検出細胞毒性アミロイド次感染症の肺による内皮細胞緑膿菌法

要約

簡単な方法は、緑膿菌による肺血管内皮細胞の感染細胞傷害性のアミロイドの生産の「論証の説明します。

要約

生き残る肺炎患者は、退院後数ヶ月で死亡率を上昇しています。肺炎肺組織の感染結果後続エンド臓器不全につながることができる長寿命の cytotoxins の生産をえられています。肺感染症の中に cytotoxins が生産されている仮説をテストするための in vitroアッセイを開発しました。ラット肺血管内皮細胞と細菌緑膿菌をモデル システムとして使用され、続いて細胞培養を用いた細菌による内皮細胞の伝染に続く cytoxins の生産を示す乳酸脱水素酵素アッセイと ImageJ 技術を活用した新規顕微鏡法を用いた直接定量から。これらの cytotoxins のアミロイドの性質を示した thioflavin T 結合の試金、イムノブロットおよび A11 抗アミロイド抗体を用いた immunodepletion。イムノブロット分析は、オリゴマー タウと a β が制作され膿によって感染内皮細胞が発表したことを示した。これらのメソッドは、ひと臨床サンプルの解析に容易に適応する必要があります。

概要

肺炎を生き残るための患者は次の病院退院^1,ヶ月で死亡率を上昇している^2,3,4,5,6。ほとんどの場合、死は、ストローク^5,6と同様、腎、肺、心臓を含むエンド臓器不全や肝のイベントのいくつかのタイプで発生します。この患者集団で高い死亡率の原因は確立されていません。

肺炎がコミュニティ買収されるどちらかとして分類されるまたは院内 (院内)、および肺炎を引き起こすことができるエージェントは、細菌、ウイルス、菌類および化学薬品。院内肺炎の主要な原因の 1 つは緑膿菌です。膿はタイプ III の分泌システムを使用して、ターゲット セル^7,8の細胞質に直接 exoenzymes と呼ばれる、様々 なエフェクター分子を転送するグラム陰性生物です。肺血管内皮細胞の感染、時に、exoenzymes は微小管関連蛋白タウ^{9,10、11,12 の内皮のフォームを含む、各種の細胞内タンパク質をターゲットします。}、肺機能と、多くの場合、死に低下した重度の肺浮腫の結果血管内皮バリア破壊に至る、です。

前述したように、初期の肺炎を生き残るための患者は退院後最初の 12 ヶ月で死亡率を上昇しています。この現象を説明するための潜在的なメカニズムは、長期的な予後につながる初期の感染時に長命毒素のいくつかの種類が生成されることです。2 つの観測は、この可能性をサポートします。膿と最初に扱われる最初、培養肺血管内皮細胞は、細菌が抗生物質¹³によって殺された後の週までの増殖に失敗します。第二に、長命のプリオンとプリオンの特性を持つエージェントは、様々 な人間や動物疾患、特に病気に関連付けられている神経系^14,15で実証されています。

肺感染症の中に長寿命の細胞毒性薬の潜在的な生産の調査の方法を記載されていること。ここで簡単な生体外の試金のシリーズのとおりグリコプロテイン生産と一般的なエージェントの肺炎原因、膿を使用して感染活動を調査するために使用できます。これらの試金は調査可能グリコプロテイン誘導感染、肺炎を引き起こす他のエージェントを使用して、次に容易に適応する必要があり、生成される清面も全部 cytotoxins の効果を調査するため役に立つはず臓器や動物。最後に、ここで最も可能性の高い説明は、アッセイは肺炎の中に cytotoxins の生産のための動物と人間の体液をテストに適応可能であります。

プロトコル

動物のすべてのプロシージャを行った機関と動物ケア委員会南アラバマ大学によって承認し、すべての連邦、州、およびローカル規則に従って行われました。初代培養ラット肺微小血管内皮細胞 (PMVECs) の肺生物学南アラバマ大学センターで細胞培養コアから得られました。前に説明した手順¹⁶を使用して電池を作製しました。

