Fluorescenza tomografia molecolare per l'Imaging In Vivo di Glioblastoma xenotrapianti

Riepilogo

Orthotopic iniezione intracranico delle cellule del tumore è stato utilizzato nella ricerca sul cancro per studiare la biologia del tumore di cervello, la progressione, evoluzione e risposta terapeutica. Qui presentiamo la tomografia molecolare fluorescenza degli xenotrapianti del tumore, che fornisce in tempo reale videomicroscopia imaging e quantificazione di un tumore di massa in modelli preclinici di glioblastoma.

Abstract

Carcinogenicità è la capacità delle cellule tumorali di formare un tumore massa. Un approccio ampiamente utilizzato per determinare se le cellule sono cancerogene è iniettare per via sottocutanea topi immunodeficienti con le cellule tumorali e misurando la massa tumorale dopo diventa visibile e palpabile. Orthotopic iniezioni di cellule tumorali mirano a introdurre xenotrapianto nel microambiente che assomiglia maggiormente il tessuto di origine del tumore in fase di studio. Ricerca sul cancro cervello richiede intracranica iniezione delle cellule tumorali per consentire la formazione del tumore e l'analisi nel microambiente unico del cervello. L'imaging in vivo degli xenotrapianti intracranici controlla istantaneamente la massa di tumore dei topi orthotopically innestate. Qui segnaliamo l'uso di fluorescenza molecolare tomografia (FMT) di xenotrapianti del tumore di cervello. Le cellule tumorali sono in primo luogo trasdotte con vicino infrarosse proteine fluorescenti e poi iniettate nel cervello di topi immunocompromessi. Gli animali vengono poi analizzati per ottenere informazioni quantitative circa la massa di tumore per un periodo prolungato di tempo. Cellula pre-etichettatura consente la quantificazione costo effettiva, riproducibile e affidabile del carico del tumore all'interno di ogni mouse. Abbiamo eliminato la necessità di iniettare imaging substrati e riducendo lo stress sugli animali. Una limitazione di questo approccio è rappresentata dall'incapacità di rilevare le masse molto piccole; Tuttavia, esso ha una migliore risoluzione per più grandi masse rispetto ad altre tecniche. Può essere applicato per valutare l'efficacia di un trattamento farmacologico o alterazioni genetiche di linee cellulari di glioma e campioni paziente.

Introduzione

Il cancro è una delle principali cause di decessi per malattia in esseri umani nel mondo industrializzato. Con un altissimo numero di morti, nuovi trattamenti sono urgentemente necessari. Multiforme di glioblastoma (GBM) è un tipo estremamente letale di cancro al cervello, composto da popolazioni eterogenee delle cellule stromal ed immuni del tumore, di cervello. Secondo la registrazione del tumore di cervello centrale degli Stati Uniti, l'incidenza dei tumori cerebrali primari maligne e benigne è circa 22 casi per 100.000. Circa 11.000 nuovi casi dovrebbero essere diagnosticati negli USA nel 2017¹.

Gli studi preclinici indagare la probabilità di una droga, procedura o trattamento per essere efficace prima della prova in esseri umani. Uno dei primi passi di laboratorio negli studi preclinici è identificazione di potenziali bersagli molecolari per il trattamento farmacologico tramite cellule tumorali impiantate in un organismo ospite, definito come modelli di xenotrapianto umano. In questo contesto, i modelli di xenotrapianto del tumore cerebrale intracranica utilizzando xenotrapianti paziente-derivati (PDXs) sono stati ampiamente usati per studiare la biologia del tumore di cervello, la progressione, evoluzione e risposta terapeutica e più recentemente per lo sviluppo di biomarcatori, droga screening e personalizzata medicina^2,3,4.

