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摘要

介绍了用铜绿假单胞菌感染肺内皮后细胞毒性 amyloids 的制备方法。

摘要

在出院后的几个月里, 患有肺炎的病人死亡率升高。据推测, 肺炎期间肺部组织感染导致长期存活的细胞毒素的产生, 从而导致随后的最终器官衰竭。我们已经开发了体外检测, 以检验细胞毒素在肺部感染过程中产生的假说。将孤立大鼠肺内皮细胞和细菌铜绿假单胞菌作为模型系统, 用细胞培养法对 cytoxins 后的内皮细胞感染进行了分析, 然后用乳酸脱氢酶测定法直接定量, 并利用 ImageJ 技术进行了一种新的显微方法。通过 thioflavin T 结合试验, 免疫印迹法和 immunodepletion 采用 A11 抗淀粉样蛋白抗体, 证明了这些细胞毒素的淀粉样蛋白性质。进一步分析使用免疫印迹法表明, 寡聚头和 Aβ是由内皮细胞产生和释放后感染的铜绿假单胞菌。这些方法应易于适应对人体临床样品的分析。

引言

在出院1、2、3、4、5、6之后的几个月里, 患肺炎的患者死亡率升高。在大多数情况下, 死亡发生的一些类型的最终器官衰竭, 包括肾脏, 肺, 心脏, 或肝脏事件, 以及中风5,6。这个病人的死亡率上升的原因从来没有建立。

肺炎被归类为社区获得的或医院获得的 (医院), 可以引起肺炎的药物包括细菌、病毒、真菌和化学物质。细菌性铜绿假单胞菌是医院内肺炎的主要病因之一。铜绿假单胞菌是一种革兰阴性有机体, 使用 III. 型分泌系统将各种效应分子 (称为 exoenzymes) 直接转移到靶细胞7、8的细胞质中。在肺内皮细胞感染期间, exoenzymes 靶向各种胞内蛋白, 包括微管相关蛋白头9、10、11、12 的内皮形态., 导致内皮屏障破裂导致严重肺水肿, 肺功能减退, 常常死亡。

如前所述, 在出院后的头12月中, 幸存于最初肺炎的病人的死亡率升高。解释这种现象的一个潜在机制是, 在最初的感染过程中产生了某种长期存在的毒素, 导致了长期的不良结果。两项意见支持这种可能性。首先, 在细菌被抗生素杀死13之后, 最初用铜绿假单胞菌治疗的培养的肺内皮细胞不能增殖长达一周。第二, 长期存活的普利子和具有朊病毒特征的特工已经在各种人类和动物疾病中表现出来, 特别是与神经系统有关的疾病14,15。

在肺部感染过程中, 研究长期存活的细胞毒性药物的潜在生产方法从未被描述过。这里概述了一系列简单的体外检测方法, 可用于调查使用常见肺炎引起的铜绿假单胞菌感染后毒素的生产和活动。这些化验应易于适应, 以调查可能的毒素诱导后, 使用其他药物引起肺炎的感染, 并产生的上清液也应有助于调查细胞毒素的影响, 整个器官或动物。最后, 这里概述的化验结果最有可能会适应于在肺炎期间生产细胞毒素的动物和人体生物液。

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研究方案

所有动物程序都由南阿拉巴马大学的机构和动物护理委员会审查和批准, 并按照所有联邦、州和地方条例进行。主要培养的大鼠肺微血管内皮细胞 (PMVECs) 是从细胞培养核心设施, 在南阿拉巴马大学的肺生物学中心。细胞是用先前描述的步骤16编写的。

1. 细胞毒性上清液的产生

注: 在这里, 我们使用两种不同菌株的铜绿假单胞菌: PA103, 它有一个完整的 III 型分泌系统能够转移 exoenzymes ExoU 和 ExoT 的目标细胞在感染期间, ∆PcrV, 这是缺乏第三类分泌系统, 并在接种后无法将 exoenzymes 转移到靶细胞。

