קרינה פלואורסצנטית טומוגרפיה מולקולרית עבור הדמיה In Vivo של גליובלסטומה Xenografts

Summary

הזרקה תוך-גולגולתי Orthotopic של תאים סרטניים שימש בחקר הסרטן ללמוד ביולוגיה גידול במוח, התקדמות, התפתחות, תגובה טיפולית. כאן אנו מציגים פלורסצנטיות מולקולרית טומוגרפיה של גידול xenografts, אשר מספק הדמיה intravital בזמן אמת, כימות של גידול המוני במודלים פרה גליובלסטומה.

Abstract

Tumorigenicity היא היכולת של תאים סרטניים בצורת גידול בנפח גדול. בגישה בשימוש נרחב כדי לקבוע אם התאים נמצאים tumorigenic היא על ידי הזרקת עכברים immunodeficient subcutaneously עם תאים סרטניים, מדידת המסה הגידול אחרי זה הופך להיות גלויים ולא מוחשי. זריקות Orthotopic של התאים הסרטניים שואפים להציג את xenograft ב microenvironment הדומה ביותר את רקמת המוצא של הגידול נחקר. חקר סרטן המוח דורש הזרקה תוך-גולגולתי של תאים סרטניים כדי לאפשר את היווצרות הגידול וניתוח ב microenvironment ייחודי של המוח. אין ויוו ההדמיה של xenografts תוך-גולגולתי מנטרת באופן מיידי גידול המוני של עכברים orthotopically engrafted. כאן אנחנו מדווחים על השימוש של קרינה פלואורסצנטית מולקולרית טומוגרפיה (FMT) של המוח גידול xenografts. התאים הסרטניים קודם transduced עם יד חלבונים פלורסנט אינפרא-אדום, לאחר מכן מוזרק במוח של עכברים immunocompromised. החיות נסרקות כדי לקבל מידע כמותי על המסה הגידול על פני תקופה ארוכה של זמן. תא תיוג מראש מאפשר כימות נטל הגידול בתוך העכבר כל העלות האפקטיבית, לשחזור ואמין. אנחנו ביטלה את הצורך הזרקת סובסטרטים הדמיה, ובכך להפחית את הלחץ על בעלי החיים. מגבלה של גישה זו מיוצגת על ידי חוסר היכולת לזהות גושים קטנים מאוד; עם זאת, יש רזולוציה טובה יותר עבור גושים גדולים יותר מאשר שיטות אחרות. ניתן להחיל אותה כדי להעריך את היעילות של טיפול תרופתי או שינויים גנטיים של שורות תאים glioma ודוגמאות נגזר החולה.

Introduction

סרטן הוא אחד הגורמים המובילים של מחלות הקשורות מקרי מוות בקרב בני-האדם בעולם המתועש. עם מספר ההרוגים גבוה ביותר, טיפולים חדשים נדרשים בדחיפות. גליובלסטומה (GBM) הוא סוג קטלני ביותר של סרטן במוח, המורכב אוכלוסיות הטרוגניות של תאי המוח גידול, סטרומה, ואת המערכת החיסונית. לפי הרישום גידול המוח המרכזי של ארה ב, השכיחות של גידולים במוח העיקרי ממאיר, שאינם ממאירים הוא כ 22 מקרים לכל 100,000. כ 11,000 תיקים חדשים צפויים להיות מאובחנים בארה ב 2017¹.

מחקרים פרה לחקור את הסבירות של סמים, נוהל או טיפול יעיל לפני בדיקות אצל בני אדם. אחד הצעדים המוקדמים מעבדה מחקרים פרה הוא זיהוי פוטנציאל מטרות מולקולריות לטיפול סמים באמצעות תאים סרטניים מוטמן בתוך אורגניזם המארח, כהגדרתו xenograft האנושי מודלים. בהקשר זה, של xenograft גידול מוח תוך-גולגולתי באמצעות החולה נגזר xenografts (PDXs) היה בשימוש נרחב ללמוד ביולוגיה גידול במוח, התקדמות, התפתחות, תגובה טיפולית, ואף לאחרונה לפיתוח סמנים ביולוגיים, סמים הקרנת, ומותאמת אישית רפואה^2,3,4.

