Методы для обнаружения цитотоксических Амилоиды следующие инфекции из легочного эндотелиальных клеток, синегнойной палочки

Резюме

Простые методы описаны для демонстрации производство цитотоксических Амилоиды после инфицирования легочного эндотелия синегнойной палочки.

Аннотация

Пациенты, которые выживают пневмонии имеют повышенный уровень смертности в течение нескольких месяцев после выписки из больницы. Предположили, что инфекция легочной ткани при пневмонии приводит в производстве долгоживущих цитотоксины, которые могут привести к последующей конец полиорганной недостаточности. Мы разработали в vitro анализов для проверки гипотезы, что цитотоксины производятся при легочной инфекции. Изолированные крыса легочного эндотелиальных клеток и бактерий синегнойной палочки используются как модель системы, и производство cytoxins, после инфицирования эндотелиальных клеток бактерий подтверждается с помощью клеточной культуры следуют прямые количественный, используя лактатдегидрогеназа анализов и Роман микроскопического метода ImageJ технологии. Амилоидоподобные характер этих цитотоксины был продемонстрирован Тиофлавин Т привязки анализов и immunoblotting и immunodepletion, с использованием антител анти амилоид A11. Дальнейший анализ с использованием immunoblotting продемонстрировал подготовлены и выпущенная эндотелиальных клеток после заражения P. aeruginosaолигомерных Тау и значения. Эти методы должны быть легко адаптирован для анализа человеческого клинических образцов.

Введение

Пациенты, которые выживают пневмонии имеют повышенный уровень смертности в течение нескольких месяцев после больницы разряда^1,2,3,4,5,6. В большинстве случаев смерти происходит некоторый тип конца полиорганной недостаточности, в том числе почек, легких, сердца, или печени события, а также ход^5,6. Причиной повышенной смертности в этой популяции пациентов никогда не было установлено.

Пневмония классифицируется как приобретается либо сообщества или внутрибольничной (внутрибольничные) и агенты, которые могут вызвать пневмонию включают бактерии, вирусы, грибки и химических веществ. Одной из основных причин нозокомиальная пневмония является бактерия Pseudomonas aeruginosa. P. aeruginosa – грамотрицательные организм, который использует систему секреции III тип для передачи различных эффекторных молекул, называемых exoenzymes, непосредственно к цитоплазме целевой ячейки^7,8. Во время инфекции легочного эндотелиальных клеток exoenzymes цели различных внутриклеточных белков, включая эндотелиальной формы связанные микротрубочек белка Тау^9,10,11,12 , приводит к пробою эндотелиальный барьер, что приводит к тяжелой отек легких, снижение легочной функции и, зачастую, смерть.

Как указывалось ранее, пациентов, которые выживают первоначальный пневмонии имеют повышенный уровень смертности в течение первых 12 месяцев после выписки из больницы. Потенциальным механизмом для объяснения этого явления является, что некоторый тип долгоживущих токсин генерируется во время первичной инфекции, что приводит к плохой долгосрочный результат. Два замечания поддерживают эту возможность. Во-первых, культивированный легочного эндотелиальных клеток, которые первоначально лечатся P. aeruginosa не размножаться на срок до недели после того, как бактерии погибают от антибиотиков¹³. Во-вторых, long-lived прионов и агентов с характеристиками прионных было продемонстрировано в различных заболеваний человека и животных, особенно заболеваний, связанных с нервной системы^14,15.

Никогда не были описаны методы для изучения потенциального производства долгоживущих цитотоксических агентов во время легочной инфекции. Здесь изложены ряд простых в vitro анализов, может использоваться для изучения cytotoxin производства и деятельности после инфекции с помощью общей причиной пневмонии агента, P. aeruginosa. Эти анализы должны быть легко адаптируемыми расследовать возможные cytotoxin индукции после инфекции с использованием других агентов, которые вызывают пневмонию и supernatants, которые создаются также должно быть полезным для изучения эффектов цитотоксины в целом органов или животных. Наконец анализов, которые описаны здесь скорее будет адаптироваться для тестирования животных и человеческих биологических жидкостях для производства цитотоксины при пневмонии.

