Methoden zur Erkennung von zytotoxischen amyloiden folgende Infektion der pulmonalen Endothelzellen durch Pseudomonas aeruginosa

Zusammenfassung

Einfache Methoden sind für den Nachweis der Produktion von zytotoxischen amyloide nach Infektion der Lunge Endothel von Pseudomonas Aeruginosabeschrieben.

Zusammenfassung

Patienten, die überleben, Lungenentzündung erhöht Sterberaten in den Monaten nach Krankenhaus entlassen. Es ist vermutet worden, dass Infektion des Lungen-Gewebes während der Lungenentzündung führt bei der Herstellung von langlebigen ZELLGIFTE, die nachfolgende Ende Organversagen führen kann. Wir haben in-vitro- Tests um die Hypothese zu testen, während pulmonale Infektion entstehen ZELLGIFTE entwickelt. Isolierte Ratte pulmonalen Endothelzellen und das Bakterium Pseudomonas Aeruginosa dienen als Modellsysteme und die Produktion von Cytoxins nach Infektion der Endothelzellen durch Bakterien zeigt mit Zellkulturen, gefolgt von direkte Quantifizierung mit Laktat-Dehydrogenase Assays und eine neuartige mikroskopische Methode ImageJ-Technologie. Amyloid Artder diese ZELLGIFTE wurde durch Thioflavin T Bindung Assays und Immunoblotting und Immunodepletion mit A11 Anti-Amyloid Antikörper nachgewiesen. Weitere Analysen mittels Immunoblotting nachgewiesen, dass Oligomere Tau und Aβ wurden produziert und veröffentlicht von Endothelzellen nach Infektion durch p. Aeruginosa. Diese Methoden sollten leicht anpassbar an Analysen der menschlichen klinischen Proben sein.

Einleitung

Patienten, die eine Lungenentzündung zu überleben haben erhöhte Sterberaten in den Monaten nach Krankenhaus Entlastung^1,2,3,4,5,6. In den meisten Fällen tritt der Tod durch irgendeine Art von Ende-Organversagen einschließlich Nieren-, Lungen-, Herz-, oder Leber Veranstaltungen sowie Schlaganfall^5,6. Der Grund für die erhöhte Sterblichkeit bei dieser Patientengruppe wurde nie eingerichtet.

Als wird entweder ambulant erworbener Pneumonie eingestuft oder nosokomiale (nosokomiale) und Agenten, die Pneumonie verursachen können auch Bakterien, Viren, Pilze und Chemikalien. Eine der wichtigsten Ursachen der nosokomialen Pneumonie ist das Bakterium Pseudomonas Aeruginosa. P. Aeruginosa ist ein gramnegatives Organismus, der eine Typ-III-Sekretion-System verwendet, um verschiedene Effektor-Molekülen, genannt Exoenzymes, direkt in das Zytoplasma der Ziel-Zellen^7,8übertragen. Während der Infektion von pulmonalen endothelial Zellen gezielt die Exoenzymes verschiedene intrazelluläre Proteine, einschließlich eine endotheliale Form der Mikrotubuli-assoziierten Protein Tau^9,10,11,12 , was zu endotheliale Barriere Aufschlüsselung, was zu schweren Lungenödem, verringerte Lungenfunktion und oft zum Tod.

Wie bereits erwähnt, haben Patienten, die überleben die ersten Lungenentzündung Sterberaten in den ersten 12 Monaten nach Krankenhaus entlassen erhöht. Ein möglicher Mechanismus für die Erklärung dieses Phänomens ist, dass irgendeine Art von langlebigen Toxin während der anfänglichen Infektion entsteht, die schlechte Langzeitprognose führt. Zwei Beobachtungen unterstützen diese Möglichkeit. Erste, kultivierte pulmonale Endothelzellen, die ursprünglich mit p. Aeruginosa behandelt werden nicht für vermehren sich bis zu einer Woche nach der Bakterien durch Antibiotika¹³getötet werden. Zweite, langlebigen Prionen und Agenten mit Prion Eigenschaften wurden in verschiedene Krankheiten bei Mensch und Tier, insbesondere Erkrankungen im Zusammenhang mit dem Nervensystem^14,15nachgewiesen.

