Vivo에서 이미징 세포종 Xenografts의 형광 분자 단층 촬영

요약

종양 세포의 Orthotopic intracranial 주사 공부 뇌 종양 생물학, 진행, 진화, 그리고 치료 응답을 암 연구에 사용 되었습니다. 여기 선물이 형광 분자의 단층 촬영 종양 xenografts 실시간 intravital 이미징 및 종양의 정량화 임상 세포종 모델에서 대량 제공.

초록

Tumorigenicity는 종양을 형성 하는 암 세포의 기능 대량. 널리 사용 방식은 셀 tumorigenic 확인 암 세포와 immunodeficient 쥐를 피하 주입 되 고 만져 서 후 종양 질량을 측정 하 여. 암 세포의 Orthotopic 주사 가장 밀접 하 게 공부 되 고 종양의 기원의 조직 microenvironment에이 종이 식을 소개 하고자 합니다. 뇌 암 연구의 암 세포는 뇌의 독특한 microenvironment에서 종양 형성과 분석 수 있도록 intracranial 주입을 필요 합니다. Vivo에서 이미징 intracranial xenografts의 즉시 orthotopically engrafted 쥐의 종양 질량을 모니터링합니다. 여기 우리 뇌 종양 xenografts의 형광 분자 단층 (FMT)를 사용 하 여를 보고합니다. 암 세포는 먼저 가까운 적외선 형광 단백질으로 불리고 하 고 immunocompromised 쥐의 뇌에 주입. 동물 다음 시간의 연장된 기간 동안 종양 질량에 대 한 정량적 정보를 검색 합니다. 셀 라벨 미리 각 마우스에서 종양의, 재현성, 비용 효과적이 고 신뢰할 수 있는 정량화 할 수 있습니다. 우리는 이미징 기판, 주입에 대 한 필요성을 제거 하 고 따라서 동물에 스트레스 감소. 이 접근의 제한; 매우 작은 질량을 감지 하는 무 능력에 의해 표시 됩니다. 그러나, 그것은 다른 기술 보다 더 큰 대 중을 위한 더 나은 해결책이 있다. 그것은 약물 치료의 효 험 또는 glioma 셀 라인 및 환자 파생 된 샘플의 유전 변경 평가에 적용할 수 있습니다.

서문

암은 산업화 된 세계에서 인간에서 질병 관련 된 죽음의 주요 원인 중 하나입니다. 매우 높은 사망자와 새로운 처리는 시급히 필요. 세포종 님 (GBM)는 매우 치명적인 뇌 암, 뇌 종양, 실질, 그리고 면역 세포의 이질적인 인구의 구성 유형의 이다. 미국의 중앙 두뇌 종양 레지스트리 따르면 기본 악성 및 비 악성 뇌종양의 발생률 100000 당 대략 22 경우입니다. 약 11, 000의 새로운 사례는 2017¹미국에서 진단 되는으로 예상 된다.

전 임상 연구는 마약, 절차, 또는 인 간에 있는 테스트 전에 효과적 치료의 가능성을 조사. 전 임상 연구의 초기 실험실 단계 중 하나는 인간의 종이 식 모델로 정의 호스트 유기 체에 이식 하는 암 세포를 사용 하 여 약물 치료에 대 한 잠재적인 분자 표적 식별 됩니다. 이 컨텍스트에서 intracranial 뇌 종양이 종이 식 모델 환자 파생 xenografts (PDXs)를 사용 하 여 널리 사용 된 뇌 종양 생물학, 진행, 진화, 그리고 치료 응답, 연구와 바이오 마커 개발에 대 한 더 많은 최근 마약 검사, 및 맞춤 의학^2,,34.

