Fluorescência Molecular Tomography para a imagem latente na Vivo de Glioblastoma Xenografts

Resumo

Ortotópico intracraniana injeção de células de tumor tem sido usada na pesquisa do câncer para estudar a biologia do tumor de cérebro, progressão, evolução e resposta terapêutica. Aqui nós apresentamos fluorescência molecular tomografia computadorizada de xenografts tumor, que fornece em tempo real imagens intravital e quantificação de um tumor massa em modelos pré-clínicos glioblastoma.

Resumo

Tumorigenicidade é a capacidade das células cancerosas para formar um tumor massa. É uma abordagem amplamente utilizada para determinar se as células forem oncogenicidade camundongos imunodeficientes a injectar por via subcutânea com células cancerosas e medindo a massa tumoral, depois torna-se visível e palpável. Ortotópico injeções de células de câncer visam introduzir o enxerto heterólogo no microambiente que mais se assemelha ao tecido de origem do tumor a ser estudada. Pesquisa de cancer do cérebro requer intracraniana injeção de células cancerosas para permitir a formação de tumor e análise no microambiente exclusivo do cérebro. A imagem na vivo de xenografts intracranianas monitora instantaneamente a massa tumoral de ratos orthotopically incorporada. Aqui nós relatamos o uso da fluorescência molecular tomografia computadorizada (FMT) de xenografts do tumor de cérebro. As células cancerosas são primeiro transfectadas com perto de infravermelhas proteínas fluorescentes e então injetadas no cérebro de ratos imunodeprimidos. Os animais são então digitalizados para obter informações quantitativas sobre a massa tumoral durante um período prolongado de tempo. Célula pré-rotulagem permite custo efetiva, reprodutível e confiável quantificação dos encargos tumor dentro de cada rato. Nós eliminou a necessidade de injeção de substratos de imagem e assim reduzir o stress dos animais. Uma limitação dessa abordagem é representada pela incapacidade de detectar massas muito pequenas; Entretanto, tem a melhor resolução para massas maiores do que outras técnicas. Pode ser aplicado para avaliar a eficácia de um tratamento medicamentoso ou alterações genéticas de linhas de células de glioma e amostras de paciente-derivado.

Introdução

Câncer é uma das principais causas de mortes relacionadas com a doença em seres humanos no mundo industrializado. Com um extremamente elevado número de mortes, novos tratamentos são urgentemente necessários. Glioblastoma multiforme (GBM) é um tipo extremamente letal de câncer no cérebro, composto de populações heterogêneas de células cerebrais tumor estromal e imune. De acordo com o registro de tumor cerebral Central dos EUA, a incidência de tumores cerebrais primários não-malignas e malignas é aproximadamente 22 casos por 100.000. Aproximadamente 11.000 novos casos são esperados para serem diagnosticados nos EUA em 2017¹.

Estudos pré-clínicos investigam a probabilidade de um medicamento, procedimento ou tratamento eficaz antes de serem testadas em seres humanos. Um dos primeiros passos laboratoriais em estudos pré-clínicos é identificar potenciais alvos moleculares para tratamento medicamentoso usando células cancerosas implantadas no organismo hospedeiro, definido como modelos de xenoenxertos humana. Dentro deste contexto, os modelos de enxerto de tumor cerebral intracraniana usando xenografts paciente-derivado (PDXs) têm sido amplamente utilizados para estudar a biologia do tumor de cérebro, progressão, evolução e resposta terapêutica e mais recentemente para o desenvolvimento de biomarcadores, drogas triagem e personalizada medicina^2,3,4.