Methoden für die Prüfung der möglichen Produktion von langlebigen Zytostatika in pulmonale Infektion sind nie beschrieben worden. Hier werden eine Reihe von einfachen in-vitro- Tests beschrieben, die für die Untersuchung von Zytotoxin Produktion und Aktivität nach Infektion mit einem gemeinsamen Lungenentzündung verursachen Mittel, p. Aeruginosaverwendet werden. Diese Tests sollten leicht anpassungsfähig zu untersuchen mögliche Zytotoxin Induktion nach Infektion mit anderen Agenten, die Pneumonie verursachen, und die Überstände, die generiert werden sollte auch für die Untersuchung von Auswirkungen der ZELLGIFTE ganz nützlich sein Organe oder Tiere. Schließlich werden die Assays, die hier, am ehesten beschrieben werden anpassungsfähig, tierische und menschliche biologische Flüssigkeiten zur Herstellung von Zellgiften während einer Lungenentzündung zu testen.

Protokoll

Alle tierische Verfahren wurden überprüft und genehmigt durch die institutionelle und Animal Care Committee von der University of South Alabama und wurden in Übereinstimmung mit allen Bundes-, Landes- und lokalen Vorschriften durchgeführt. Primärkulturen von Ratte pulmonalen mikrovaskuläre Endothelzellen (PMVECs) wurden von der Zelle Kultur Core Facility der University of South Alabama Center für Lunge Biologie erhalten. Zellen wurden mit der zuvor beschriebenen Verfahren¹⁶zubereitet.

1. Generation von zytotoxischen Überstände

Hinweis: Hier verwenden wir zwei verschiedene Stämme von p. Aeruginosa: PA103, die verfügt über eine intakte Typ III-Sekretion in der Lage, die Exoenzymes ExoU und ExoT auf Zielzellen zu übertragen, während der Infektion und ∆PcrV, die einen Typ-III-Sekretion System fehlt und ist nicht in der Lage Exoenzymes auf Zielzellen nach Impfung zu übertragen.