가장 저렴 하 고 비-침략 적 vivo에서 이미징 intracranial xenografts 모니터링 하는 방법 중 하나입니다 생물 발광 영상 (BLI)^5,6,,78. 그러나, 일부 씨 한계는 기판 관리 및 가용성, 효소 안정성, 그리고 가벼운 냉각 및 수집⁹이미징 동안 비 산을 포함 합니다. 여기 우리는 이미징 방법 전 임상 세포종 모델을 모니터링 하는 대신 적외선 FMT를 보고 합니다. 이 방법, 신호 수집 및 intracranially 이식된 PDXs의 정량화에 표현 한 근 적외선 형광 단백질 iRFP720^10,11 (FP720 이제 되 나) 또는 turboFP635 (이제 되 나 FP635), 이미징 시스템 FMT와 함께 수행 됩니다. FMT 기술을 사용 하 여, 종양 수 orthotopic 모니터링 비보 전에, 동안, 또는 치료, 임상 관찰에 대 한 비-침략 적, 기판 및 양적 방식.

프로토콜

실험적인 연구 동물 lentivirus transduce 암 세포를 같은 전염 성 요원의 활용 기관 동물 관리 프로그램 및 기관 biosafety 위원회에 의해 사전 승인을 받아야 합니다. 이 프로토콜은 캘리포니아 대학 샌디에고 (UCSD)의 동물 보호 지침을 따릅니다.

1. FP635 또는 FP720 구문 세포종 세포의 라벨

1. 생산 및 Tiscornia 그 외 여러분 에 의해 설명 하는 프로토콜에 따라 lentivirus 정화 ¹²
2. DMEM 플러스 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 15 cm 접시; 인간의 glioma 셀 라인에서 문화 약 2.0 x 10⁶ 셀 DMEM과 문화 2.0 x 10⁶ 인간의 세포종 환자 파생 (GBM-PDX) 분야 또는 F12 B27와 1:1 매체와 인간 재조합 표 피 성장 인자 (EGF, 20 ng/mL) 및 FGF 보완 / (10 ng/mL) T75 플라스 크에.
3. 모든 셀에서 37 ° C, 5% CO₂, 그리고 100% 상대 습도 유지 합니다.
4. 세포 분열
   1. Glioma 셀:는 상쾌한 접시에서 제거 하 고 glioma 세포를 트립 신 1 X의 3-5 mL를 추가.
   2. GBM 분야: 15 mL 튜브에 세포를 pipetting으로 세포를 수집.
      1. 탁상 원심 분리기를 사용 하 여 실 온에서 5 분 동안 200 x g에 GBM 분야 아래로 회전 합니다.
      2. 제거는 상쾌한 고 세포 분리 솔루션의 3-5 mL를 추가 합니다.
   3. 10-15 분 동안 37 ° C에서 모든 셀을 품 어.
5. 조심 스럽게 몇 번 위아래로 pipetting으로 세포 분열 (분야 및 glioma 셀 완료 해리) 및 5 분 동안 200 x g에 아래로 회전.
6. 상쾌한을 제거 하 고 여러 번 위아래로 pipetting으로 매체의 5 mL로 세포를 resuspend. Trypan 블루 제외 하 여 세포 생존 능력을 결정 합니다.
7. 플레이트 1.0 x 10⁶ 10 cm 접시에 대상 셀의 pipetting으로 매체의 5 mL와 함께.
8. 감염 (MOI) Tiscornia 그 외 여러분 에 의해 설명 된 대로 5의 다양성에서 형광 단백질을 표현 lentivirus와 셀 transduce ¹² 고 37 ° c.에 품 어
9. 24 시간 후 transduced 세포에서 매체를 제거, 신선한 매체의 5 mL를 추가 하 고 37 ° c.에 추가 48 h에 대 한 품 어
10. 1.4-1.6 단계에 설명 된 대로 단일 셀 서 스 펜 션에 감염 된 세포를 분리. 5 분 동안 200 x g에서 셀 아래로 회전 하 고 솔루션을 정렬의 500 µ L에서 resuspend (인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 1 %FBS).
11. FACS 튜브에 세포 현 탁 액을 플라스틱. 공동의 4', 죽은 세포를 제외 하려면 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) dihydrochloride 1 µ L/mL로 세포 얼룩. 네거티브 컨트롤 흐름 cytometer 게이츠를 설정 하는 데 필요한 (비 불리고 세포와 세포 transduced 비 DAPI 스테인드 /).
12. Basu 외 에 설명 된 대로 솔루션을 정렬에 DAPI 음수가 형광 양성 세포를 정렬 ¹³, 15 mL 원뿔 튜브로 정렬된 셀을 수집.
13. 5 분 동안 200 x g에서 정렬된 셀 아래로 회전 시키십시오, 상쾌한, 제거 하 고 문화 매체의 5 mL에 resuspend. 시드 pipetting으로 10 cm 접시에 정렬 된 셀입니다. 적어도 48 72 h에 대 한 37 ° C에서 품 어.
14. 해리 셀 정렬된 셀 확장 단계 1.4-1.6 그리고 vivo에서 실험에 대 한 여러 요리에 도금.
    셀 정렬 준비 및 정화에 대 한 자세한 내용은 참고: Basu 외. ¹³