Uno dei più accessibili e non invasiva in vivo imaging metodi per monitorare gli xenotrapianti intracranici è bioluminescenza imaging (BLI)^5,6,7,8. Tuttavia, alcune limitazioni di BLI includono amministrazione di substrato e disponibilità, stabilità enzimatica e luce tempra e dispersione durante imaging acquisizione⁹. Qui segnaliamo l'infrarosso FMT in alternativa metodo per monitorare i modelli preclinici di glioblastoma di imaging. In questo metodo, l'acquisizione del segnale e la quantificazione di PDXs intracranially impiantati, che esprime una proteina fluorescente vicino infrarosso iRFP720^10,11 (d'ora in poi definito come FP720) o turboFP635 (d'ora in poi definito come FP635), viene eseguita con un sistema di imaging di FMT. Utilizzando la tecnologia FMT, orthotopic i tumori possono essere monitorati in vivo prima, durante o dopo il trattamento, in modo non invasivo, privo di substrato e quantitativo per osservazioni precliniche.

Protocollo

L'uso di animali di ricerca sperimentale e agenti infettivi, quali lentivirus trasduce le cellule tumorali, richiedono la previa approvazione dal programma istituzionale cura degli animali e dal Comitato istituzionale biosicurezza. Questo protocollo segue le indicazioni di cura degli animali dell'Università della California di San Diego (UCSD).

1. etichettatura delle cellule di Glioblastoma con FP635 o costrutto FP720

1. Produrre e purificare lentivirus secondo il protocollo descritto da Tiscornia et al. ¹²
2. Circa 2.0 x 10⁶ cellule da una linea di cellule di glioma umano DMEM con 10% siero bovino fetale (FBS) in un piatto di 15 cm; o cultura 2.0 x 10⁶ glioblastoma umano paziente-derivato (GBM-PDX) sfere con DMEM/F12 1:1 medium con B27 supplemento più umano ricombinante fattore di crescita epidermico (EGF; 20 ng/mL) e FGF (10 ng/mL) in un matraccio da T75.
3. Mantenere tutte le celle a 37 ° C, 5% CO₂e 100% di umidità relativa.
4. Dissociare le cellule.
   1. Per le cellule di glioma: rimuovere il surnatante delle placche e l'aggiunta di 3-5 mL di tripsina 1 X per le cellule di glioma.
   2. Per il GBM sfere: raccogliere le cellule pipettando le cellule in una provetta da 15 mL.
      1. Rotazione verso il basso le sfere GBM a 200 x g per 5 min utilizzando una centrifuga da tavolo a temperatura ambiente.
      2. Rimuovere il supernatante e aggiungere 3-5 mL di soluzione di distacco delle cellule.
   3. Incubare tutte le celle a 37 ° C per 10-15 min.
5. Attentamente dissociare le cellule pipettando su e giù per diverse volte (accertarsi che siano completate le cellule di glioma e sfere dissociato) e spin giù a 200 x g per 5 min.
6. Rimuovere il supernatante e risospendere le cellule con 5 mL di terreno pipettando su e giù più volte. Determinare l'attuabilità delle cellule dall'esclusione del blu di trypan.
7. Piastra di 1.0 x 10⁶ delle cellule bersaglio in un piatto di 10 cm con 5 mL di terreno di pipettaggio.
8. Trasducono cellule con lentivirus che esprimono le proteine fluorescenti alle molteplicità di infezione (MOI) 5 come è descritto da Tiscornia et al. ¹² e incubare a 37 ° C.
9. Dopo 24 h, rimuovere il supporto dalle cellule trasdotte, aggiungere 5 mL di terreno nuovo e incubare per altre 48 ore a 37 ° C.
10. Dissociare le cellule infette in sospensione unicellulare come descritto nei passaggi 1.4-1.6. Rotazione verso il basso le cellule a 200 x g per 5 min e risospendere in 500 µ l di soluzione di ordinamento (tampone fosfato salino (PBS) con 1% FBS).
11. Dispensare la sospensione delle cellule in provetta di FACS. Co-macchia le celle con 1 µ l/mL di 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) dicloridrato di escludere le cellule morte. Controlli negativi sono necessari per impostare le porte di cytometer di flusso (cellule non trasdotte e cellule non trasdotte / DAPI macchiato).
12. Ordinare le cellule fluorescenti-positivo/DAPI-negativo in ordinamento soluzione, come descritto da Basu et al. ¹³e raccogliere le cellule ordinate in una provetta conica da 15 mL.
13. Rotazione verso il basso le cellule ordinate a 200 x g per 5 min, rimuovere il supernatante e risospendere in 5 mL di terreno di coltura. Seme le cellule ordinate in un piatto di 10 cm di pipettaggio. Incubare a 37 ° C per almeno 48-72 h.
14. Espandere le cellule ordinate dissociando le cellule come segue: 1.4-1.6 e placcatura in più piatti per gli esperimenti in vivo .
    Nota: Per ulteriori dettagli sulla cella ordinamento preparazione e purificazione, vedere Basu et al. ¹³

