Métodos para detecção de citotóxicos amiloides seguir infecção de pulmonar células endoteliais por Pseudomonas aeruginosa

Resumo

Métodos simples são descritos para demonstrar a produção de amiloides citotóxicos após infecção do endotélio pulmonar por Pseudomonas aeruginosa.

Resumo

Pacientes que sobrevivem a pneumonia tem elevadas taxas de mortalidade nos meses após a alta hospitalar. Isso tem sido a hipótese de que a infecção do tecido pulmonar durante uma pneumonia resulta na produção de citotoxinas long-lived que podem levar ao fracasso subsequente fim órgão. Nós desenvolvemos em vitro ensaios para testar a hipótese que citotoxinas são produzidas durante a infecção pulmonar. As células endoteliais pulmonar isolado de rato e a bactéria Pseudomonas aeruginosa são usados como sistemas modelo, e a produção de cytoxins após a infecção das células endoteliais por bactérias é demonstrada usando cultura de células, seguida por quantificação directa utilizando ensaios de lactato desidrogenase e um novo método microscópico utilizando tecnologia ImageJ. A natureza amiloide destas citotoxinas foi demonstrada por ensaios de thioflavin T obrigatórios e immunoblotting e immunodepletion usando anticorpo antiamilóide de A11. Novas análises usando immunoblotting demonstraram que tau oligoméricas e Aβ foram produzidos e liberados por células endoteliais após infecção por p. aeruginosa. Esses métodos devem ser facilmente adaptávelas para análises de amostras clínicas humanas.

Introdução

Pacientes que sobrevivem a pneumonia tem elevadas taxas de mortalidade nos meses seguintes hospital descarga^1,2,3,4,5,6. Na maioria dos casos, a morte ocorre por algum tipo de falha final-órgão, incluindo renais, pulmonares, cardíacas, ou eventos de fígado, bem como derrame^5,6. A razão para a elevada taxa de mortalidade nesta população de pacientes nunca foi estabelecida.

Pneumonia é classificada como também sendo adquirida na Comunidade ou hospitalar (nosocomial) e agentes que podem causar pneumonia incluem bactérias, vírus, fungos e substâncias químicas. Uma das principais causas de pneumonia nosocomial é a bactéria Pseudomonas aeruginosa. P. aeruginosa é um organismo Gram-negativo que usa um sistema de secreção do tipo III para transferir várias moléculas efetoras, denominadas exoenzymes, diretamente para o citoplasma das células de destino^7,8. Durante a infecção de células endoteliais pulmonares, os exoenzymes alvo várias proteínas intracelulares, incluindo um formulário endotelial do microtubule-associada da proteína tau^9,10,11,12 , levando à desagregação de barreira endotelial, resultando em edema pulmonar grave, diminuição da função pulmonar e, muitas vezes, morte.

Como dito anteriormente, pacientes que sobrevivem a pneumonia inicial elevaram taxas de mortalidade nos primeiros 12 meses após a alta hospitalar. Um mecanismo potencial para explicar esse fenômeno é que algum tipo de toxina long-lived é gerado durante a infecção inicial que conduz ao pobre resultado a longo prazo. Duas observações suportam esta possibilidade. Em primeiro lugar, culturas pulmonares células endoteliais, que são tratadas inicialmente com p. aeruginosa falharem a proliferar por até uma semana depois que as bactérias são mortas por antibióticos¹³. Segundo, long-lived priões e agentes com características de príon foram demonstrados em várias doenças humanas e animais, particularmente doenças associadas com o sistema nervoso de^14,15.

Nunca têm sido descritos métodos para analisar o potencial de produção de agentes citotóxicos long-lived durante a infecção pulmonar. Aqui uma série de ensaios simples em vitro são descritos que podem ser usados para investigar cytotoxin produção e actividade após infecção usando um comum agente causando uma pneumonia, p. aeruginosa. Estes ensaios devem ser facilmente adaptávelas para investigar indução cytotoxin possível após infecção usando outros agentes que causam a pneumonia, e os sobrenadantes são gerados também devem ser útil para investigar os efeitos dos citotoxinas no todo órgãos ou animais. Finalmente, os ensaios que são descritos aqui provavelmente será adaptávelas para testar os fluidos biológicos humanos e animais para a produção de citotoxinas durante uma pneumonia.