1. Bakterien auf Vogel-Bonner (VB) Agar-Platten¹⁷ Streifen und wachsen über Nacht bei 37 ° C.
   1. Um Platten vorzubereiten, machen die folgenden Stammlösung (Vogel-Bonner Salze; 10 X Lager): 2 g MgSO₄, 20 g Zitronensäure (freie Säure), 100 g K₂PO₄und 35 g NaH₂PO₄zu messen. 1 L und Autoklaven für 15 min mit langsamen Auspuff DdH₂O hinzufügen.
   2. Platzieren Sie 7,5 g Agar in 450 mL DdH₂O und Autoklaven wie oben beschrieben.
   3. Legen Sie nach Autoklavieren beide Lösungen in ein Wasserbad von 50 ° C abkühlen lassen.
   4. 50 mL der 10 X VB Salz Vorratslösung zu Agar hinzufügen.
   5. 400 µg/mL (für die Stämme von p. Aeruginosa verwendet wird) Carbenicillin hinzu und mischen Sie gut durch Schütteln der Flasche.
   6. Platz 5 mL der VB-Agar-Lösung in einzelnen sterilen Kultur Gerichte erlauben das Agar zu festigen, und dann bei 4 ° C bis zum Tag der bakterielle Aussaat aufbewahren.
   7. Am Tag der bakterielle Aussaat wärmen Sie eine Platte auf 37 ° C vor und dann Streifen Sie Bakterien auf die Platte mit einer sterilen Schleife. Ort der Platte in einem Inkubator 37 ° C über Nacht.
2. PMVEC Reinheit überprüfen, indem Sie positive Färbung mit fluoreszierenden Griffonia Simplicifolia Lektine und negative Färbung mit fluoreszierenden Helix Pomatia Lektin (ein Marker für arterielle Endothelzellen). Aliquoten Zellen und Einfrieren in flüssigem Stickstoff.
3. Pflegen Sie für Experimente Zellen in Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) ergänzt mit 10 % fötalen Rinderserum und wachsen Sie Zellen in einem 37 ° C Inkubator mit 5 % CO₂. Verwenden Sie Zellen bei Passagen 5-15.
   1. Für die Erzeugung von zytotoxischen Überstände Platte 2 x 10⁶ Zellen in einzelne 150 cm Gerichte und wachsen für 3-4 Tage bis Zusammenfluss erreicht ist. Verwenden Sie zwei Platten pro Experiment (siehe unten).
   2. Für die Analyse von zytotoxischen Überstände Platte 1 x 10⁵ Zellen in einzelnen Vertiefungen eines 6-gut austeilen und für vier Tage, bis Zusammenfluss erreicht wird wachsen.
4. Um überstand zu produzieren, eines der zwei 150 cm Gerichte des PMVECs aus Schritt 1.3.1 mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung waschen, trypsinize und dann zählen die Zellen (wir verwenden einen automatisierte Zelle Zähler und Folgen des Herstellers Protokoll; sehen Sie Tabelle der Materialien). Das andere Gericht des PMVECs mit Hank es ausgewogen Salz Lösung (HBSS) waschen und dann mit beiden Stamm von p. Aeruginosa bei einer Vielzahl von Infektionen (MOI) von 20:1 zu infizieren. Dies wird folgendermaßen erreicht:
   1. Für p. Aeruginosa, OD₅₄₀ 0,25 = 2 x 10⁸ KBE/mL. Zur Vorbereitung dieser Verdünnung fügen Sie 1 mL HBSS eine 1 mL-Einweg-Küvette hinzu. Kratzen Sie genug Bakterien aus der Platte, die in Schritt 1.1 vorbereitet wurde, bis ein OD-₅₄₀ von 0,25 erreicht ist, wenn mit einem Spektralphotometer gemessen. Im nächste Schritt wird eine Berechnung der wieviel Bakterien benötigt werden bieten.
   2. Sobald die Anzahl der PMVECs in der Kulturschale bestimmt ist (Schritt 1.4 oben), bestimmen die entsprechende Anzahl von Bakterien, die zweite, nicht trypsiniert Kulturschale mit der PMVECs hinzugefügt werden soll. Beispielsweise, wenn feststeht, dass der Kulturschale PMVECs 1,3 x 10⁷ Zellen enthält, dann bereiten Sie 1,3 x 10⁷ Zellen X 20 Bakterien/Zelle X 1 mL/2 x 10⁸ KBE = 1,3 mL Bakterien.
   3. Verdünnen Sie die 1,3 mL Bakterien in HBSS zu einem Endvolumen von 20 mL, so dass die gesamte Oberfläche des einen 150 cm Schüssel kann mit Flüssigkeit bedeckt sein, dann fügen Sie die verdünnten Bakterien auf die Platte des PMVECs.
   4. Die PMVECs beimpft mit den Bakterien bei 37 ° C in einem 5 % CO₂ Inkubator für 4-5 Std. bis Lücken zu sehen in der Zelle monomolekularen Film bilden, wenn die Platte mikroskopisch beobachtet wird (siehe Abbildung 1 für die richtige Ebene der Spaltbildung) inkubieren.
   5. Den überstand zu sammeln, dann Zentrifugieren für 10 min bei 2.000 x g in einer Tischplatte Zentrifuge, zelltrümmer zu entfernen.
      Hinweis: Jede Tischplatte Zentrifuge in der Lage, erzeugen ausreichend g zwingen, pellet-unlysed Zellen und großzellige Fragmente können für diesen Schritt verwendet werden.
   6. Gießen Sie den überstand in eine Spritze, die einen 0,2 µm-Filter angebracht zu seinem Ende, dann den Überstand durch den Filter zu entfernen Bakterien übergeben hat.
   7. Verwenden Sie ein Aliquot des sterilen Überstands Zytotoxizität zu testen (siehe 2.1) und den Rest des Überstands bei-80 ° C zur späteren Verwendung einfrieren.