2. iniezione intracranico delle cellule di Glioblastoma iRFP-etichetta in topi immunodeficienti

Nota: Prima di iniziare l'intervento chirurgico, assicurarsi che la sala operatoria e gli strumenti sono puliti per la procedura. Utilizzare immunodeficienti topi nudi athymic (Foxn1^nu) maschi o femminili, tra 4-5 settimane vecchie e 17-19 g per iniezioni intracraniche. Gli animali devono essere alloggiati per almeno 3 giorni dopo l'arrivo e prima della chirurgia.

1. Preparazione delle cellule
   1. Raccolto e dissociare fluorescente positiva-glioma cellule in sospensione unicellulare (passaggi 1.4-1.6) e risospendere 0.5 o 1.0 x 10⁶ cellule in 2-5 µ l di PBS per iniezione per animale. Dispensare la sospensione cellulare in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL e posto sul ghiaccio.
2. Amministrazione e preparazione di anestesia
   1. Preparare 200 µ l di soluzione fisiologica contenente ketamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) per 20 grammi di peso corporeo del mouse. Pesare gli animali e calcolare la dose appropriata di anestesia.
   2. Fornire un'iniezione intraperitoneale dell'anestesia e applicare unguento oftalmico agli occhi per prevenire la disidratazione. Per maggiori dettagli su questa operazione, vedere Kathleen et al. ¹⁴ Place l'animale su un pad termico acqua pre-riscaldata a 37 ° C.
   3. Controllare che gli animali sono anestetizzati dal monitoraggio della risposta di pizzico di punta (pedale reflex), di solito entro 5-10 min.
3. Intracranica iniezione
   1. Caricare un 5 µ l siringa Hamilton (ago a punta smussata) con sospensione cellulare e montare nel porta-sonda.
   2. Posizionare il mouse in una piccola cornice stereotassica animale e fissate la testa utilizzando le barre di orecchio e l'adattatore di incisivo seguendo i dettagli descritti da Cetin et al. ¹⁵
   3. Disinfettare la testa con soluzione 70% di etanolo e betadine. Assicurarsi che è completato il sito chirurgico sterile. Eseguire un'incisione centrale con un piccolo bisturi e separare la pelle e i tessuti connettivi.
   4. Posizionare la siringa Hamilton sul punto di bregma utilizzando il micromanipolatore.
   5. Spostare la sonda titolare 1,0 mm anteroposteriore e 2.0 mm laterale dal punto di bregma. Segnare con una matita la posizione.
   6. In questa posizione, attentamente fare un buco nel cranio con un trapano portatile micromotore da esercitando una leggera pressione verso il basso fino a quando i vasi sanguigni diventano visibili. Non interrompere il parenchima aracnoide mater e cervello.
   7. Introdurre l'ago nel foro della bava e avanzare 3,0 mm sotto la superficie pial.
   8. Impostare il volume (2-5 µ l) e portata (1 µ l/min) di iniezione utilizzando un iniettore stereotassica motorizzato o eseguire manualmente l'iniezione.
   9. Dopo l'iniezione, rimuovere l'ago gradualmente salendo 1,0 mm ogni 1 min e pulire il sito di iniezione con etanolo al 70%.
   10. Nelle vicinanze la pelle ferita con graffette chirurgiche o facendo le suture chirurgiche (spesso denominate punti di sutura) e vedere Kathleen et al. ¹⁴ per maggiori dettagli.
4. Recupero degli animali
   1. Trasferire l'animale a un pad termico acqua (37 ° C) e monitorare la temperatura corporea, frequenza respiratoria e frequenza cardiaca, fino al recupero completo. Amministrare l'analgesia per protocolli standard.
      Nota: Per ulteriori informazioni sulla procedura stereotassica, chirurgia e coordinate, vedere altri rapporti^5,14,15.