אחד הכי פולשני ובמחיר ויוו הדמיה שיטות לעקוב אחר xenografts תוך-גולגולתי היא ביולומינסנציה הדמיה (בלי)^5,6,7,8. עם זאת, מספר מגבלות רבנות בלי לכלול המצע המינהל, זמינות, יציבות אנזים, אור שכבתה ואת פיזור במהלך הדימות רכישת⁹. כאן מדווחים על FMT אינפרא-אדום כחלופה הדמיה שיטה לפיקוח גליובלסטומה פרה מודלים. זו שיטה, רכישת אות, כימות של PDXs intracranially מושתל, ביטוי של חלבון פלואורסצנטי-סגול iRFP720^10,11 (מעתה ואילך כינה FP720) או turboFP635 (מעתה ואילך כינה FP635), הוא הופיע עם FMT מערכת הדמיה. באמצעות הטכנולוגיה FMT, orthotopic גידולים יכולים להיות במעקב בבית vivo לפני, במהלך או לאחר טיפול, בצורה לא פולשנית ללא סובסטרט, כמותיים על תצפיות פרה.

Protocol

השימוש של חיות מחקר ניסיוני מדבקים, כגון lentivirus כדי מגלי התאים הסרטניים, מחייבים אישור מראש על-ידי התוכנית המוסדית טיפול בבעלי חיים, בידי הוועדה המוסדית אבטחה. פרוטוקול זה עוקב אחר הנחיות טיפול בבעלי חיים אוניברסיטת קליפורניה בסן דייגו (UCSD).

1. תיוג של גליובלסטומה תאים עם FP635 או FP720 לבנות

1. לייצר ולטהר lentivirus לפי הפרוטוקול המתואר על-ידי. Tiscornia et al. ¹²
2. תרבות כ 2.0 x 10⁶ תאים קו תא glioma האנושי DMEM בתוספת 10% עוברית שור סרום (FBS) בקערה בגודל 15 ס מ; או תרבות 2.0 x 10⁶ גליובלסטומה האדם החולה נגזר (GBM-PDX) ספירות עם DMEM/F12 בינוני 1:1 עם B27 תוספת פלוס האנושי רקומביננטי גורם הגדילה באפידרמיס (EGF; 20 ng/mL), FGF (10 ng/mL) בבקבוקון T75.
3. לשמור על כל התאים ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ו- 100% לחות יחסית.
4. לבטל את התאים.
   1. עבור התאים glioma: להסיר את תגובת שיקוע של הלוחות והוספת 3-5 מ של טריפסין 1 X בתאי glioma.
   2. עבור GBM ספירות: לאסוף את התאים על ידי pipetting התאים לתוך צינור 15-mL.
      1. ספין למטה הכדורים GBM-200 g x עבור 5 דקות באמצעות צנטריפוגה שולחן בטמפרטורת החדר.
      2. הסר את תגובת שיקוע והוסף 3-5 מ של פתרון ניתוק התא.
   3. דגירה כל התאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות.
5. בזהירות מביצועם בתאים על-ידי pipetting למעלה ולמטה מספר פעמים (להבטיח כי הספירות ותאים glioma יושלמו חלופה מועדפת) ו ספין למטה ב g x 200 במשך 5 דקות.
6. הסר את תגובת שיקוע, resuspend את התאים 5 מ של מדיום על-ידי pipetting למעלה ולמטה מספר פעמים. לקבוע את הכדאיות התא על ידי trypan blue הדרה.
7. צלחת 1.0 x 10⁶ תאי היעד בקערה ס מ-10 עם 5 מ של בינוני על-ידי pipetting.
8. מגלי תאים עם lentivirus המבטאים חלבונים פלורסנט-ריבוי של זיהום (MOI) 5 כפי שמתואר על ידי. Tiscornia et al. ¹² דגירה ב 37 º C.
9. לאחר 24 שעות, להסיר את המדיום של התאים transduced, הוסף 5 מ של בינוני טריים ולאחר תקופת דגירה של 48 שעות נוספות ב 37 º C.
10. לבטל את התאים הנגועים להשעיה תא בודד כפי שמתואר צעדים 1.4-1.6. ספין למטה התאים ב- g x 200 עבור 5 דקות ו resuspend ב µL 500 של מיון פתרון (באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) עם 1% FBS).
11. Pipette התליה תא לתוך צינורות FACS. שיתוף מכתים את התאים עם 1 µL/mL של 4', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (דאפי) כדי לא לכלול תאים מתים. פקדים שלילי נדרשים כדי להגדיר את השערים cytometer זרימה (שאינם transduced תאים ותאים שאינם transduced / דאפי צבעונית).
12. למיין את התאים פלורסנט-חיובי/דאפי-שלילי לתוך מיון הפתרון, כפי שתואר על ידי. Basu et al. ¹³, ולאסוף את התאים ממוינים לתוך צינור חרוטי 15-mL.
13. ספין למטה בתאים ממוינים ב g x 200 עבור 5 דקות, הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend ב 5 מ של תרבות בינוני. זרע בתאים ממוינים מנה ס מ-10 על ידי pipetting. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך לפחות 48-72 שעות.
14. הרחב את התאים ממוינים לפי בריא התאים ביצוע השלבים 1.4-1.6 ו ציפוי מנות מרובות לניסויים ויוו .
    הערה: לקבלת פרטים נוספים אודות התא מיון והכנה טיהור, ראה Basu. et al. ¹³