протокол

Все животные процедуры были рассмотрены и одобрены организационного и животных уход комитета университета Южной Алабамы и были выполнены в соответствии с все федеральные, государственные и местные правила. Основных культур крыса легочной микрососудистой эндотелиальных клеток (PMVECs) были получены из Фонда основной культуры клеток в центре университета Южной Алабамы для легких биологии. Клетки были подготовлены с использованием ранее описанные процедуры¹⁶.

1. поколение цитотоксических Supernatants

Примечание: Здесь, мы используем два различных штаммов P. aeruginosa: PA103, который имеет нетронутыми типа III секреторной системы, способной передачи exoenzymes ExoU и экзот клетки-мишени во время инфекции и ∆PcrV, которых не хватает типа III секреторной системы и неспособным передачи exoenzymes в клетки-мишени после прививки.

1. Полоса бактерий на пластины агар Фогеля-Боннер (VB)¹⁷ и расти на ночь при 37 ° C.
   1. Подготовить пластины, сделать следующие Стоковый раствор (Фогель-Боннер соли; 10 x фондовой): измерения 2 g MgSO₄, 20 г лимонной кислоты (свободной кислоты), 100 g K₂PO₄и 35 g NaH₂PO₄. Добавьте ddH₂O 1 Л и автоклав для 15 мин с медленным выхлопных газов.
   2. Место 7.5 g агар в 450 мл ddH₂O и автоклаве выше.
   3. После автоклавирования место оба решения в ванну воды 50 ° C для охлаждения.
   4. Добавьте 50 мл раствора 10 x VB запасов соли в агар.
   5. Добавить carbenicillin в 400 мкг/мл (для штаммов P. aeruginosa используется) и смешайте хорошо закрученного колбу.
   6. Место 5 мл раствора агар VB в индивидуальной стерильной культуры блюда, позволяют агар затвердеть, и затем хранить при 4 ° C до дня бактериального посева.
   7. В день Бактериальный посев, предварительно теплой тарелку до 37 ° C и затем полоса бактерий на пластину с помощью стерильных цикла. Место пластину в инкубаторе 37 ° C ночь.
2. Проверить чистоту PMVEC, положительный пятнать с флуоресцентной Griffonia simplicifolia лектины и негативные окрашивание с флуоресцентных виноградная Лектин (маркер для артериальной эндотелиальных клеток). Аликвота клетки и замораживание в жидком азоте.
3. Для экспериментов поддерживать клетки в Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM) дополнены плода бычьим сывороточным 10% и рост клеток в инкубаторе 37 ° C, содержащих 5% CO₂. Использование ячейки на проходы 5-15.
   1. Для поколения цитотоксических supernatants пластина 2 х 10⁶ клеток в отдельных 150 см блюда и расти на 3-4 дня до впадения достигается. Использование двух пластин за эксперимент (см. ниже).
   2. Для анализа цитотоксических supernatants пластина 1 x 10⁵ клетки в индивидуальные добра 6-хорошо блюдо и растут в течение четырех дней, пока не будет достигнуто слияния.
4. Производить супернатанта, один из двух 150 см блюд PMVECs из шага 1.3.1 с фосфат амортизированное saline мыть, trypsinize и затем подсчитать количество ячеек (мы использовать счетчик автоматизированных клеток и следовать протокол изготовителя; см. Таблицу материалы). Вымойте другое блюдо PMVECs с Хэнка сбалансированный соли раствора (HBSS) и затем заразить любой штамм P. aeruginosa на разносторонности инфекции (МВД) 20:1. Это достигается следующим образом:
   1. Для P. aeruginosa, OD₅₄₀ 0,25 = 2 x 10⁸ CFUs/мл. Подготовить этот растворения, добавьте 1 мл HBSS одноразовых кювет 1 мл. Скрип достаточно бактерии прочь пластину, который был подготовлен на этапе 1.1 до од₅₄₀ 0.25 достигается при измерении с помощью спектрофотометра. Следующий шаг будет предоставлять расчет сколько потребуется бактерий.
   2. После того, как определяется количество PMVECs в культуре блюдо (шаг 1.4 выше), определить соответствующее количество бактерий для добавления второй, не trypsinized культуры блюдо, содержащие PMVECs. Например если выясняется, что культуры блюдо PMVECs содержит 1.3 x 10⁷ ячеек, а затем подготовить 1.3 x 10⁷ клеток x 20 бактерии/клеток x 1 мл/2 x 10⁸ CFUs = 1,3 мл бактерий.
   3. Развести по 1,3 мл бактерий в HBSS окончательный объемом 20 мл, так что всю поверхность 150 см блюдо может быть покрыта жидкостью, а затем добавьте разбавленные бактерий пластины PMVECs.
   4. Инкубируйте прививанным с бактериями при 37 ° C в 5% CO₂ инкубатора для 4-5 ч, до тех пор, пока пробелы можно увидеть формирование в монослое клеток, когда плита наблюдается микроскопически PMVECs (см. Рисунок 1 для надлежащего уровня разрыв формирования).
   5. Собирать супернатанта, а затем центрифуги для 10 мин на 2000 x g в настольная центрифуга для удаления сотовой мусора.
      Примечание: Любые столешницы центрифуги, способных генерирования достаточных g силу Пелле unlysed клеток и крупноклеточный фрагменты могут быть использованы для этого шага.
   6. Залейте супернатант в шприц, 0,2 мкм фильтром прилагается к своему концу, затем пройти супернатант через фильтр, чтобы удалить бактерии.
   7. Используйте Алиготе стерильных супернатант для тестирования цитотоксичности (см. 2.1) и заморозить остальные супернатант в-80 ° C для использования в будущем.