1. 細胞培養上清の世代

注: ここで、我々 は緑膿菌の 2 つの異なる系統使用: PA103 標的細胞に感染、およびタイプ III の分泌システムに欠けている、∆PcrV の中に ExoU と ExoT exoenzymes を転送することができるそのままタイプ III 分泌システムを持っています。exoenzymes を接種対象セルに転送することができません。

1. フォーゲル ボナー (VB) 寒天培地プレート¹⁷に細菌を連勝し、37 ° C で一晩成長
   1. プレートを準備するように次の原液 (フォーゲル ボナー塩; 10 x の在庫): 2 g MgSO₄、20 g のクエン酸の酸 (遊離酸)、100 g K₂PO₄、および 35 g NaH₂PO₄を測定します。1 L と低速排気で 15 分間オートクレーブに ddH₂O を追加します。
   2. 450 mL ddH₂O で 7.5 g の寒天と上記としてオートクレーブを配置します。
   3. オートクレーブ、次クールに 50 ° C の水浴に両方のソリューションを配置します。
   4. 寒天に 10 x VB ストック塩溶液 50 mL を追加します。
   5. (使用されている膿の系統) の 400 μ g/mL に carbenicillin を追加し、フラスコを旋回でよく混ぜます。
   6. 個々 の無菌培養皿に VB の寒天液の場所 5 mL は、固化し、細菌の播種日まで 4 ° C で保存する寒天を許可します。
   7. 細菌の播種日前 37 ° c のプレートを温めるし、プレート滅菌ループを使って細菌を連勝します。37 ° C の定温器のプレートの場所は一晩します。
2. 肯定的な染色蛍光グリフォニア simplicifolia PMVEC 純度を確認レクチンおよび否定的な汚損蛍光リンゴマイマイレクチン (血管内皮細胞のマーカー)。細胞分注、液体窒素で凍結。
3. 実験用セル ダルベッコ変更されたワシの媒体 (DMEM) 10% 牛胎児血清を添加したを維持し、5% CO₂を含む 37 の ° C の定温器で細胞を成長します。5-15 の通路でセルを使用します。
   1. 細胞培養上清の世代、個々 の 150 cm 皿に 2 x 10 の⁶セルをプレート、合流点を達成するまで 3-4 日の拡張します。2 枚実験 (下記参照) を使用します。
   2. 、細胞培養上清の分析プレート 1 × 10⁵セル 6 ウェルの個々 の井戸には皿し、合流が達成されるまで 4 日間の成長します。
4. 上清を生成するリン酸緩衝生理食塩水でステップ 1.3.1 から PMVECs の 2 つの 150 cm の料理の一つ、trypsinize、洗ってその後セルをカウント (我々 は、自動化された細胞カウンターを使用して、製造元のプロトコルに従う;材料の表を参照してください)。PMVECs とハンクのバランスの取れた塩ソリューション (HBSS) の他の皿を洗って、20:1 の感染 (MOI) の多様性で膿のいずれかの株に感染してしまいます。これは、次のとおり達成されます。
   1. 膿の₅₄₀ 0.25 = 2 × 10⁸ CFUs/mL を OD します。この希釈を準備するには、1 mL の使い捨てのキュベットに 1 mL HBSS を追加します。分光光度計を使用して測定したとき、0.25 の外径₅₄₀が得られるまで手順 1.1 で準備されたプレートから十分な細菌をこすり。次のステップは、細菌が必要とどのくらいの計算になります。
   2. 培養皿の PMVECs の数が決定される (1.4 上記の手順)、適切な PMVECs を含む 2 番目、非トリプシン培養皿に追加する細菌数を決定します。たとえば、PMVECs の培養皿は 10 の⁷セル x 1.3 が含まれているし、1.3 × 10⁷セル x 20 細菌/携帯 x 1 mL/10⁸ CFUs の準備と判断された場合は、1.3 mL の細菌を = します。
   3. 20 mL の最終巻には HBSS に細菌の 1.3 mL を希釈する、150 センチメートルの皿の表面全体液で覆われることができますし、PMVECs のプレートに希釈した細菌を追加します。
   4. プレートは、顕微鏡で観察するときセル単分子膜の形成、ギャップを見ることができるまで、4-5 時間 5% CO₂インキュベーターで 37 ° C で細菌を接種した PMVECs (ギャップ形成の適切なレベルを参照してください図 1 ) 孵化させなさい。
   5. 、上清を収集し、細胞の残骸を削除する卓上遠心分離機で 2,000 x g で 10 分間遠心します。
      注: 十分な g を生成することができる任意のテーブル トップ遠心強制ペレット unlysed 細胞及び大細胞断片はこの手順で使用できるには。
   6. 上清を上澄みの細菌を除去するフィルターを通過し、その末尾に添付 0.2 μ m フィルターを持つ注射器に注ぐ。
   7. 無菌培養上清の因数を使用して細胞毒性をテスト (2.1 を参照) し、将来使用するため-80 ° C で培養上清の残りの部分を凍結します。