2. תוך-גולגולתי הזרקת תאי גליובלסטומה מתויג iRFP לתוך Immunodeficient עכברים

הערה: לפני תחילת הניתוח, ודא חדר ניתוח והכלים הם נקיים עבור ההליך. השתמש immunodeficient athymic בעירום (Foxn1^nu) זכר או נקבה עכברים, בין בן 4-5 שבועות 17-19 ג'י לזריקות תוך-גולגולתי. צריך להיות בו חיות לפחות 3 ימים לאחר הגעתו, לפני הניתוח.

1. הכנה תא
   1. הקציר מביצועם פלואורסצנט תאים חיוביים-glioma להשעיה תא בודד (שלבים 1.4-1.6), resuspend 0.5 או 1.0 x 10 תאים⁶ µL 2-5 ל- PBS לכל זריקה לכל חיה. Pipette התליה תא לתוך צינור 1.5-mL microcentrifuge מקום על קרח.
2. ניהול והכנה של הרדמה
   1. להכין µL 200 תמיסת מלח המכילה קטמין (100 מ ג/ק ג), חריגות השירותים הווטרינריים (10 מ"ג/ק"ג) לכל 20 גרם של משקל הגוף העכבר. שוקל החיות ולחשב את המינון המתאים של הרדמה.
   2. לספק זריקה בקרום הבטן של הרדמה, להחיל משחה אופטלמולוגיות לעיניים כדי למנוע התייבשות. לפרטים נוספים אודות שלב זה ראה קתלין. et al. ¹⁴ מקום בעל החיים על משטח המים מראש ומחוממת תרמי ב 37 º C.
   3. בדוק כי החיות הן ומורדמת באמצעות ניטור התגובה קמצוץ הבוהן (רפלקס פדלים), בדרך כלל בתוך 5-10 דקות.
3. הזרקה תוך-גולגולתי
   1. לטעון µL 5 של המזרק המילטון (בוטה קצה המחט) עם תא הבולם, טען בעל רגש.
   2. מקם את העכבר בתוך מסגרת סטיאוטטי בעלי חיים קטנים ולתקן את הראש באמצעות פסי האוזן ואת המתאם החותכת בעקבות הפרטים המתוארים Cetin. et al. ¹⁵
   3. לחטא את הראש עם 70% אתנול וביו -betadine פתרון. ודא שבאתר כירורגית היא להשלים סטרילי. לבצע חתך באמצע עם אזמל קטן ולהפריד את העור ואת רקמות החיבור.
   4. מקם את המזרק המילטון על הנקודה bregma באמצעות micromanipulator.
   5. להעביר את המכשיר מחזיק 1.0 מ מ anteroposterior ו- 2.0 מ מ לרוחב נקודת bregma. סמן עמדה זו עם עיפרון.
   6. במיקום זה, בזהירות תעשה חור בגולגולת עם מקדח ידניים micromotor על ידי הפעלת לחץ קלה כלפי מטה עד כלי הדם לנראה. לא לשבש parenchyma מאטר והמוח מעידה.
   7. להציג את המחט לתוך החור burr ולקדם 3.0 מ מ מתחת לפני השטח pial.
   8. כוונן את עוצמת הקול (µL 2-5) ואת קצב הזרימה (µL 1/דקה) של הזרקת באמצעות מזרק stereotaxic ממונע או לבצע ידנית את הזריקה.
   9. אחרי הזריקה, הסר את המחט בהדרגה לפי בסדר עולה 1.0 מ מ לכל 1 דקות ולנקות ההזרקה עם 70% אתנול.
   10. קרוב לעור פצע עם תפרי ניתוח או על-ידי הפיכת התפרים כירורגי (המכונה לעתים קרובות תפרים) ולראות את קייטלין. et al. ¹⁴ לפרטים נוספים.
4. שחזור בעלי חיים
   1. להעביר את החיה מים תרמיים פנקס (37 מעלות צלזיוס) ונטר את טמפרטורת הגוף, קצב הנשימה, קצב הלב, עד החלמה מלאה. לנהל נגד כאבים לפי פרוטוקולים סטנדרטיים.
      הערה: לקבלת מידע נוסף על הליך סטיאוטטי, ניתוח, קואורדינטות, ראה אחרים דוחות^5,14,15.