2. анализ цитотоксических Supernatants

1. Цитотоксичность Assay
   1. Расти PMVECs в 6-ну блюд до слияния. Уэллс мыть раз с HBSS, затем добавить 1,5 мл фильтр стерилизации супернатант (собранные от любой прививки PA103 или ∆PcrV клеток) отдельных скважин. Добавьте стерильные HBSS другой хорошо как отрицательный контроль.
   2. Место пластину в CO₂ инкубатора для 21-24 ч, а затем наблюдать за убийство/цитотоксичность клеток (см. следующий шаг). Использование supernatants, которые проявляют цитотоксичности для дальнейших экспериментов и отбросить те, которые не показывают ячейки убийства.
   3. Количественный клетки убийства
      1. Мера Лактатдегидрогеназа (LDH) освобождение от мертвых клеток, используя имеющиеся наборы Assay ЛДГ и производителя рекомендованных процедур.
      2. Кроме того подсчитать ячейки убийство микроскопически использованием ImageJ программного обеспечения. Для этого, запись микроскопических изображений и областей культуры блюдо, содержащие нетронутым клеток, а затем подсчитать регионах отсутствуют клетки (индикативный гибели клеток в монослое) используя пользовательский макрос ImageJ (национальные институты здравоохранения) (см. дополнительного кодирования файла ). При желании, провести макро шаги вручную следующим образом:
         1. Ввод изображений (формат RGB или Tiff) в макрос и отрегулировать контрастность до 15% насыщенных пикселей. Дублировать отрегулировать контрастность изображений и выполнить команду «вычитание фона» для получения высокой контрастности изображения района клеток и разрыв в поле зрения.
         2. Вычитание этого изображения из исходного изображения и объединить полученное изображение с исходным изображением с помощью калькулятора изображения функция «И». Преобразовать полученный образ черный (пробелы) и белый (клетки) маска с функцией порог (минимум 0, максимум 5) и используйте функцию «двоичный подорвать» для удаления шума из образа.
         3. Измерьте отношение чёрно-белых пикселей внутри результирующего изображения с помощью «области фракция» измерения. Сюжет и выразить дробных областей для каждой точки время лечения как процент максимального пробела района.
         4. Рассчитать средства и сравнить с помощью односторонний дисперсионный анализ с Тьюки в post hoc теста, значениями p меньше чем 0,05 считается существенным.
   4. Использование анализа immunoblot установить присутствие амилоида, олигомерных Тау и значения в supernatants культуры. Выполните анализ immunoblot с помощью стандартных процедур^10,11,12, за исключением концентрации supernatants культуры по крайней мере 10 раз до электрофореза.
      1. Концентрацию супернатанта, место 1-2 мл супернатант в блок фильтра центрифугирования, чьи мембрана имеет молекулярный вес производства 10 кДа. Затем поместите фильтр в столешнице центрифуги и центрифуги на 2000 x g до тех пор, пока требуемая степень концентрации достигнута (обычно 45-60 мин).
      2. Определить количество белка в концентрированной супернатанта¹¹ и загрузить равное количество образцов в индивидуальные добра геля.
      3. Запустите гели, передачи белков на нитроцеллюлозные, затем зонд кляксы с A11 анти амилоид антитела, антитела анти олигомерных Тау T22 или антитела анти значения MOAB2 следуют соответствующие вторичные антитела. Разработка помарки, используя стандартные хемилюминесценции процедур.
   5. Чтобы сделать Тиофлавин Т Assay, используйте Тиофлавин Т флуоресцирования (ThT) для количественного определения Амилоиды в supernatants. Для этих измерений используйте фильтр стерилизации supernatants.
      1. Подготовьте Стоковый раствор (50 x) Тиофлавин Т, приостановив Тиофлавин Т (ThT) 8 мг в 10 мл фосфатный буфер (PBS). После смешивания, фильтр решение через 0,22 мкм фильтр для удаления твердых частиц.
      2. Для измерений добавьте 20 мкл акций ThT 1 мл PBS в кювет спектрофотометр 1 мл. Поместите разреженных образца в Спектрофлуориметр.
      3. Измерьте базовые флуоресценции выбросов с использованием 425 Нм возбуждения и сканирование флуоресценции выбросов от 450-575 Нм приращением 2 Нм.
      4. Выполнить проверку промежуток времени, используя 425 Нм возбуждения и 482 выбросов Нм, с данными приобрела каждые 0,2 s 60 s.
      5. Первоначальный 20 s промежуток времени сканирования меры флуоресценции в пустой кюветы. 20 s, приостановить проверку и 10 мкл фильтр стерилизации супернатант в кювет. Смешать кювета, инверсии, а затем поместить обратно в Спектрофлуориметр.
      6. Возобновить на основе времени сканирования, приобретать окончательный 40 s данных.
      7. После завершения сканирования, покадровой выполните сканирование спектра излучения заключительном флуоресцирования используя идентичные параметры, как подробно указано в 2.1.5.3.