2. intracranial 주입 세포종 세포 iRFP 태그의 Immunodeficient 마우스

참고: 시작 하기 전에 수술, 수술 실 및 도구 절차에 대 한 깨끗 한 되어 있는지 확인. Immunodeficient athymic 누드 (Foxn1^nu) 남성 또는 여성 쥐, 4-5 주 오래 된과 intracranial 주사에 대 한 17-19 g 사이 사용 합니다. 도착 후 그리고 수술 전에 동물은 적어도 3 일 동안 보관 한다.

1. 세포 준비
   1. 수확 하 고 형광 긍정적인 glioma 셀 단일 세포 현 탁 액 (1.4-1.6 단계)로 해리 동물 당 주입 당 PBS의 2-5 µ L에서 0.5 또는 1.0 x 10⁶ 셀 resuspend. 얼음에 장소와 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 플라스틱.
2. 마 취 준비 및 관리
   1. 케 타 민 (100mg/kg) 및 마우스 몸 무게의 20 그램 당 xylazine (10 mg/kg)를 포함 하는 염 분 해결책의 200 µ L를 준비 합니다. 그리고 무게는 동물 마 취의 적절 한 복용량을 계산.
   2. 마 취의 복 주사를 제공 하 고 탈수를 방지 하기 위해 눈에 안과 연 고를 적용. 이 단계에 대 한 자세한 내용은 참조 캐슬 린 외. ¹⁴ 장소 37 ° c.에 미리 데워 진된 물 열 패드에 동물
   3. 그는 동물은 취 발가락 핀치 응답 (페달 반사), 모니터링 하 여 일반적으로 5-10 분 이내 확인 하십시오.
3. Intracranial 주입
   1. 5 µ L 로드 세포 현 탁 액 및 프로브 홀더에서 마운트 해밀턴 주사기 (바늘 무뚝뚝한 끝).
   2. 작은 동물 정위 적 프레임에 마우스를 놓고 귀 바, Cetin 외. 설명된 내용을 따라 니 어댑터를 사용 하 여 머리를 수정 ¹⁵
   3. 70% 에탄올과 betadine 솔루션으로 머리를 소독. 있는지 확인 외과 사이트 완료 살 균 합니다. 작은 메스와 중간 절 개를 수행 하 고 피부와 연결 어 조직.
   4. 해밀턴 주사기는 micromanipulator를 사용 하 여 bregma 지점에 놓습니다.
   5. 프로브 홀더 1.0 m m anteroposterior와 2.0 m m 측면 bregma 지점에서 이동 합니다. 이 위치를 연필로 표시 합니다.
   6. 이 위치에서 주의깊게 확인 구멍 두개골에 micromotor 휴대용 드릴 혈관 표시 될 때까지 아래쪽으로 약간의 압력을 적용 하 여. 거미 집 모양의 교 및 뇌 실질을 방해 하지 않습니다.
   7. 버 구멍에 바늘을 소개 하 고 사전 pial 표면 아래 3.0 m m.
   8. 볼륨 (2-5 µ L) 및 유량 (1 µ L/min) 사출 동력된 stereotaxic 인젝터를 사용 하 여 설정 하거나 수동으로 주사를 수행 합니다.
   9. 주입 후 1.0 m 마다 1 분을 오름차순으로 바늘을 점차적으로 제거 하 고 70% 에탄올 주사 사이트를 청소 합니다.
   10. 가까운 피부 상처 수술 스테이플 또는 외과 봉합 (바늘이 라고도 함) 하 여 고 캐슬 린 외. ¹⁴ 대 한 자세한 내용입니다은.
4. 동물 복구
   1. 동물 물 열 패드 (37 ° C)에 전송 하 고 전체 복구까지 체온, 호흡 속도 심장 박동을 모니터링. 표준 프로토콜 당 무 통을 관리 합니다.
      참고: 정위 적 절차에 대 한 자세한 내용은, 수술, 그리고 좌표를 참조 다른 보고서^5,,1415.