3. FMT הדמיה

הערה: על פי המטרה ניסיוני, גליובלסטומה מתויג iRFP תאים יכולים להיות פיקוח ויוו לפני, במהלך או לאחר טיפול. הדמיה מטרה, עזים ומתנגד בעלי החיים באמצעות חדר אינדוקציה איזופלוריין, לשמור במגרה הדמיה במהלך סריקה, ואת התמונה בתחנת עגינה של הצלם FMT.

1. הסר את החיה הכלוב ואת המקום בבית הבליעה אינדוקציה איזופלוריין. לסגור את התא, הפעל זרימת החמצן ואת מכשיר אידוי 3-5%.
2. לפקח על החיה עד אותו. הוא לגמרי מורדם, בדרך כלל בתוך 1-2 דקות הכרה חיות כדאי לא להגיב לגירויים חיצוניים.
3. להסיר את החיה anesthetized מן החדר ולשים החיה הקלטת הדמיה על-ידי הצבת את מתאם ראש תחילה, ולאחר מכן על-ידי הצבת החיה פונה כלפי מטה. ודא כי הראש ממוקם במרכז הקלטת.
4. למקם את הפלטה בקלטת על העליונה, והדק את ידיות התאמת עד 17 מ"מ.
5. פעם זה החיה שמורה בחדר בקלטת הדמיה, המשיכו הדמיה על-ידי הוספת את הקלטת בתחנת העגינה פנימי של הצלם FMT, איפה איזופלוריין נשאבים לשמור את החיה מורדם.
6. להפעיל את התוכנה imager, מנתח על-ידי לחיצה כפולה על סמל התוכנה.
7. בחלון "ניסיוני tab", בחר את "מסד נתונים" ואת "קבוצת לימוד".
8. ליד החלון "הכרטיסייה סריקה" ובחר את הנושא את התמונה על ידי לחיצה על "בחר נושא". כמו כן, בחרו בערוץ לייזר שבלוח "לייזר ערוץ". עבור התאים התווית על-ידי FP635, בחר "ערוץ 635 ננומטר לייזר", ולאחר עבור התווית על-ידי FP720 תאים, בחר ""ערוץ 680 nm בלייזר.
9. רוכשים תמונה על-ידי לחיצה על האפשרות "ללכוד" חלון "הכרטיסייה סריקה". לאחר מכן, להתאים את השדה סריקה על ידי לחיצה וגרירה בתחום הסריקה. בתמונה שנלכדה למספר נחושים ממיקומי המקור, בדרך כלל בתוך 20-25 מקורות עבור הצד חולשת.
10. בחר באפשרות "הוסף לתור שחזור" ולחיצה על הכפתור "סרוק" בחלון "הכרטיסייה סריקה".
11. המתן עד הסריקה הושלמה, ואז להסיר את הקלטת הדמיה מתחנת העגינה.
12. להסיר את הפלטה בקלטת ולמקם מאחור בעלי חיים לתוך הכלוב.
13. חזור על השלבים 3.1-3.12 עבור שאר החיות.

