Tomografía Molecular de la fluorescencia para obtener imágenes In Vivo de xenoinjertos de Glioblastoma

Resumen

Ortotópico inyección intracraneal de células del tumor se ha utilizado en la investigación del cáncer para el estudio de la biología del tumor de cerebro, evolución, evolución y respuesta terapéutica. Presentamos la tomografía molecular fluorescencia de xenoinjertos tumorales, que proporciona en tiempo real imágenes intravital y cuantificación de un tumor masivo en modelos preclínicos de glioblastoma.

Resumen

Colonización es la capacidad de las células cancerosas forman un tumor masa. Un enfoque ampliamente utilizado para determinar si las células son tumorigenic es inyectando ratones inmunodeficientes por vía subcutánea con células de cáncer y midiendo la masa de tumor después de se vuelve visible y palpable. Orthotopic inyecciones de células de cáncer tienen como objetivo introducir el xenoinjerto en el microambiente que más se asemeja al tejido de origen del tumor en estudio. Investigación de cáncer del cerebro requiere inyección intracraneal de las células cancerosas para permitir la formación de tumores y el análisis en el microambiente único del cerebro. La proyección de imagen en vivo de xenoinjertos intracraneales monitorea instantáneamente la masa tumoral de orthotopically engrafted ratones. Aquí divulgamos el uso de la tomografía molecular de la fluorescencia (FMT) de xenoinjertos de tumor de cerebro. Las células cancerosas son transduced en primer lugar con cerca de proteínas fluorescentes infrarrojos y luego se inyecta en el cerebro de ratones inmunodeprimidos. Los animales se analizan a continuación para obtener información cuantitativa sobre la masa tumoral durante un periodo prolongado de tiempo. Células previamente etiquetado permite la cuantificación efectiva, reproducible y confiable de la carga del tumor dentro de cada ratón. Eliminó la necesidad de inyectar de sustratos y por lo tanto reduce el estrés en los animales. Una limitación de este enfoque está representada por la incapacidad para detectar masas muy pequeñas; sin embargo, tiene mejor resolución para masas más grandes que otras técnicas. Puede ser aplicado para evaluar la eficacia de un tratamiento farmacológico o alteraciones genéticas de líneas celulares de glioma y de muestras de paciente derivado.

Introducción

El cáncer es una de las principales causas de muertes relacionadas con la enfermedad en seres humanos en el mundo industrializado. Con un altísimo número de muertos, nuevos tratamientos son urgentemente necesarios. Glioblastoma multiforme (GBM) es un tipo muy letal de cáncer de cerebro, compuesto por poblaciones heterogéneas de células stromal e inmune del tumor de cerebro. Según el registro de tumores de cerebro Central de los Estados Unidos, la incidencia de tumores cerebrales primarios malignos y no malignos es aproximadamente 22 casos por cada 100.000 personas. Se espera que aproximadamente 11.000 nuevos casos diagnosticados en los E.e.u.u. en 2017¹.

Estudios preclínicos investigan la probabilidad de que un medicamento, procedimiento o tratamiento sea efectiva antes de la prueba en seres humanos. Uno de los primeros pasos de laboratorio en estudios preclínicos es identificar posibles dianas moleculares para el tratamiento de drogas mediante el uso de las células cancerosas implantadas en un organismo anfitrión, definido como modelos de xenoinjerto humana. En este contexto, modelos de xenoinjerto de tumores cerebral intracraneal con xenoinjertos derivados del paciente (PDXs) han sido ampliamente utilizados para estudiar la biología del tumor de cerebro, evolución, evolución y respuesta terapéutica y más recientemente para el desarrollo de biomarcadores, la droga screening y personalizada medicina^2,3,4.

Uno de lo más económico y no invasivo en vivo imágenes métodos para monitorear xenoinjertos intracraneales es bioluminiscencia imagen (BLI)^5,6,7,8. Sin embargo, algunas limitaciones de BLI incluyen administración de sustrato y la disponibilidad, estabilidad de la enzima y luz apagando y dispersión durante la proyección de imagen de adquisición⁹. Aquí divulgamos el FMT infrarrojo como alternativa de método para monitorear modelos preclínicos de glioblastoma. En este método, adquisición de señal y cuantificación de PDXs intracranially implantados, expresan una proteína fluorescente infrarroja iRFP720^10,11 (denominada en adelante como FP720) o turboFP635 (en adelante denominados como FP635), se realiza con un sistema de imagen de FMT. Usando la tecnología de la FMT, la ortotópica de tumores pueden ser monitoreado en vivo antes, durante o después del tratamiento, de una manera no invasiva, libre de sustrato y cuantitativa para las observaciones preclínicas.