Um dos mais acessíveis e não-invasivo na vivo por imagens métodos para monitorar xenografts intracranianas é bioluminescência de imagem (BLI)^5,6,7,8. No entanto, algumas limitações BLI incluem administração de substrato e disponibilidade, estabilidade da enzima e luz têmpera e Dispersando durante aquisição⁹de imagem. Aqui nós relatamos o FMT infravermelho como uma alternativa de imagem método para monitorar modelos pré-clínicos glioblastoma. Neste método, a aquisição do sinal e quantificação de PDXs intracraniano implantados, expressando uma proteína fluorescente de infravermelho próximo iRFP720^10,11 (doravante denominado como FP720) ou turboFP635 (doravante denominado como FP635), é executada com um sistema de imagem de FMT. Usando a tecnologia FMT, o ortotópico tumores podem ser monitorado na vivo antes, durante ou após o tratamento, de forma não-invasiva, livre de substrato e quantitativa para observações pré-clínicas.

Protocolo

O uso de animais de pesquisa experimental e agentes infecciosos, tais como lentivirus para transduce as células cancerosas, exigem aprovação prévia pelo programa institucional cuidados com animais e pelo Comitê institucional de biossegurança. Este protocolo segue as diretrizes de cuidado animal da Universidade da Califórnia em San Diego (UCSD).

1. rotulagem de células de Glioblastoma com FP635 ou FP720 construção

1. Produzir e purificar lentivirus de acordo com o protocolo descrito por Tiscornia et al ¹²
2. Células de cultura de aproximadamente 2,0 x 10⁶ de uma linhagem de células de glioma humano com DMEM mais 10% soro bovino fetal (FBS) em um prato de 15 cm; ou cultura 2.0 x 10⁶ glioblastoma humano paciente-derivado (GBM-PDX) esferas com DMEM/F12 médio de 1:1 com B27 suplemento mais humano recombinante fator de crescimento epidérmico (EGF; 20 ng/mL) e FGF (10 ng/mL) num balão T75.
3. Manter todas as células em 37 ° C, umidade relativa de 100% e 5% de CO₂.
4. Dissocia as células.
   1. Para as células de glioma: Retire o sobrenadante as chapas e adicionando 3-5 mL de tripsina 1 X para as células de glioma.
   2. Para o GBM esferas: coletar as células pipetando as células para um tubo de 15 mL.
      1. Gire para baixo as esferas GBM a 200 x g por 5 min utilizando uma centrífuga de mesa à temperatura ambiente.
      2. Remover o sobrenadante e adicionar 3 a 5 mL de solução de desprendimento de células.
   3. Incube a todas as células a 37 ° C por 10-15 min.
5. Cuidadosamente, dissociar as células pipetando subindo e descendo várias vezes (certifique-se de que as esferas e células de glioma são concluídas dissociada) e spin-down a 200 x g por 5 min.
6. Remover o sobrenadante e ressuspender as células com 5 mL de meio pipetando subindo e descendo várias vezes. Determine a viabilidade celular por exclusão trypan azul.
7. Placa de 1,0 x 10⁶ das células-alvo em um prato de 10 cm com 5 mL de meio, de pipetagem.
8. Transduce células com lentivirus expressando proteínas fluorescentes na multiplicidade de infecção (MOI) 5 como é descrito por Tiscornia et al ¹² e incubar a 37 ° C.
9. Após 24h, remover o meio das células transduzidas, adicionar 5 mL de meio fresco e incube por 48h adicional a 37 ° C.
10. Dissocia as células infectadas em uma suspensão de célula única, conforme descrito nas etapas 1.4-1.6. Gire para baixo as células a 200 x g por 5 min e Resuspenda em 500 µ l de solução de classificação (tampão fosfato salino (PBS) com 1% FBS).
11. Pipete a suspensão de eritrócitos para tubos de FACS. Co manche as células com 1 µ l/mL de 4', dicloridrato de 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) para excluir as células mortas. Controles negativos são necessárias para configurar as portas do citômetro de fluxo (não-transfectadas células e células não transfectadas / DAPI manchado).
12. Classificar as células fluorescentes/DAPI-positivo-negativo em classificação de solução, conforme descrito por Brum et al . ¹³e coletar as células classificadas em um tubo cônico de 15 mL.
13. Gire para baixo as células classificadas a 200 x g por 5 min, retire o sobrenadante e ressuspender em 5 mL de meio de cultura. As células classificadas em um prato de 10 cm por pipetagem de semente. Incube a 37 ° C, durante pelo menos 48-72 h.
14. Expandir as células classificadas por dissociando as células seguintes etapas 1.4-1.6 e chapeamento em vários pratos para experiências na vivo .
    Nota: Para mais detalhes sobre a célula de triagem, preparação e purificação, consulte Brum et al . ¹³