Protocolo

Todos os procedimentos de animais foram revisados e aprovados pelo Comitê de cuidado Animal da Universidade do Sul do Alabama e institucional e foram realizados em conformidade com todas as regulamentações federais, estaduais e locais. Culturas primárias de rato pulmonar microvascular células endoteliais (PMVECs) foram obtidas da instalação de núcleo de cultura de célula Center da Universidade do Sul do Alabama para biologia do pulmão. As células foram preparadas usando os procedimentos descritos anteriormente¹⁶.

1. geração de sobrenadantes citotóxicos

Nota: Aqui, usamos dois diferentes cepas de p. aeruginosa: PA103, que tem um sistema de secreção do III tipo intacto capaz de transferir os exoenzymes ExoU e ExoT para células-alvo durante a infecção e ∆PcrV, que carece de um tipo sistema do secretion de III e é incapaz de transferir exoenzymes para células-alvo após a inoculação.

1. Raia de bactérias para a de placas de ágar Vogel-Bonner (VB)¹⁷ e crescer durante a noite a 37 ° C.
   1. Para preparar pratos, faça a seguinte solução estoque (sais de Vogel-Bonner; estoque de x 10): medir 2 g MgSO₄, ácido cítrico de 20g (ácido livre), 100 g K₂PO₄e 35 g NaH₂PO₄. Adicione ddH₂O de 1L e autoclave por 15 min com escape lento.
   2. Coloque 7,5 g ágar-ágar em 450ml ddH₂O e autoclave como acima.
   3. Após a autoclavagem, Coloque ambas as soluções em um banho de água de 50 ° C para esfriar.
   4. Adicione 50 mL da solução de sal estoque de 10 x VB a agar.
   5. Adicionar carbenicilina a 400 µ g/mL (para as cepas de p. aeruginosa sendo usado) e misturar bem, agitando o frasco.
   6. Lugar 5 mL da solução de ágar de VB em pratos individuais cultura estéril, permitir que o agar para solidificar e em seguida armazenar a 4 ° C até o dia da semeadura bacterianas.
   7. No dia da semeadura bacterianas, pré-aquecer uma placa a 37 ° C e em seguida marcam as bactérias na placa utilizando uma ansa estéril. Lugar a placa em uma incubadora de 37 ° C durante a noite.
2. Verificar a pureza PMVEC pela coloração positiva com fluorescente Griffonia simplicifolia lectina e coloração negativa com fluorescentes Helix pomatia lectina (um marcador para células endoteliais arteriais). Alíquotas células e congelamento em nitrogênio líquido.
3. Para experiências, manter as células em modificado águia de Dulbecco médio (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino e desenvolvem-se células em uma incubadora de 37 ° C, contendo 5% de CO₂. Use células em passagens 5-15.
   1. Para geração de sobrenadantes citotóxicos, placa de 2 x 10⁶ células em pratos individuais 150cm e crescer por 3-4 dias até alcançar a confluência. Use duas placas por experiência (veja abaixo).
   2. Para análise dos sobrenadantes citotóxicos, células de placa 1 x 10⁵ em poços individuais de um poço-6 prato e crescerem durante quatro dias até alcançar a confluência.
4. Para produzir o sobrenadante, lavar um dos pratos de PMVECs dois 150cm da etapa 1.3.1 com tampão fosfato salino, trypsinize e depois contar as células (use um contador de célula automatizada e seguir o protocolo do fabricante; ver Tabela de materiais). Lavar o outro prato de PMVECs com Hank está equilibrado sal solução (HBSS) e então infectar com qualquer estirpe de p. aeruginosa em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 20:1. Isto é conseguido da seguinte forma:
   1. Para p. aeruginosa, OD₅₄₀ 0,25 = 2 x 10⁸ CFUs/mL. Para preparar esta diluição, adicione 1 mL HBSS para uma cubeta descartável de 1ml. Raspe bastante bactérias do prato que foi preparada no passo 1.1 até uma OD₅₄₀ de 0,25 é alcançado quando medido utilizando um espectrofotômetro. O próximo passo irá fornecer um cálculo de quanto serão necessário bactérias.
   2. Uma vez que o número de PMVECs a placa de cultura é determinado (etapa 1.4 acima), determinar o número apropriado de bactérias a ser adicionado ao prato em segundo lugar, não-trypsinized de cultura contendo os PMVECs. Por exemplo, se for determinado que a placa de cultura de PMVECs contém 1,3 x 10⁷ células e, em seguida, preparar a 1,3 x 10⁷ células x 20 bactérias/celular x 1 mL/2 x 10⁸ CFUs = bactérias 1,3 mL.
   3. Dilua a 1,3 mL de bactérias em HBSS até um volume final de 20 mL, para que toda a superfície de um prato de 150 cm pode ser coberto com fluido e, em seguida, adicionar as bactérias diluídas para a placa de PMVECs.
   4. Incube as PMVECs inoculadas com as bactérias a 37 ° C numa incubadora 5% CO₂ para 4-5 h, até que as lacunas podem ser vistas formando em monocamada a célula quando a placa é observada microscopicamente (ver Figura 1 para um nível adequado de formação de lacuna).
   5. Recolher o sobrenadante e, em seguida, centrifugar durante 10 min a 2.000 x g em uma centrífuga de mesa para remover restos celulares.
      Nota: Qualquer centrífuga de mesa capaz de gerar suficiente g force para células unlysed e células grandes fragmentos podem ser usados para esta etapa de Pelotas.
   6. Despeje o líquido sobrenadante em uma seringa que tem um filtro de 0,2 µm conectado à sua extremidade, então passar o sobrenadante através do filtro para remover as bactérias.
   7. Use uma alíquota do sobrenadante estéril para teste de citotoxicidade (ver 2.1) e congelar o resto do sobrenadante a-80 ° C para uso futuro.