3. FMT Imaging

Nota: Secondo lo scopo sperimentale, il glioblastoma iRFP-etichettate le cellule possono essere monitorati in vivo prima, durante o dopo il trattamento. Per scopo di imaging, anestetizzare gli animali utilizzando una camera di induzione di isoflurano, mantenere in una cassetta di formazione immagine durante la scansione e immagine nell'alloggiamento del dispositivo di imaging FMT.

1. Rimuovere l'animale dalla gabbia e posto nella camera di induzione di isoflurane. Chiudere la camera e attivare il flusso di ossigeno e vaporizzatore per 3-5%.
2. Monitorare l'animale fino a quando esso è completamente anestetizzato, solitamente entro 1-2 min inconscio animali non devono rispondere agli stimoli esterni.
3. Rimuovere l'animale anestetizzato dalla camera e mettere l'animale nella cassetta imaging inserendo l'adattatore testa in primo luogo, seguita dall'immissione dell'animale rivolto verso il basso. Assicurarsi che la testa si trova nel centro della cassetta.
4. Mettere la piastra superiore della cassetta e serrare le manopole di regolazione fino a 17 mm.
5. Una volta che l'animale è sicuro nella cassetta di imaging, procedere all'imaging di avere inserito la cartuccia nell'alloggiamento interno del dispositivo di imaging FMT, dove l'isoflurano è pompato per tenere l'animale anestetizzato.
6. Eseguire il software imager e analizzatore facendo doppio clic sull'icona del software.
7. Nella finestra "Scheda sperimentale", selezionare il "Database" e "Gruppo di studio".
8. Passare alla finestra "Scheda scansione" e selezionare l'oggetto immagine facendo clic su "Seleziona il soggetto". Inoltre, è possibile selezionare il canale di laser nel pannello "Canale Laser". Per le cellule FP635-etichetta, selezionare "laser canale 635 nm" e per le cellule FP720-labeled, selezionare "canale 680 nm del laser".
9. Acquisire un'immagine facendo clic sull'opzione "Cattura" nella finestra "Scheda di scansione". Quindi, regolare il campo di scansione facendo clic e trascinando il campo di scansione dell'immagine acquisita a un determinato numero di posizioni di origine, solitamente entro 20-25 fonti per il lato ipsilateral.
10. Selezionare l'opzione "Aggiungi alla coda di ricostruzione" e colpire "Scan" nella finestra "Scheda di scansione".
11. Attendere fino a quando la scansione è completata e quindi rimuovere la cassetta imaging dalla docking station.
12. Rimuovere la piastra superiore della cassetta e posto sul retro degli animali in gabbia.
13. Ripetere i passaggi 3.1-3.12 per il resto degli animali.