2. intracraniana injeção de células de Glioblastoma iRFP-tag em camundongos imunodeficientes

Nota: Antes de iniciar a cirurgia certifique-se que a sala cirúrgica e ferramentas estejam limpas para o procedimento. Use o modelo imunodeficientes (Foxn1^nu) masculinos ou femininos camundongos, entre 4-5 semanas de idade e 17-19 g para injeções intracranianas. Animais devem ser alojados pelo menos 3 dias após a chegada e antes da cirurgia.

1. Preparação da pilha
   1. Colheita e dissociar fluorescentes positivo-glioma células em uma célula única suspensão (etapas 1.4-1.6) e ressuspender 0,5 ou 1,0 x 10⁶ células em 2 a 5 µ l de PBS por injecção por animal. Pipete a suspensão de células para um tubo de 1,5 mL microcentrifuga e lugar no gelo.
2. Administração e preparação de anestesia
   1. Prepare-se 200 µ l de solução salina contendo cetamina (100 mg/kg) e xilazina (10mg/kg) por 20 gramas de peso do corpo do mouse. Pesar os animais e calcular a dose adequada de anestesia.
   2. Fornecer uma injeção intraperitoneal de anestesia e aplique pomada oftálmica nos olhos para evitar a desidratação. Para mais detalhes sobre esta etapa ver Kathleen et al ¹⁴ Coloque o animal em uma almofada térmica de água previamente aquecida a 37 ° C.
   3. Verifica que os animais são anestesiados, monitorando a resposta de pitada de dedo do pé (pedal reflex), geralmente dentro de 5-10 min.
3. Injeção intracraniana
   1. Carregar um 5 µ l seringa Hamilton (agulha de ponta romba) com suspensão de células e montar no porta-sonda.
   2. Coloque o mouse em uma armação estereotáxica animal pequena e consertar a cabeça usando as barras de orelha e o adaptador de incisivo seguindo os detalhes descritos por Carvalho et al . ¹⁵
   3. Desinfete com solução de 70% de etanol e betadine na cabeça. Certifique-se que o sítio cirúrgico está completo estéril. Executar uma média incisão com um bisturi pequeno e separar a pele e os tecidos conjuntivos.
   4. Coloque a seringa Hamilton sobre o ponto de bregma usando o micromanipulador.
   5. Mova a sonda titular ântero-posterior 1,0 mm e 2,0 mm lateral do ponto de bregma. Marque esta posição com um lápis.
   6. Neste local, cuidadosamente faça um buraco no crânio com uma broca Hand-Held do micromotor, aplicando leve pressão para baixo até que os vasos sanguíneos tornam-se visíveis. Não perturbem o parênquima aracnoide máter e o cérebro.
   7. Introduzir a agulha no orifício de trépano e avançar 3,0 mm abaixo da superfície pial.
   8. Configurar o volume (2-5 µ l) e a taxa de fluxo (1 µ l/min) de injeção usando um injector estereotáxica motorizado ou executar manualmente a injeção.
   9. Após a injeção, remova a agulha gradualmente por ascendente 1,0 mm cada 1 min e limpar o local da injeção com etanol a 70%.
   10. Perto da pele ferida com grampos cirúrgicos ou fazendo suturas cirúrgicas (muitas vezes referidas como pontos) e ver Kathleen et al ¹⁴ para mais detalhes.
4. Recuperação de animais
   1. Transferir o animal para uma almofada térmica de água (37 ° C) e monitorar a temperatura corporal, taxa de respiração e batimentos cardíacos, até a recuperação completa. Administre analgesia por protocolos padrão.
      Nota: Para obter mais informações sobre o procedimento estereotáxica, cirurgia e coordenadas, consulte outros relatórios^5,14,15.