Protocolo

El uso de animales de investigación experimental y agentes infecciosos, tales como lentivirus para transducir las células de cáncer, requiere previa aprobación por el programa de cuidado institucional de los animales y por el Comité de bioseguridad institucional. Este protocolo sigue las pautas de cuidado de los animales de la Universidad de California San Diego (UCSD).

1. etiquetado de células de Glioblastoma con FP635 o FP720 construcción

1. Producir y purificar lentivirus según el protocolo descrito por Tiscornia et al. ¹²
2. Células en cultivo aproximadamente 2.0 x 10⁶ desde la línea de células de glioma humano con DMEM y 10% suero bovino fetal (FBS) en un plato de 15 cm; o cultura 2.0 x 10⁶ glioblastoma humano derivados del paciente (GBM-PDX) esferas con DMEM/F12 1:1 mediano con B27 suplemento más humano factor de crecimiento epidérmico recombinante (EGF; 20 ng/mL) y FGF (10 ng/mL) en un matraz T75.
3. Mantener todas las células a 37 ° C, 5% CO₂y 100% de humedad relativa.
4. Disociar las células.
   1. Para las células de glioma: Retire el sobrenadante de las placas y añadir 3-5 mL de tripsina 1 X para las células de glioma.
   2. Para el GBM esferas: recogen las células por pipetear las células en un tubo de 15 mL.
      1. Desactivación de las esferas GBM a 200 x g durante 5 minutos utilizando una centrífuga de mesa a temperatura ambiente.
      2. Quite el sobrenadante y agregar 3-5 mL de solución de separación celular.
   3. Incubar todas las células a 37 ° C durante 10-15 minutos.
5. Cuidadosamente disociar las células mediante pipeteo arriba y abajo varias veces (asegurar que se lleven a las esferas y las células de glioma disociado) y a 200 x g durante 5 minutos.
6. Quite el sobrenadante y resuspender las células con 5 mL de medio por pipeteo arriba y abajo varias veces. Determinar la viabilidad de las células por exclusión del azul tripán.
7. Placa de 1.0 x 10⁶ de las células de la blanco en un plato de 10 cm con 5 mL de medio por pipeteo.
8. Transducir células con lentivirus expresión de proteínas fluorescentes en multiplicidad de infección (MOI) 5 como se describe por Tiscornia et al. ¹² e incubar a 37 ° C.
9. Después de 24 h, retire el medio de las células transduced, añadir 5 mL de medio fresco e incubar adicional 48 h a 37 ° C.
10. Disociar las células infectadas en una suspensión unicelular como se describe en pasos 1.4-1.6. Desactivación de las células a 200 x g durante 5 min y resuspender en 500 μl de solución de clasificación (solución salina tamponada con fosfato (PBS) con 1% FBS).
11. Pipetear la suspensión celular en tubos de FACS. Co se tiñen las células con 1 μl/mL de 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) diclorhidrato para excluir las células muertas. Controles negativos son necesarios para configurar las puertas de citómetro de flujo (células transduced no y no-transduced / tinción DAPI).
12. Clasificar las células fluorescentes/DAPI positivo-negativo en clasificación de solución, según lo descrito por Basu et al. ¹³y recoger las células ordenadas en un tubo cónico de 15 mL.
13. Girar por las células ordenadas a 200 x g durante 5 minutos, retirar el sobrenadante y resuspender en 5 mL de medio de cultivo. Las células ordenadas en un plato de 10 cm de la semilla mediante pipeteo. Incubar a 37 ° C durante al menos 48-72 h.
14. Expandir las células clasificadas por disociar las células siguiendo pasos 1.4-1.6 y placas en varios platos para los experimentos en vivo .
    Nota: Para más detalles sobre la clasificación de preparación y purificación de la célula, véase Basu et al. ¹³

2. intracraneal inyección de células de Glioblastoma iRFP etiquetadas en ratones inmunodeficientes

Nota: Antes de comenzar la cirugía, asegúrese de que el sitio quirúrgico y las herramientas estén limpios para el procedimiento. Utilice athymic inmunodeficientes (Foxn1^nu) hombres o mujeres ratones desnudos, entre 4-5 semanas de edad y 17-19 g para inyección intracraneal. Animales deben ser ubicados durante al menos 3 días después de la llegada y antes de la cirugía.