  1. 条纹细菌上伏地尔-博纳 (VB) 琼脂板17和增长隔夜在37摄氏度。
    1. 要准备板材, 请做以下库存解决方案 (伏戈尔-博纳盐; 10x 库存): 测量2克 MgSO4, 20 克柠檬酸 (游离酸), 100 克 K2po4, 35 克 NaH2po 4。添加 ddH2O 到1升和高压釜为15分钟与慢排气。
    2. 放置7.5 克琼脂在450毫升 ddH2O 和高压釜如上所述。
    3. 跟随热处理, 安置两个解答入50°c 水浴冷却。
    4. 添加50毫升的 10x VB 库存盐溶液的琼脂。
    5. 添加羧苄青霉素到400µg/毫升 (对于使用的铜绿假单胞菌), 并通过旋转烧瓶混合良好。
    6. 将 VB 琼脂溶液的5毫升放入单独的无菌培养皿中, 使琼脂凝固, 然后贮存在4摄氏度直到细菌播种的那天。
    7. 在细菌播种的当天, 预热一盘到37摄氏度, 然后用无菌循环将细菌纹在盘子上。把盘子放在37摄氏度的恒温箱里过夜。
  2. 用荧光加纳单叶蔓荆凝集素和阴性染色与荧光螺旋蜗牛凝集素 (动脉内皮细胞的标记) 进行阳性染色, 验证 PMVEC 纯度。整除细胞并在液氮中冷冻。
  3. 在实验中, 维持 Dulbecco 的改良鹰培养基 (DMEM) 中的细胞补充10% 胎牛血清, 并在37摄氏度孵化器中生长细胞, 含 5% CO2。使用 5-15 通道上的细胞。
    1. 对于生成的细胞毒性上清液, 板 2 x 106细胞成单独的 150 cm 菜肴和成长为 3-4 天, 直到汇合达到。每个实验使用两个盘子 (见下文)。
    2. 为分析细胞毒性上清液, 板 1 x 105细胞成一个6井盘的个体井并且增长四天直到汇合达到。
  4. 要生产上清, 洗一 PMVECs 的两个150厘米菜肴之一从步骤1.3.1 与磷酸盐缓冲盐水, 胰蛋白酶处理, 然后计数的细胞 (我们使用一个自动单元计数器, 并按照制造商的协议; 见材料表)。用汉克的平衡盐溶液 (HBSS) 洗另一盘 PMVECs, 然后用任一株铜绿假单胞菌感染20:1。实现方式如下:
    1. 对于铜绿假单胞菌, OD540 0.25 = 2 x 108 CFUs/毫升。要准备这种稀释, 添加1毫升 HBSS 到1毫升一次性试管。在步骤1.1 中所准备的板上刮出足够的细菌, 直到使用分光光度计测量540的0.25。下一步将提供一个计算多少细菌将需要。
    2. 一旦确定了培养皿中的 PMVECs 数量 (上面的步骤 1.4), 确定了适当数量的细菌添加到第二个, 非 trypsinized 培养皿中含有 PMVECs。例如, 如果确定 PMVECs 的培养皿包含 1.3 x 107细胞, 则准备 1.3 x 107细胞 x 20 细菌/细胞 x 1 mL/2 x 108 CFUs = 1.3 毫升细菌。
    3. 将1.3 毫升的细菌稀释成 HBSS 的最后体积20毫升, 使整个表面的150厘米的盘子可以被液体覆盖, 然后将稀释的细菌添加到 PMVECs 的盘子里。
    4. 孵化的 PMVECs 接种的细菌在 5% CO2孵化器37°c 为 4-5 h, 直到缝隙可以看到形成在细胞单层时, 显微镜观察 (见图 1为适当水平的差距形成)。
    5. 收集上清, 然后离心机10分钟在 2000 x g 在一个台式离心机去除细胞碎片。
      注: 任何能够产生足够的 g 力的表顶离心机 unlysed 细胞和大细胞碎片可用于这一步骤。
    6. 将上清液倒入装有0.2 µm 过滤器的注射器上, 然后通过过滤器将上清液移除细菌。
    7. 使用整除的无菌上清液测试细胞毒性 (见 2.1), 并冻结其余的上清在-80 °c, 以供将来使用。