Результаты

Простой в vitro пробирного был разработан для анализа на наличие цитотоксины в supernatants клетки, инфицированных бактериями P. aeruginosa. В основном питательной среды от инфицированных клеток собирается 4 h после бактериальной сложения, бактерии удаляются стерилизация...

Обсуждение

Здесь просто в vitro методы изложены которые позволяют демонстрация поколения цитотоксических Амилоиды во время инфекции с пневмонией, вызывая организма. Эти методы включают в себя assay цитотоксичности клетки культуры, immunoblotting, количественный ячейки, убийство с использованием Роман...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rabbit anti beta amyloid	Thermo	71-5800
A11 amyloid oligomer antibody	StressMarq	SPC-506D
T22 anti-tau oligomer antibody	EMD Millipore	ABN454
Thioflavin T	Sigma Aldrich	T3516
HBSS	Gibco	14025-092
PBS	Gibco	10010-023
0.22 micron syringe filters	Millipore	SLGP033RS
DMEM	Gibco	11965-092
HRP Goat antirabbit IgG	Abcam	ab6721-1
Strains PA103 and ΔPcrV			These strains of P. aeruginosa were obtained from Dr. Dara Frank, University of Wisconsin Medical College, Milwaukee, WI
FITC Griffonia lectin	Sigma Aldrich	L9381
TRITC Helix pomatia lectin	Sigma Aldrich	L1261
Agar	Fisher	BP1423-500
0.22 micron nitrocellulose	BioRad	162-0112
Type 2 collagenase	Worthington	LS004176
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30898.03IH
PenStrep	Gibco	15070063
Carbenicillin Disodium salt	Sigma	C1389
Microcetrifugation concentrators- 10,000 MW cut-off	Millipore	UFC801008
Potassium phosphate dibasic	Sigma	795496-500G
Magnesium phosphate heptahydrate	MP Biomedicals	MP021914221
Citric Acid	G Biosciences	50-103-5801
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Sigma	S9506-500G
Countess Automated Cell Counter	Invitrogen	C10277