO₂ por 21-24 h, y luego observar para matar/citotoxicidad celular (ver siguiente paso). Utilice sobrenadantes que exhiben citotoxicidad para más experimentación y descartar aquellos que no muestran la muerte de la célula.
   3. Cuantificación de la matanza de la célula
      1. Liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) medida de las células muertas utilizando comercialmente disponibles Kits de análisis de LDH y de fabricante procedimientos recomendados.
      2. Por otra parte, cuantificar muerte celular microscópico utilizando el software ImageJ. Para esto, grabar imágenes microscópicas y las áreas de la placa de cultivo que contiene las células intactas, luego cuantificar las regiones que carecen de células (indicativas de muerte celular en una monocapa) utilizando una macro personalizada de ImageJ (institutos nacionales de salud) (véase archivos de codificación complementarios ). Si lo desea, realizar los pasos de la macro manualmente como sigue:
         1. Entrada de imágenes (en formato RGB o Tiff) en la macro y ajustar el contraste de los píxeles 15% saturado. Duplicar imágenes ajustar contraste y realizar el comando "quitar fondo" para obtener una imagen de alto contraste de célula y espacio dentro del campo de visión.
         2. Reste esta imagen de la imagen original y la imagen resultante con la imagen original utilizando la calculadora de imagen "Y" la función se combinan. Convertir la imagen resultante a negro (gaps) y máscara blanca (células) con la función de umbral (mínimo 0, máximo 5) y utilizar la función "binario erosionar" para eliminar el ruido de la imagen.
         3. Medir la relación del negro al blanco píxeles de la imagen resultante utilizando la medida de "fracción de área". Parcela y expresar áreas fraccionarias para cada punto de tiempo de tratamiento como por ciento del área de separación máxima.
         4. Medios de calcular y comparar utilizando unidireccional ANOVA con prueba post-hoc de Tukey, con valores de p menor de 0,05 considerado significativo.
   4. Utilice el análisis de immunoblot para establecer la presencia de amiloide, tau oligomérica y Aß en sobrenadantes de cultivo. Realizar el análisis de immunoblot usando procedimientos estándar^10,11,12, excepto para concentración de sobrenadantes de cultivo por lo menos 10 veces antes de la electroforesis.
      1. Para concentrar el sobrenadante, coloque 1-2 mL de sobrenadante en una unidad de filtro de centrifugación cuya membrana tiene un corte de peso molecular de 10 kDa. Luego, coloque la unidad de filtro en una centrífuga de mesa y centrifugar a 2.000 x g hasta el grado necesario de concentración es logra (normalmente 45-60 min).
      2. Determinar la cantidad de proteína en el sobrenadante concentrado¹¹ y cargar cantidades iguales de muestras en los pocillos del gel.
      3. Correr los geles, las proteínas de transferencia a nitrocelulosa, luego probe borrones con A11 del anticuerpo anti-amiloide, anticuerpos de anti-oligomeric tau T22 o anticuerpo de anti-Aß MOAB2 seguida de anticuerpos secundarios apropiados. Desarrollar el Blot usando procedimientos estándar de la quimioluminescencia.
   5. Para hacer un thioflavin T ensayo, usar fluorescencia de tioflavina T (ThT) para cuantificar amiloides en sobrenadantes. Para estas mediciones, utilizar sobrenadante esterilizado por filtro.
      1. Prepare una solución (x 50) de tioflavina T suspendiendo tioflavina T (ThT) de 8 mg en solución salina 10 mL tamponada fosfato (PBS). Después de mezclar, filtrar la solución a través de un filtro de 0,22 μm para eliminar partículas.
      2. Para las medidas, añadir 20 μl del stock de ThT a 1 mL de PBS en una cubeta del espectrofotómetro 1 mL. Coloque la muestra diluida en un espectrofluorímetro.
      3. Medir la emisión de fluorescencia basal utilizando excitación nm 425 y exploración de la emisión de fluorescencia de 450-575 nm en 2 incrementos de nm.
      4. Realizar un time-lapse análisis mediante excitación nm 425 y 482 emisión nm, con los datos adquiridos cada 0.2 s 60 s.
      5. La inicial 20 s del time-lapse análisis medidas de fluorescencia en la cubeta en blanco. A los 20 s, pausar el análisis y añadir 10 μl del sobrenadante esterilizado por filtro a la cubeta. La cubeta la mezcla por inversión y luego vuelva a colocar el espectrofluorímetro.
      6. Reanudar el análisis basado en el tiempo, adquirir el final 40 s de datos.
      7. Al finalizar el scan Time-lapse, realizar un análisis de espectro de emisión de fluorescencia final con ajustes idénticos, como se detalla en 2.1.5.3.

Resultados

Un análisis simple en vitro ha sido desarrollado para analizar la presencia de citotoxinas en sobrenadantes de células infectadas con la bacteria p. aeruginosa. Básicamente, medio de cultivo de las células infectadas se recogen 4 h después de la adición de bacteria, las bacterias se eliminan por la esterilización del filtro de la cultura sobrenadante y luego se añade el sobrenadante estéril a una nueva población de células. Las células luego se observan 21-24...

Discusión

Aquí, simple en vitro métodos están descritos que permiten la demostración de la generación de amiloides citotóxicos durante la infección con una pulmonía que organismo. Estos métodos incluyen ensayos de citotoxicidad en cultivo celular, immunoblotting, cuantificación de célula matar utilizando un novedoso método microscópico y enlace de ThT. Análisis de los agentes citotóxicos han demostrado que son amiloide en la naturaleza (figura 2 y

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rabbit anti beta amyloid	Thermo	71-5800
A11 amyloid oligomer antibody	StressMarq	SPC-506D
T22 anti-tau oligomer antibody	EMD Millipore	ABN454
Thioflavin T	Sigma Aldrich	T3516
HBSS	Gibco	14025-092
PBS	Gibco	10010-023
0.22 micron syringe filters	Millipore	SLGP033RS
DMEM	Gibco	11965-092
HRP Goat antirabbit IgG	Abcam	ab6721-1
Strains PA103 and ΔPcrV			These strains of P. aeruginosa were obtained from Dr. Dara Frank, University of Wisconsin Medical College, Milwaukee, WI
FITC Griffonia lectin	Sigma Aldrich	L9381
TRITC Helix pomatia lectin	Sigma Aldrich	L1261
Agar	Fisher	BP1423-500
0.22 micron nitrocellulose	BioRad	162-0112
Type 2 collagenase	Worthington	LS004176
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30898.03IH
PenStrep	Gibco	15070063
Carbenicillin Disodium salt	Sigma	C1389
Microcetrifugation concentrators- 10,000 MW cut-off	Millipore	UFC801008
Potassium phosphate dibasic	Sigma	795496-500G
Magnesium phosphate heptahydrate	MP Biomedicals	MP021914221
Citric Acid	G Biosciences	50-103-5801
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Sigma	S9506-500G
Countess Automated Cell Counter	Invitrogen	C10277