2. 细胞毒性上清液分析

  1. 细胞毒性试验
    1. 在6井的菜肴中生长 PMVECs 直到汇合。用 HBSS 洗井一次, 然后添加1.5 毫升的过滤灭菌上清 (从 PA103 或∆PcrV 接种的细胞收集) 到个别水井。将无菌 HBSS 添加到另一个井中作为阴性对照。
    2. 将该板块放入 CO2孵化器中 21-24 小时, 然后观察细胞杀伤/细胞毒性 (见下一步)。使用上清液的细胞毒性进行进一步的实验, 并丢弃那些不显示细胞杀戮。
    3. 细胞杀伤的定量
      1. 利用商用 LDH 检测试剂盒和制造商推荐的程序, 测定死细胞中乳酸脱氢酶 (LDH) 的释放。
      2. 或者, 用 ImageJ 软件量化细胞杀伤。为此, 记录了含有完整细胞的培养皿的显微图像和区域, 然后使用自定义 ImageJ (国家卫生研究院) 宏量化缺乏细胞的区域 (用单层表示细胞死亡) (参见补充编码文件).如果需要, 请手动执行宏步骤, 如下所示:
        1. 输入图像 (RGB 或 Tiff 格式) 到宏中, 并调整对比度为15% 饱和像素。复制对比度调整图像, 并执行 "减去背景" 命令, 以获得在视野内的细胞和间隙区域的高对比度图像。
        2. 从原始图像中减去此图像, 并使用图像计算器 "和" 功能将生成的图像与原始图像相结合。将结果图像转换为黑色 (空白) 和白色 (单元格) 掩码, 具有阈值函数 (最小 0, 最大值 5), 并使用 "二进制腐蚀" 函数从图像中移除噪音。
        3. 使用 "区域分数" 度量测量生成图像内的黑色和白色像素的比例。绘制和表达每个处理时间点的分数区域作为最大间隙面积的百分比。
        4. 计算方法和比较使用单向方差分析与 Tukey 的后专项测试, p值小于0.05 被认为是重要的。
    4. 利用应用免疫印迹分析建立淀粉样蛋白、寡聚头和 Aβ在培养上清液中的存在。使用标准程序10、11、12进行应用免疫印迹分析, 但在电泳前至少有10倍的浓缩培养上清液。
      1. 要集中上清液, 将 1-2 毫升的上清液放入离心过滤器单元, 其膜的分子量为 10 kDa。然后, 将过滤单元放入工作台顶部离心机和离心机 2000 x 克, 直到达到所需浓度 (通常为 45-60 分钟)。
      2. 确定浓缩清液11中的蛋白质含量, 并将等量的样品装入凝胶的单个水井中。
      3. 运行凝胶, 转移蛋白质到硝化棉, 然后探针印迹与 A11 抗淀粉样蛋白抗体, T22 抗寡聚头抗体, 或 MOAB2 抗 Aβ抗体, 其次是适当的二级抗体。使用标准化学发光程序来开发印迹。
    5. 为了进行 thioflavin t 检测, 使用 thioflavin t 荧光法对上清液中的 amyloids 进行量化。对于这些测量, 使用过滤灭菌上清液。
      1. 通过将8毫克 thioflavin t (thioflavin) 悬浮到10毫升磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中, 准备一份库存溶液 (50x)。混合后, 通过0.22 µm 过滤器过滤溶液以去除微粒。
      2. 对于测量, 在1毫升分光光度计试管中添加20µL 的股票到1毫升 PBS。将稀释后的样品放入 spectrofluorimeter。
      3. 测量基线荧光发射使用425毫微米激发和扫描荧光发射从450-575 毫微米在2毫微米增量。
      4. 使用 425 nm 激发和 482 nm 发射进行时间推移扫描, 数据在六十年代每0.2 秒获得一次。
      5. 初始二十年代的时间推移扫描措施荧光在空白试管。在二十年代, 暂停扫描, 并添加10µL 过滤消毒上清到试管。通过反转混合试管, 然后再放回 spectrofluorimeter。
      6. 恢复基于时间的扫描, 获取数据的最后四十年代。
      7. 完成定时扫描后, 使用相同的设置进行最终的荧光发射频谱扫描, 如2.1.5.3 中详细说明。

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结果

本文建立了一种简单的体外检测方法, 用于检测上清液菌感染的细胞中是否存在细胞毒素. 基本上, 细菌添加后, 从感染细胞中采集到的培养基为4小时, 细菌通过培养基上清液的过滤杀菌去除, 然后将无菌上清液添加到新的细胞群中。细胞被观察 21-24 小时在增加上清和细胞杀害以后被定量。

将铜绿假单胞菌添...

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讨论

在这里, 概述了简单的体外方法, 可以证明在感染时产生细胞毒性 amyloids 的生物。这些方法包括细胞培养毒性试验、免疫印迹法、定量的细胞杀死使用一种新的显微方法, 并具有约束力。对细胞毒性剂的分析表明, 它们是淀粉样蛋白 (图 2 和图 4), 并表现出朊病毒12的特征。在肺炎期间, 细胞毒性朊病毒分子的生成为肺...

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披露声明

没有报告。

致谢

这项研究由 NIH 授予 HL66299、RB、SL、HL60024 到 ts 和 HL136869 到 MF 的部分资金。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Rabbit anti beta amyloidThermo71-5800
A11 amyloid oligomer antibodyStressMarqSPC-506D
T22 anti-tau oligomer antibodyEMD MilliporeABN454
Thioflavin TSigma AldrichT3516
HBSSGibco14025-092
PBSGibco10010-023
0.22 micron syringe filtersMilliporeSLGP033RS
DMEMGibco11965-092
HRP Goat antirabbit IgGAbcamab6721-1
Strains PA103 and ΔPcrVThese strains of P. aeruginosa were obtained from Dr. Dara Frank, University of Wisconsin Medical College, Milwaukee, WI
FITC Griffonia lectinSigma AldrichL9381
TRITC Helix pomatia lectinSigma AldrichL1261
AgarFisherBP1423-500
0.22 micron nitrocelluloseBioRad162-0112
Type 2 collagenaseWorthingtonLS004176
Fetal bovine serumHycloneSH30898.03IH
PenStrepGibco15070063
Carbenicillin Disodium saltSigma C1389
Microcetrifugation concentrators- 10,000 MW cut-offMilliporeUFC801008
Potassium phosphate dibasicSigma 795496-500G
Magnesium phosphate heptahydrateMP BiomedicalsMP021914221
Citric AcidG Biosciences50-103-5801
Sodium phosphate dibasic heptahydrateSigmaS9506-500G
Countess Automated Cell CounterInvitrogenC10277

参考文献

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