4. תמונות ניתוח

1. התוכנה imager, מנתח, בחר את חלון "ניתוח tab".
2. טען את ערכת הנתונים ואת הנושא לנתח באמצעות לחיצה על לחצן "+" שבלוח "בחירת הנתונים (dataset)" חלון "ניתוח tab".
3. לאחר התמונה נטענה בחלון "ניתוח tab", לבצע את האזור של הריבית (ROI) ניתוח על-ידי בחירה בסמל האליפסואיד, מלון הפינה השמאלית העליונה של חלון "ניתוח tab".
4. התאם את הסף לאפס שבלוח "נתונים סטטיסטיים" על-ידי לחיצה ימנית העמודה "סף" חלון "ניתוח tab".
5. סה כ ערך שבלוח "נתונים סטטיסטיים" מייצגת את האות מתאי גליובלסטומה מתויג פלורסנט מושתל במוח העכבר.
6. חזור על הצעדים 4.2-4.4 שאר החיות. לטעון או להסיר את נושא חדש על-ידי לחיצה "+" או "−" כפתור, בהתאמה, בחלונית "בחירת הנתונים (dataset)" חלון "ניתוח tab".
   הערה: לקבלת מידע נוסף אודות FMT הדמיה ותפעול התוכנה, ראה^20-

תוצאות

Glioblastoma תאים U87EGFRvIII (תאים U87 יתר ביטוי variant קולטן EGF III) היו תרבותי על פי השלב 1.2. Lentivirus והופק מטוהרת על פי שלב 1.1. ריכוז ויראלי נקבע על ידי p24 אליסה ניתוח. התאים היו transduced עם lentivirus נושאת אינפרא-אדום פלואורסצנטי חלבונים על פי שלב 1.8. פלסמיד קידוד FP720^10,11<...

Discussion

הגידול xenografts היו בשימוש נרחב בחקר הסרטן, מספר טכניקות הדמיה ומבוססת פותחה: רבנות בלי; תהודה מגנטית הדמיה (MRI); טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET), שחושב טומוגרפיה ממוחשבת (CT); FMT. כל הגישות הללו מגיע עם היתרונות והחסרונות, אך בסופו של דבר משלימים אחד את השני עם הסוג של המידע. אחד ה הנפוץ ויוו ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/High Glucose	HyClone/GE	SH30022.1
DMEM/F12 1:1	Gibco	11320-082
FBS	HyClone/GE	SH30071.03
Accutase	Innovative cell technologies	AT-104
Trypsin	HyClone/GE	SH30236.01
B27 supplement	Gibco	17504044
human recombinant EGF	Stemcell Technologies	2633
human recombinant FGF	Stemcell Technologies	2634
DPBS	Corning	21-031-00
FACS tubes	Falcon	352235
DAPI	ThermoFisher Scientific	62248
Blasticidin	ThermoFisher Scientific	A1113903
p24 ELISA	Clontech	632200
Xylazine	Akorn	NDC 59399-110-20
Ketamine	Zoetis	NADA 043-403	Controlled substance
Ointment	Dechron	NDC 17033-211-38
Absorbable suture	CpMedical	VQ392
5 ul syringe	Hamilton	26200-U	Catalog number as sold by Sigma-Aldrich
Cell Sorter	Sony	SH8007
Mouse stereotaxic frame	Stoelting	51730
Motorized stereotaxic injector	Stoelting	53311
Micromotor hand-held drill	Foredom	K1070
Mouse warming pad	Ken Scientific Corporation	TP-22G
Fluorescence Tomography System	PerkinElmer	FMT 2500 XL
TrueQuant Imaging Software	Perkin Elmer	7005319
Ultra-centrifuge Optima L-80 XP	Beckman Coulter	392049
Tissue Culture 100mm Dishes	Olympus Plastics	25-202
Tissue Culture 150mm Dishes	Olympus Plastics	25-203
Tissue Culture Flasks T75	Corning	430720U
50 mL conical tubes	Corning	430290
15 mL conical tubes	Olympus Plastics	28-101
Centrifuge Avanti J-20	Beckman Coulter	J320XP-IM-5
Tube, Polypropylene, Thinwall, 5.0 mL	Beckman Coulter	326819
Tube, Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm	Beckman Coulter	326823
Athymic nude mice	Charles River Laboratories	Strain Code  490 (Homozygous)	Prior approval by the Institutional Animal Care Program and by the Institutional Biosafety Committee required.