3. FMT 이미징

참고: 실험 목표에 따라 iRFP 태그 세포종 세포 수 모니터링 비보 전에, 하는 동안, 또는 치료 후. 목적, 이미징 동물 isoflurane 유도 챔버를 사용 하 여 anesthetize, 스캔 및 이미지 FMT 영상의 도킹 스테이션에서 동안 이미징 카세트에서 유지.

1. 감 금 소 및 isoflurane 유도 실에서 장소에서 동물을 제거 합니다. 챔버를 닫고 산소 흐름 및 기화 기 3-5%.
2. 동물을 모니터링 때까지 그것은 완전히 마 취, 일반적으로 1-2 분 무 의식 내의 동물 해야 응답 하지 외부 자극에.
3. 약 실에서 마 취 동물을 제거 하 고 동물에에서 넣어 이미징 카세트 헤드 어댑터를 먼저 배치 하 여 아래로 향하게 하는 동물을 배치 하 여 다음. 머리는 카세트의 중앙에 위치 하 고 있는지 확인 합니다.
4. 상단에 카세트의 상단 접시를 놓고 17 m m까지 조정 노브를 조입니다.
5. 일단 그 동물 안전에 이미징 카세트, 카세트는 isoflurane 동물 마 취 유지 하 양수는 FMT 영상의 내부 도킹 스테이션에 삽입 하 여 이미지를 진행.
6. 소프트웨어 아이콘을 두 번 클릭 하 여 영상 및 분석기 소프트웨어를 실행 합니다.
7. "실험적인 탭" 창에서 "데이터베이스" 및 "연구 그룹"을 선택 합니다.
8. "스캔 탭" 창에가 고 "제목 선택"을 클릭 하 여 이미지에 주제를 선택 합니다. 또한, "레이저 채널" 패널에 레이저 채널을 선택 합니다. FP635 표시 된 셀에 대 한 "레이저 채널 635 nm"를 선택 하 고 "채널 680 nm 레이저" FP720 표시 된 셀을 선택 합니다.
9. "스캔 탭" 창에서 "캡처" 옵션을 클릭 하 여 이미지를 취득 합니다. 다음을 클릭 하 고 소스 위치, 일반적으로 동측 측에 대 한 20-25 소스 내에서 수를 결정된을 캡처한 이미지에서 검색 필드를 끌어 검색 필드를 조정 합니다.
10. "재건 대기열에 추가" 옵션 확인 하 고 "검색 탭" 창에서 "스캔"을 누르십시오.
11. 스캔 완료 될 때까지 하 고 영상 카세트 도킹 스테이션에서 제거.
12. 카세트의 상단 플레이트를 제거 하 고 감 금 소 동물 다시 넣습니다.
13. 동물의 나머지 부분에 대 한 3.1 3.12 단계를 반복 합니다.