2. 細胞培養上清の分析

1. 細胞毒性の試金
   1. 合流点まで 6 よく料理の PMVECs を成長します。洗浄井戸一度 HBSS で追加 1.5 mL (どちらか PA103 または ∆PcrV 接種の細胞採取) フィルター滅菌培養上清の個々 の井戸。また一つに陰性対照として滅菌 HBSS を追加します。
   2. 21-24 h の CO₂インキュベーターにプレートを配置し、セル殺害/細胞毒性のための観察 (次の手順を参照してください)。さらに実験のため細胞毒性を示す培養上清を使用し、細胞の殺害を表示しないものを破棄します。
   3. セル殺害の定量
      1. 市販の LDH アッセイ キットと製造元を使用して死んだ細胞からメジャー乳酸脱水素酵素 (LDH) のリリースでは、手順をお勧めします。
      2. また、顕微鏡的 ImageJ ソフトウェアを使用してセル殺害を定量化します。このため、顕微鏡画像とそのままセルを含む培養皿のエリアを記録、セル (単層の細胞死を示す) に欠けている地域を定量化するカスタム ImageJ (健康の国民の協会) マクロ (を参照してくださいのコーディングの補足ファイルを使用).必要な場合は、手動で次のようにマクロのステップを実行します。
         1. マクロに画像 (RGB または Tiff 形式) を入力し、15% 飽和ピクセルのコントラストを調整します。コントラスト調整後の画像を複製し、ビューのフィールド内のセルとギャップ領域のコントラストの高い画像を得る「背景を引く」コマンドを実行します。
         2. 元のイメージからこのイメージを減算し、イメージ電卓"AND"関数を使用して元のイメージと結果のイメージを結合します。ブラック (ギャップ) と白 (セル) マスク (最低 0、最大 5) しきい値関数を得られる画像に変換し、画像からノイズを除去する「バイナリをむしばむ」関数を使用します。
         3. 「面積率」測定結果のイメージ内の白いピクセルを黒の比率を測定します。プロットし、最大ギャップ領域の % として各治療時点の小数のエリアを表現します。
         4. 手段を計算し、テューキー事後テストで重要と見なされる 0.05 未満のp値と、一方向の分散分析を使用して比較します。
   4. 培養上清中の a β オリゴマー タウ、アミロイドのプレゼンスを確立するのにイムノブロット解析を使用します。標準的な手順^10、11,12、電気泳動前に、少なくとも 10 倍培養上清を集中以外を用いたイムノブロット解析を実行します。
      1. 上清を集中、その膜が 10 kDa の分子量カットオフ遠心フィルター ユニットに 1-2 mL の培養上清を配置します。その後、フィルター ユニットを配置テーブル トップ遠心分離機、遠心分離 2,000 x に g まで濃度の必要度は達成 (通常 45-60 分)。
      2. ¹¹濃縮培養上清中のタンパク質の量を決定し、ゲルの個々 の井戸にサンプルの同量を読み込みます。
      3. ゲルを実行し、硝酸セルロースに蛋白質を転送、A11 抗アミロイド抗体、T22 反オリゴマー タウ抗体または適切な二次抗体に続いて MOAB2 抗 a β 抗体でしみをプローブします。化学発光の標準的なプロシージャを使用してしみを開発します。
   5. Thioflavin T アッセイを行う、上清中にアミロイドを定量化するのに蛍光 thioflavin T (ThT) を使用します。これらの測定はフィルター滅菌培養上清を使用します。
      1. 10 mL のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) に 8 mg thioflavin T (ThT) を停止することによって thioflavin T の原液 (50 倍) を準備します。混合した後、粉じんを除去する 0.22 μ m のフィルターを通してソリューションをフィルターします。
      2. 測定は、1 mL の PBS で 1 mL 分光光度計のキュベットに ThT 株式の 20 μ L を追加します。希釈したサンプルを蛍光測定装置に配置します。
      3. 425 nm 励起 2 nm 刻みで 450-575 nm の蛍光性の放出をスキャンしてベースライン蛍光発光を測定します。
      4. 425 nm 励起を用いたコマ撮りのスキャンを実行し、482 nm 発光、データ取得ごとの 0.2 s 60 s。
      5. 初期の 20 コマのスキャンの s 対策空白キュベットで蛍光します。20 s、スキャンを一時停止し、フィルター滅菌清 10 μ L をキュベットに追加。逆解析によるキュベットをミックスし、蛍光測定装置に置きます。
      6. 再開最終 40 を取得、時間ベースのスキャン データの s。
      7. コマのスキャンが完了したら、2.1.5.3 の詳細として同一の設定を使用して最終的な蛍光発光スペクトル スキャンを実行します。