2. Analyse der zytotoxischen Überstände

1. Zytotoxizität Assay
   1. PMVECs in 6-Wohlen Teller bis Zusammenfluss wachsen. Wash-Brunnen hinzufügen, einmal mit HBSS, dann 1,5 mL Filter sterilisiert überstand (gesammelt von entweder geimpft PA103 oder ∆PcrV Zellen) individuelle Vertiefungen. Geben Sie sterile HBSS in einem anderen als Negativkontrolle.
   2. Legen Sie die Platte in den CO-₂ -Inkubator für 21-24 h, dann Zelle Tötung/Zytotoxizität zu beobachten (siehe nächster Schritt). Überstände, die Zytotoxizität für weitere Experimente zeigen, und verwerfen Sie die Zelle Tötung nicht angezeigt werden.
   3. Quantifizierung der Zelle Tötung
      1. Maßnahme Laktat-Dehydrogenase (LDH) Entlassung aus abgestorbenen Zellen, die mit im Handel erhältlichen LDH-Assay Kits und des Herstellers empfohlenen Verfahren.
      2. Alternativ zu quantifizieren Zelle Tötung mikroskopisch mit ImageJ-Software. Dafür, mikroskopische Aufnahmen und Bereichen der Kulturschale mit intakten Zellen aufnehmen, dann quantifizieren Regionen fehlen Zellen (indikativ für Zelltod in einem monomolekularen Film) mit einem benutzerdefinierten ImageJ (National Institutes of Health)-Makro (siehe zusätzliche Codierung Datei ). Falls gewünscht, führen Sie das Makro Schritte manuell wie folgt:
         1. Bilder (RGB oder Tiff-Format) in das Makro eingegeben und Kontrast auf 15 % gesättigt Pixel. Doppelte Bilder Kontrast angepasst und führen Sie den Befehl "Subtrahieren Hintergrund", um ein kontrastreiches Bild der Zelle und Lücke in das Blickfeld zu erhalten.
         2. Dieses Bild aus dem Originalbild abziehen und das resultierende Bild mit dem Originalbild mit dem bildrechner "Und"-Funktion kombinieren. Konvertieren Sie das resultierende Bild in schwarz (Lücken) und weiß (Zellen) Maske mit der Schwelle-Funktion (mindestens 0, maximal 5), und verwenden Sie die Funktion "Binär untergraben" Lärm aus dem Bild entfernen.
         3. Messen Sie das Verhältnis von Schwarz bis weiße Pixel innerhalb des resultierenden Bildes mit "Bereich Bruchteil" Messung. Plotten und gebrochene Bereiche für jeden Zeitpunkt der Behandlung als Prozent der maximalen Spaltbereich äußern.
         4. Berechnen Sie Mittel zu und vergleichen Sie mit One-Way ANOVA mit Tukey post-hoc-Test, mit p -Werte weniger als 0,05 als bedeutende.
   4. Verwenden Sie Immunoblot Analyse auf um das Vorhandensein von Amyloid, Oligomere Tau und Aβ in Kultur Überstände zu etablieren. Durchführen Sie Immunoblot Analyse mit Standardverfahren^10,11,12, mit Ausnahme der Konzentration Kultur Überstände mindestens 10-divisibel vor der Elektrophorese.
      1. Überstand zu konzentrieren, legen Sie 1 bis 2 mL des Überstandes in eine Zentrifugation-Filter-Einheit, deren Membran ein Molekulargewicht Cut-off von 10 kDa hat. Dann setzen Sie die Filtereinheit in eine Tischplatte Zentrifuge und Zentrifuge bei 2.000 x g bis die nötige Konzentration ist erreicht (in der Regel 45-60 min).
      2. Bestimmen Sie die Menge des Proteins in der konzentrierten überstand¹¹ und laden Sie gleiche Mengen von Proben in einzelnen Vertiefungen des Gels zu.
      3. Gele laufen dann Sonde Blots mit A11 Anti-Amyloid Antikörper, T22 Anti-Oligomere Tau Antikörper oder MOAB2 Anti-Aβ Antikörper, gefolgt von entsprechenden Sekundärantikörper Proteine auf Nitrozellulose übertragen. Die Flecken mit standard Chemilumineszenz-Verfahren zu entwickeln.
   5. Verwenden Sie ein Thioflavin T Assay Thioflavin T Fluoreszenz (ThT), um amyloide in Überstände zu quantifizieren. Verwenden Sie für diese Messungen Filter sterilisiert Überstände.
      1. Bereiten Sie eine Stammlösung (50 X) von Thioflavin T die Aussetzung von 8 mg Thioflavin T (ThT) in 10 mL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Nach dem Mischen, Filtern Sie die Lösung durch einen 0,22 µm-Filter, Partikel zu entfernen.
      2. Fügen Sie für Messungen 20 µL der ThT-Lager zu 1 mL PBS in einer 1 mL-Spektralphotometer-Küvette hinzu. Legen Sie die verdünnte Probe in einem Spectrofluorimeter.
      3. Die Baseline-Fluoreszenz-Emission mit 425 nm Anregung und Scannen die Fluoreszenzemission von 450-575 nm in Schritten von 2 nm zu messen.
      4. Führen Sie einen Zeitraffer Scan mit 425 nm Anregung und 482 nm Emission mit Daten erworben jeden 0,2 s für 60 s.
      5. Die ersten 20 s der Zeitraffer Scan misst Fluoreszenz in der leere Küvette. Bei 20 s, den Scan anhalten und die Küvette 10 µL des Überstands Filter sterilisiert hinzufügen. Mischen Sie die Küvette durch Umkehrung und setzen Sie dann wieder in die Spectrofluorimeter.
      6. Wiederaufnahme den zeitbasierten Scan, Erwerb der letzten 40 s Daten.
      7. Durchführen Sie nach Abschluss des Time-Lapse Scans einen endgültigen Fluoreszenz Emissionsspektrum Scan mit identischen Einstellungen, wie in 2.1.5.3..