4. 이미지 분석

1. 영상 및 분석기 소프트웨어에서 "분석 탭" 창을 선택 합니다.
2. 데이터 집합의 "분석 탭" 창 "데이터 집합 선택" 패널에서 "+" 버튼을 클릭 하 여 분석을 로드 합니다.
3. 이미지 "분석 탭" 창에서 로드 되 면 "분석 탭" 윈도우의 왼쪽된 상단에 있는 둥글지 아이콘을 선택 하 여 관심 (ROI) 분석의 영역을 수행 합니다.
4. 오른쪽 "분석 탭" 창에서 "임계값" 열을 클릭 하 여 "통계 데이터" 패널에서 0 임계값을 조정 합니다.
5. "통계 데이터" 패널의 총 가치는 쥐의 뇌에 이식 하는 형광 태그 세포종 세포에서 신호를 나타냅니다.
6. 동물의 나머지 부분에 대 한 4.2-4.4 단계를 반복 합니다. 로드 하거나 클릭 하 여 새로운 주제를 제거는 "+" 또는 "−" 버튼, "분석 탭" 창의 "데이터 집합 선택" 패널에 각각.
   : FMT 이미징 및 소프트웨어 동작에 대 한 자세한 내용은 참고^20.

결과

세포종 세포 U87EGFRvIII (U87 셀-EGF 수용 체 변형 III 표현) 1.2 단계에 따라 경작 했다. Lentivirus 생산과 단계 1.1에 따라 정화 했다. 바이러스 농도 p24에 의해 결정 되었다 ELISA 분석. 셀은 lentivirus 단계 1.8에 따르면 적외선 형광 단백질을 운반으로 불리고 있었다. FP720^10,11 인코딩 플라스 미드 박사 V.V. Verkhusha에서 제공한 친절 하 게 그리?...

토론

종양 xenografts 암 연구에 광범위 하 게 사용 되 고 다양 한 잘 설립 된 이미징 기술 개발 되었습니다: 라스; 자기 공명 영상 (MRI); 양전자 방출 단층 촬영 (PET), 계산 된 단층 촬영 (CT); FMT입니다. 각이 방법 마다 장점과 단점을 함께 제공 하지만 궁극적으로 제공 하는 정보의 종류와 서로 보완. 가장 일반적으로 사용 되는 vivo에서 이미징 기술 중 하나입니다 씨^5,

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/High Glucose	HyClone/GE	SH30022.1
DMEM/F12 1:1	Gibco	11320-082
FBS	HyClone/GE	SH30071.03
Accutase	Innovative cell technologies	AT-104
Trypsin	HyClone/GE	SH30236.01
B27 supplement	Gibco	17504044
human recombinant EGF	Stemcell Technologies	2633
human recombinant FGF	Stemcell Technologies	2634
DPBS	Corning	21-031-00
FACS tubes	Falcon	352235
DAPI	ThermoFisher Scientific	62248
Blasticidin	ThermoFisher Scientific	A1113903
p24 ELISA	Clontech	632200
Xylazine	Akorn	NDC 59399-110-20
Ketamine	Zoetis	NADA 043-403	Controlled substance
Ointment	Dechron	NDC 17033-211-38
Absorbable suture	CpMedical	VQ392
5 ul syringe	Hamilton	26200-U	Catalog number as sold by Sigma-Aldrich
Cell Sorter	Sony	SH8007
Mouse stereotaxic frame	Stoelting	51730
Motorized stereotaxic injector	Stoelting	53311
Micromotor hand-held drill	Foredom	K1070
Mouse warming pad	Ken Scientific Corporation	TP-22G
Fluorescence Tomography System	PerkinElmer	FMT 2500 XL
TrueQuant Imaging Software	Perkin Elmer	7005319
Ultra-centrifuge Optima L-80 XP	Beckman Coulter	392049
Tissue Culture 100mm Dishes	Olympus Plastics	25-202
Tissue Culture 150mm Dishes	Olympus Plastics	25-203
Tissue Culture Flasks T75	Corning	430720U
50 mL conical tubes	Corning	430290
15 mL conical tubes	Olympus Plastics	28-101
Centrifuge Avanti J-20	Beckman Coulter	J320XP-IM-5
Tube, Polypropylene, Thinwall, 5.0 mL	Beckman Coulter	326819
Tube, Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm	Beckman Coulter	326823
Athymic nude mice	Charles River Laboratories	Strain Code  490 (Homozygous)	Prior approval by the Institutional Animal Care Program and by the Institutional Biosafety Committee required.