結果

簡単な生体外の試金は、緑膿菌に感染細胞の上清中に cytotoxins の存在を試金するためにしました。基本的には、感染細胞から培養液、細菌の添加後 4 h を収集、細菌、培養上清、フィルター殺菌によって削除されます、無菌培養上清がセルの新しい人口に追加されます。細胞上清添加後に 21-24 時間観察し、細胞の殺害を定量化します。

ディスカッション

ここでは、簡単な培養方法の生物を引き起こす肺炎感染中の細胞毒性アミロイドの生成のデモンストレーションをするとおりです。これらのメソッドは、細胞培養の細胞毒性の試金、免疫ブロット、顕微鏡法と ThT バインドを使って細胞の定量。細胞毒性薬の分析を示した (図 2 と図 4) は本質的にアミロイドが、プリオンの

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rabbit anti beta amyloid	Thermo	71-5800
A11 amyloid oligomer antibody	StressMarq	SPC-506D
T22 anti-tau oligomer antibody	EMD Millipore	ABN454
Thioflavin T	Sigma Aldrich	T3516
HBSS	Gibco	14025-092
PBS	Gibco	10010-023
0.22 micron syringe filters	Millipore	SLGP033RS
DMEM	Gibco	11965-092
HRP Goat antirabbit IgG	Abcam	ab6721-1
Strains PA103 and ΔPcrV			These strains of P. aeruginosa were obtained from Dr. Dara Frank, University of Wisconsin Medical College, Milwaukee, WI
FITC Griffonia lectin	Sigma Aldrich	L9381
TRITC Helix pomatia lectin	Sigma Aldrich	L1261
Agar	Fisher	BP1423-500
0.22 micron nitrocellulose	BioRad	162-0112
Type 2 collagenase	Worthington	LS004176
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30898.03IH
PenStrep	Gibco	15070063
Carbenicillin Disodium salt	Sigma	C1389
Microcetrifugation concentrators- 10,000 MW cut-off	Millipore	UFC801008
Potassium phosphate dibasic	Sigma	795496-500G
Magnesium phosphate heptahydrate	MP Biomedicals	MP021914221
Citric Acid	G Biosciences	50-103-5801
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Sigma	S9506-500G
Countess Automated Cell Counter	Invitrogen	C10277