1. Preparación de la célula
   1. Cosecha y disocian fluorescentes positivo-glioma células en una suspensión unicelular (pasos 1.4-1.6) y resuspender en 0.5 o 1.0 x 10⁶ células en 2-5 μl de PBS por inyección por animal. Pipetear la suspensión de células en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y coloque en hielo.
2. Administración y preparación de la anestesia
   1. Preparar 200 μL de solución salina que contiene ketamina (100 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg) por cada 20 gramos de peso corporal de ratón. Pesan los animales y calcular la dosis adecuada de anestesia.
   2. Proporcionar una inyección intraperitoneal de la anestesia y aplicar pomada oftálmica en los ojos para evitar la deshidratación. Para más detalles sobre este paso ver Kathleen et al. ¹⁴ colocar el animal sobre una almohadilla térmica de agua precalentada a 37 ° C.
   3. Compruebe que los animales son anestesiados mediante el control de la respuesta de pellizco del dedo del pie (reflejo pedal), generalmente dentro de 5-10 minutos.
3. Inyección intracraneal
   1. 5 μl de carga jeringa Hamilton (aguja de punta Roma) con suspensión de la célula y montaje en el soporte de la sonda.
   2. Coloque el ratón en un marco estereotáctico animal pequeño y fijar la cabeza usando las barras de la oreja y el adaptador del incisivo tras los detalles descritos por Cetin et al. ¹⁵
   3. Desinfectar la cabeza con etanol y betadine solución al 70%. Asegúrese de que el sitio quirúrgico es completo estéril. Realizar una incisión media con un pequeño bisturí y separar la piel y los tejidos conectivos.
   4. Coloque la jeringa Hamilton en el punto de vértice con el micromanipulador.
   5. Mueva la sonda titular 1,0 mm anteroposterior y 2.0 mm lateral desde el punto de vértice. Marque esta posición con un lápiz.
   6. En este lugar, cuidadosamente haga un orificio en el cráneo con un taladro de mano de micromotor aplicando ligera presión hacia abajo hasta que los vasos sanguíneos se hacen visibles. No alterar el parénquima aracnoide de la mater y el cerebro.
   7. Introducir la aguja en el orificio de trépano y avance 3,0 mm debajo de la superficie pial.
   8. Configurar el volumen (2-5 μl) y caudal (1 μl/min) de la inyección usando un inyector estereotáxicas motorizado o manualmente realizar la inyección.
   9. Después de la inyección, retire la aguja poco a poco ascendiendo 1,0 mm cada 1 minuto y limpiar el sitio de la inyección con etanol al 70%.
   10. Cerca la piel de la herida con grapas quirúrgicas o haciendo suturas quirúrgicas (referidas a menudo como puntos de sutura) y ver Kathleen et al. ¹⁴ para más detalles.
4. Recuperación de animales
   1. Traslado del animal a una almohadilla térmica del agua (37 ° C) y controlar la temperatura corporal, tasa de respiración y ritmo cardíaco, hasta la recuperación completa. Administrar analgesia por protocolos estándar.
      Nota: Para obtener más información sobre el procedimiento stereotactic, cirugía y coordenadas, ver otros informes^5,14,15.

3. la proyección de imagen FMT

Nota: Según el objetivo experimental, el glioblastoma iRFP tagged células pueden ser monitoreado en vivo antes, durante o después del tratamiento. Para propósito de la proyección de imagen, anestesiar animales usando una cámara de inducción de isoflurano, mantener en una cinta de proyección de imagen durante la exploración y la imagen en la estación de acoplamiento de lo toner de la FMT.

1. Quitar el animal de la jaula y el lugar en la sala de inducción del isoflurano. Cerrar la cámara y activar el flujo de oxígeno y vaporizador para 3-5%.
2. Seguimiento del animal hasta que está completamente anestesiado, generalmente dentro de 1-2 minutos inconsciente animales deben no responden a los estímulos externos.
3. Retire el animal anestesiado de la cámara y poner el animal en el cartucho de proyección de imagen colocando el adaptador de cabeza primero, seguido por colocar el animal hacia abajo. Asegúrese de que la cabeza se encuentra en el centro de la cinta.
4. Coloque la placa superior de la cinta en la parte superior y apriete los pomos de ajuste hasta 17 mm.
5. Una vez que el animal está seguro en el cartucho de proyección de imagen, proceder a la proyección de imagen al insertar el cassette en la estación de acoplamiento interna del sensor de la FMT, de donde el isoflurano se bombea para mantener el animal anestesiado.
6. Ejecutar el sensor y analizador de software haciendo doble clic en el icono del software.
7. En la ventana de "Pestaña Experimental", seleccione la "Base" y "Grupo de estudio".
8. Vaya a la ventana de "Ficha de análisis" y seleccione al tema a la imagen haciendo clic en "seleccionar tema". Además, seleccionar el canal de láser en el panel de "Canal de láser". Las células FP635 marcado, seleccione "láser canal 635 nm" y para las células FP720 marcado, seleccione "canal 680 nm láser".
9. Adquirir una imagen haciendo clic en la opción de "Capturar" en la ventana de "Ficha de análisis". Luego, ajuste el campo de exploración haciendo clic y arrastrando el campo de exploración de la imagen capturada a un número determinado de lugares de origen, generalmente dentro de las fuentes 20-25 para el lado ipsolateral.
10. Marque la opción "Agregar a cola de reconstrucción" y "Scan" del golpe en la ventana de "Ficha de análisis".
11. Espere hasta que el escaneo se completa y retire el cartucho de proyección de imagen de la docking station.
12. Retire la placa superior del cassette y coloque el dorso del animal en la jaula.
13. Repita los pasos 3.1 3.12 para el resto de los animales.