4. image Analysis

1. Dal software imager e analizzatore, selezionare la finestra "Scheda di analisi".
2. Caricare il dataset e il soggetto per analizzare facendo clic sul pulsante "+" nel pannello "Dataset selezione" della finestra "Scheda di analisi".
3. Una volta che l'immagine è stata caricata nella finestra "Scheda di analisi", è possibile eseguire la regione di analisi di interesse (ROI) selezionando l'icona dell'elissoide, situato nell'angolo superiore sinistro della finestra "Scheda di analisi".
4. Regolare la soglia a zero nel pannello "dati statistici" facendo clic con il pulsante destro del mouse su colonna "soglia" nella finestra "Scheda di analisi".
5. Il valore totale nel pannello "Dati statistici" rappresenta il segnale dalle cellule fluorescenti-etichetta glioblastoma impiantate nel cervello del topo.
6. Ripetere i passaggi da 4.2-4.4 per il resto degli animali. Caricare o rimuovere un nuovo soggetto cliccando il "+" o "−" pulsante, rispettivamente, nel pannello "Dataset selezione" della finestra "Scheda di analisi".
   Nota: Per ulteriori informazioni sul FMT imaging e il funzionamento del software, vedere^20.

Risultati

U87EGFRvIII di cellule di glioblastoma (cellule U87 che sovraesprimono la variante del recettore di EGF III) sono state coltivate secondo il punto 1.2. Lentivirus è stato prodotto e purificato secondo punto 1.1. La concentrazione virale è stata determinata da p24 analisi di ELISA. Le cellule sono state trasdotte con lentivirus portando a infrarossi proteine fluorescenti secondo punto 1.8. Il plasmide codifica FP720^10,11 è stato...

Discussione

Gli xenotrapianti del tumore sono stati ampiamente utilizzati nella ricerca sul cancro ed è stato sviluppato un numero di consolidate tecniche di imaging: BLI; risonanza magnetica (MRI); tomografia a emissione di positroni (PET), computata tomografia (CT); FMT. Ciascuno di questi approcci è dotato di Pro e contro, ma in definitiva completano a vicenda con il tipo di informazioni fornite. Uno del più comunemente usato in vivo tecnologia di imaging è BLI^5,6<...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/High Glucose	HyClone/GE	SH30022.1
DMEM/F12 1:1	Gibco	11320-082
FBS	HyClone/GE	SH30071.03
Accutase	Innovative cell technologies	AT-104
Trypsin	HyClone/GE	SH30236.01
B27 supplement	Gibco	17504044
human recombinant EGF	Stemcell Technologies	2633
human recombinant FGF	Stemcell Technologies	2634
DPBS	Corning	21-031-00
FACS tubes	Falcon	352235
DAPI	ThermoFisher Scientific	62248
Blasticidin	ThermoFisher Scientific	A1113903
p24 ELISA	Clontech	632200
Xylazine	Akorn	NDC 59399-110-20
Ketamine	Zoetis	NADA 043-403	Controlled substance
Ointment	Dechron	NDC 17033-211-38
Absorbable suture	CpMedical	VQ392
5 ul syringe	Hamilton	26200-U	Catalog number as sold by Sigma-Aldrich
Cell Sorter	Sony	SH8007
Mouse stereotaxic frame	Stoelting	51730
Motorized stereotaxic injector	Stoelting	53311
Micromotor hand-held drill	Foredom	K1070
Mouse warming pad	Ken Scientific Corporation	TP-22G
Fluorescence Tomography System	PerkinElmer	FMT 2500 XL
TrueQuant Imaging Software	Perkin Elmer	7005319
Ultra-centrifuge Optima L-80 XP	Beckman Coulter	392049
Tissue Culture 100mm Dishes	Olympus Plastics	25-202
Tissue Culture 150mm Dishes	Olympus Plastics	25-203
Tissue Culture Flasks T75	Corning	430720U
50 mL conical tubes	Corning	430290
15 mL conical tubes	Olympus Plastics	28-101
Centrifuge Avanti J-20	Beckman Coulter	J320XP-IM-5
Tube, Polypropylene, Thinwall, 5.0 mL	Beckman Coulter	326819
Tube, Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm	Beckman Coulter	326823
Athymic nude mice	Charles River Laboratories	Strain Code  490 (Homozygous)	Prior approval by the Institutional Animal Care Program and by the Institutional Biosafety Committee required.