2. análise de sobrenadantes citotóxicos

1. Ensaio de citotoxicidade
   1. Cresce PMVECs em pratos 6-poços até a confluência. Poços de lavar uma vez com HBSS, em seguida, adicionar 1,5 mL do sobrenadante filtro esterilizado (colhido ou células inoculadas por PA103 ou ∆PcrV) para poços individuais. Adicione HBSS estéril para outro bem como controlo negativo.
   2. Coloque a placa para a incubadora de CO₂ para 21-24 h e, em seguida, observar para matar a célula/citotoxidade (ver próximo passo). Use sobrenadantes que exibem citotoxicidade para novas experiências e descartar aqueles que não mostram a matança de célula.
   3. Quantificação de morte celular
      1. Liberação de lactato desidrogenase (LDH) medida de células mortas, usando Kits de ensaio disponíveis comercialmente LDH e do fabricante recomendado procedimentos.
      2. Alternativamente, quantificar a matança de célula ao microscópio utilizando o software ImageJ. Por isso, gravar imagens microscópicas e áreas da placa de cultura contendo células intactas e, em seguida, quantificar regiões faltam células (indicativas de morte celular em um monolayer) usando uma macro personalizada do ImageJ (National Institutes of Health) (ver arquivo de codificação complementar ). Se desejado, realize as etapas macro manualmente da seguinte forma:
         1. Imagens (formato RGB ou Tiff) de entrada para a macro e ajustar o contraste para 15% saturada pixels. Duplique o contraste ajustado imagens e executar o comando "subtrair o plano de fundo" para obter uma imagem de alto contraste da área tanto a célula e a lacuna dentro do campo de visão.
         2. Subtrair a esta imagem da imagem original e combinar com a imagem original, usando a calculadora de imagem "E" função, a imagem resultante. Converta a imagem resultante em preto (lacunas) e máscara branca (células) com a função de limite (mínimo de 0, máximo de 5) e usar a função "corroer a binário" para remover o ruído da imagem.
         3. Medir a proporção de preto para brancos pixels dentro da imagem resultante usando a medição de "fração de área". Plotar e expressar áreas fracionárias para cada ponto de tempo de tratamento como por cento da área de abertura máxima.
         4. Meios de calcular e comparar usando ANOVA One-Way com teste post hoc de Tukey, com valores de p inferior a 0,05 considerado significativo.
   4. Use a análise de immunoblot para estabelecer a presença de amiloide e tau oligoméricas Aβ em sobrenadantes de cultura. Realizar análise de immunoblot usando^11,os procedimentos padrão^10,12, exceto concentrando sobrenadantes de cultura pelo menos 10 vezes antes da electroforese.
      1. Para concentrar-se o sobrenadante, coloque 1 a 2 mL do sobrenadante para uma unidade de filtro de centrifugação cuja membrana tem um peso molecular de corte de 10 kDa. Em seguida, coloque a unidade de filtro em uma centrífuga de mesa superior e centrifugar x 2.000 g até o necessário grau de concentração é alcançado (geralmente de 45-60 min).
      2. Determinar a quantidade de proteína na concentrada sobrenadante¹¹ e carregar quantidades iguais de amostras em poços individuais do gel.
      3. Executar géis, transferir as proteínas para nitrocelulose e sondar os borrões com anticorpo antiamilóide de A11, anticorpo antioligoméricas tau de T22 ou anticorpo anti-Aβ de MOAB2 seguido por anticorpos secundários apropriados. Desenvolva os borrões usando procedimentos padrão de quimioluminescência.
   5. Para fazer um ensaio de T de thioflavin, use thioflavin T fluorescência (ThT) quantificar amiloides em sobrenadantes. Para as medições, use filtro esterilizado sobrenadantes.
      1. Prepare uma solução de stock (50x) de thioflavin T, suspendendo a 8 mg thioflavin T (ThT) em soro fisiológico 10ml tamponado fosfato (PBS). Após a mistura, filtre a solução através de um filtro de 0,22 µm para remover partículas.
      2. Para medições, adicione 20 µ l de estoque ThT a 1 mL de PBS em um fluorímetro de 1 mL. Coloca a amostra diluída em um spectrofluorimeter.
      3. Medir a emissão de fluorescência de base usando 425 excitação nm e a emissão de fluorescência de 450-575 nm em incrementos de 2 nm de digitalização.
      4. Executar uma verificação de lapso de tempo usando 425 excitação nm e emissão de 482 nm, com dados adquiridos a cada 0.2 s por 60 s.
      5. O inicial 20 s do scan Time-Lapse mede a fluorescência na célula em branco. A 20 s, pausar o scan e adicionar 10 µ l do sobrenadante filtro esterilizados para a cubeta. Misture a cubeta por inversão e coloque para o spectrofluorimeter.
      6. Retomar a verificação baseada em tempo, adquirindo o final 40 s de dados.
      7. Após a conclusão da digitalização lapso de tempo, execute uma varredura de espectro de emissão de fluorescência final usando configurações idênticas, conforme detalhado em 2.1.5.3.