Ergebnisse

Eine einfache in-vitro- Test wurde entwickelt, um auf das Vorhandensein von Zellgiften in Überstände von Zellen infiziert mit dem Bakterium p. Aeruginosaassay. Grundsätzlich Kulturmedium aus infizierten Zellen ist 4 h nach bakteriellen Zugabe gesammelt, die Bakterien werden durch Filter Sterilisation der Überstand Kultur entfernt und dann der sterile Überstand wird hinzugefügt, um eine neue Population von Zellen. Die Zellen sind dann 21-24 h nach der Zugabe des Üb...

Diskussion

Hier werden einfache in-vitro- Methoden beschrieben, die Demonstration der Generation von zytotoxischen amyloiden während der Infektion mit einer Lungenentzündung verursachen Organismus erlauben. Diese Methoden umfassen eine Zelle Kultur Zytotoxizität Assay, Immunoblotting, Quantifizierung der Zelle Tötung mit ein neues mikroskopische Verfahren und ThT Bindung. Analysen der Zytostatika haben gezeigt, dass sie Amyloid in der Natur (Abbildung 2 und

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rabbit anti beta amyloid	Thermo	71-5800
A11 amyloid oligomer antibody	StressMarq	SPC-506D
T22 anti-tau oligomer antibody	EMD Millipore	ABN454
Thioflavin T	Sigma Aldrich	T3516
HBSS	Gibco	14025-092
PBS	Gibco	10010-023
0.22 micron syringe filters	Millipore	SLGP033RS
DMEM	Gibco	11965-092
HRP Goat antirabbit IgG	Abcam	ab6721-1
Strains PA103 and ΔPcrV			These strains of P. aeruginosa were obtained from Dr. Dara Frank, University of Wisconsin Medical College, Milwaukee, WI
FITC Griffonia lectin	Sigma Aldrich	L9381
TRITC Helix pomatia lectin	Sigma Aldrich	L1261
Agar	Fisher	BP1423-500
0.22 micron nitrocellulose	BioRad	162-0112
Type 2 collagenase	Worthington	LS004176
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30898.03IH
PenStrep	Gibco	15070063
Carbenicillin Disodium salt	Sigma	C1389
Microcetrifugation concentrators- 10,000 MW cut-off	Millipore	UFC801008
Potassium phosphate dibasic	Sigma	795496-500G
Magnesium phosphate heptahydrate	MP Biomedicals	MP021914221
Citric Acid	G Biosciences	50-103-5801
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Sigma	S9506-500G
Countess Automated Cell Counter	Invitrogen	C10277