4. Análisis de la imagen

1. Desde el software del imager y analizador, seleccione la ventana de "Ficha de análisis".
2. Cargar el dataset y el objeto a analizar haciendo clic en el botón "+" en el panel de "Selección de conjunto de datos" de la ventana de "Ficha de análisis".
3. Una vez que la imagen se ha cargado en la ventana de "Ficha de análisis", realizar la región de análisis de interés (ROI) seleccionando el icono elipsoide, situado en la esquina superior izquierda de la ventana de "Ficha de análisis".
4. Ajuste el umbral a cero en el panel de "datos de la estadística" a la derecha haga clic en la columna de "umbral" en la ventana de "Ficha de análisis".
5. El valor total en el panel de "Datos de la estadística" representa la señal de las células de glioblastoma con etiquetas fluorescentes implantadas en el cerebro de ratón.
6. Repita los pasos del 4.2-4.4 para el resto de los animales. Cargar o eliminar un nuevo tema haciendo clic en el "+" o "−", respectivamente, en el panel de "Selección de conjunto de datos" de la ventana de "Ficha de análisis".
   Nota: Para obtener más información acerca de la proyección de imagen de FMT y operación del software, consulte^20.

Resultados

Glioblastoma de células U87EGFRvIII (células U87 sobre-expresando la variante del receptor de EGF III) fueron cultivadas según el paso 1.2. Lentivirus fue producido y purificado según el paso 1.1. Determinó la concentración viral p24 análisis de ELISA. Las células fueron transduced con lentivirus con proteínas fluorescentes infrarrojos según paso 1.8. El plásmido FP720^10,11 de la codificación fue amablemente proporcion...

Discusión

Xenoinjertos tumorales se han utilizado en la investigación del cáncer y se ha desarrollado una serie de técnicas de imagen bien establecidas: BLI; resonancia magnética (MRI); tomografía de emisión de positrones (PET), computada (CT); FMT. Cada uno de estos enfoques viene con pros y contras, pero al final se complementan con el tipo de informaciones. Uno de los más utilizados en vivo tecnología de imagen es BLI^5,6,7

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/High Glucose	HyClone/GE	SH30022.1
DMEM/F12 1:1	Gibco	11320-082
FBS	HyClone/GE	SH30071.03
Accutase	Innovative cell technologies	AT-104
Trypsin	HyClone/GE	SH30236.01
B27 supplement	Gibco	17504044
human recombinant EGF	Stemcell Technologies	2633
human recombinant FGF	Stemcell Technologies	2634
DPBS	Corning	21-031-00
FACS tubes	Falcon	352235
DAPI	ThermoFisher Scientific	62248
Blasticidin	ThermoFisher Scientific	A1113903
p24 ELISA	Clontech	632200
Xylazine	Akorn	NDC 59399-110-20
Ketamine	Zoetis	NADA 043-403	Controlled substance
Ointment	Dechron	NDC 17033-211-38
Absorbable suture	CpMedical	VQ392
5 ul syringe	Hamilton	26200-U	Catalog number as sold by Sigma-Aldrich
Cell Sorter	Sony	SH8007
Mouse stereotaxic frame	Stoelting	51730
Motorized stereotaxic injector	Stoelting	53311
Micromotor hand-held drill	Foredom	K1070
Mouse warming pad	Ken Scientific Corporation	TP-22G
Fluorescence Tomography System	PerkinElmer	FMT 2500 XL
TrueQuant Imaging Software	Perkin Elmer	7005319
Ultra-centrifuge Optima L-80 XP	Beckman Coulter	392049
Tissue Culture 100mm Dishes	Olympus Plastics	25-202
Tissue Culture 150mm Dishes	Olympus Plastics	25-203
Tissue Culture Flasks T75	Corning	430720U
50 mL conical tubes	Corning	430290
15 mL conical tubes	Olympus Plastics	28-101
Centrifuge Avanti J-20	Beckman Coulter	J320XP-IM-5
Tube, Polypropylene, Thinwall, 5.0 mL	Beckman Coulter	326819
Tube, Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm	Beckman Coulter	326823
Athymic nude mice	Charles River Laboratories	Strain Code  490 (Homozygous)	Prior approval by the Institutional Animal Care Program and by the Institutional Biosafety Committee required.