Resultados

Um ensaio simples em vitro foi desenvolvido para ensaio para a presença de citotoxinas em sobrenadantes de células infectadas com a bactéria p. aeruginosa. Basicamente, meio de cultura de células infectadas é coletado 4 h após a adição de bactérias, as bactérias são removidas pela esterilização do filtro do sobrenadante da cultura, e em seguida o sobrenadante estéril é adicionado a uma nova população de células. As células são então observadas 21-24 ...

Discussão

Aqui, simples em vitro métodos estão descritos que permitem a demonstração da geração de amiloides citotóxicas durante a infecção com uma organismo causador de pneumonia. Estes métodos incluem um ensaio de citotoxicidade de cultura de células, immunoblotting, quantificação de célula usando um novo método microscópico e ThT vinculação a matar. Análises dos agentes citotóxicos têm demonstrado que eles são amiloide na natureza (Figura 2 e

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rabbit anti beta amyloid	Thermo	71-5800
A11 amyloid oligomer antibody	StressMarq	SPC-506D
T22 anti-tau oligomer antibody	EMD Millipore	ABN454
Thioflavin T	Sigma Aldrich	T3516
HBSS	Gibco	14025-092
PBS	Gibco	10010-023
0.22 micron syringe filters	Millipore	SLGP033RS
DMEM	Gibco	11965-092
HRP Goat antirabbit IgG	Abcam	ab6721-1
Strains PA103 and ΔPcrV			These strains of P. aeruginosa were obtained from Dr. Dara Frank, University of Wisconsin Medical College, Milwaukee, WI
FITC Griffonia lectin	Sigma Aldrich	L9381
TRITC Helix pomatia lectin	Sigma Aldrich	L1261
Agar	Fisher	BP1423-500
0.22 micron nitrocellulose	BioRad	162-0112
Type 2 collagenase	Worthington	LS004176
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30898.03IH
PenStrep	Gibco	15070063
Carbenicillin Disodium salt	Sigma	C1389
Microcetrifugation concentrators- 10,000 MW cut-off	Millipore	UFC801008
Potassium phosphate dibasic	Sigma	795496-500G
Magnesium phosphate heptahydrate	MP Biomedicals	MP021914221
Citric Acid	G Biosciences	50-103-5801
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Sigma	S9506-500G
Countess Automated Cell Counter	Invitrogen	C10277