3. FMT Imaging

Nota: De acordo com o objetivo experimental, o glioblastoma iRFP-tag células podem ser monitorado na vivo antes, durante ou após o tratamento. Para efeito de imagem, anestesiar animais utilizando uma câmara de indução de isoflurano, manter-se em uma gaveta de imagens durante a digitalização e imagem na estação de ancoragem do tonalizador a FMT.

1. Retire o animal da gaiola e coloque na câmara de indução de isoflurano. Fechar a câmara e ligar o fluxo de oxigênio e vaporizador para 3-5%.
2. Monitorar o animal até que ele é completamente anestesiado, geralmente dentro de 1-2 min inconsciente animais não devem responder a estímulos externos.
3. Remover o animal anestesiado da câmara e colocar o animal na gaveta de imagem, colocando o adaptador cabeça primeiro, seguido por sujeitar o animal voltada para baixo. Certifique-se de que a cabeça está localizada no centro da fita.
4. Coloque a placa superior da fita em cima e aperte os botões de ajuste até 17 mm.
5. Uma vez que o animal está seguro na gaveta da imagem latente, proceder-se à imagem inserindo a gaveta interna docking station de Imageador a FMT, onde o isoflurano é bombeado para manter o animal anestesiado.
6. Execute o software imager e analisador clicando duas vezes o ícone do software.
7. Na janela "Guia Experimental", selecione o "Database" e "Grupo de estudo".
8. Vá para a janela de "Guia de Scan" e selecione o assunto a imagem clicando em "selecionar o assunto". Também, selecione o canal do laser no painel "Canal de Laser". Para as células FP635-etiquetadas, selecione "laser canal 635 nm" e para as células FP720-etiquetadas, selecione "canal 680 nm a laser".
9. Adquira uma imagem clicando na opção "Captura" na janela "Guia Scan". Em seguida, ajuste o campo de verificação clicando e arrastando o campo de verificação da imagem capturada para um determinado número de locais de origem, geralmente dentro de 20-25 fontes para o lado ipsilateral.
10. Marque a opção "Adicionar a fila de reconstrução" e bateu o "Scan" na janela "Guia Scan".
11. Esperar até que a varredura for concluída e em seguida, remova o cartucho da imagem latente da docking station.
12. Remover a placa superior da fita e coloque a animal de volta para a jaula.
13. Repita as etapas 3.1-3.12 para o resto dos animais.

4. análise de imagens

1. O software analisador e gerador de imagens, selecione a janela "Guia de análise".
2. Carrega o dataset e o assunto para analisar clicando no botão "+" no painel "Seleção do conjunto de dados" da janela "Guia de análise".
3. Uma vez que a imagem tenha sido carregada na janela "Guia de análises", realizar a região de análise de interesse (ROI), selecionando o ícone elipsoide, localizado no canto superior esquerdo da janela do "Guia de análise".
4. Ajuste o limite como zero no painel "dados estatísticos" pelo botão direito coluna "limite" na janela "Guia de análise".
5. O valor total no painel "Dados estatísticos" representa o sinal das células fluorescentes-tag glioblastoma implantadas no cérebro do rato.
6. Repita as etapas 4.2-4.4 para o resto dos animais. Carregar ou remover um assunto novo, clicando no "+" ou "−" botão, respectivamente, no painel "Seleção do conjunto de dados" da janela "Guia de análise".
   Nota: Para obter mais informações sobre a imagem de FMT e operação de software, consulte^20.

Resultados

U87EGFRvIII de células de glioblastoma (u-87 células expressando over a variante do receptor de EGF III) foram cultivadas de acordo com a etapa 1.2. Lentivirus foi produzido e purificado conforme item 1.1. A concentração viral foi determinada pelo p24 análise de ELISA. As células foram transfectadas com lentivirus carregando infravermelhas proteínas fluorescentes conforme item 1.8. O plasmídeo codificação FP720^10,11 foi ...

Discussão

Xenografts tumor têm sido extensivamente usados em pesquisa de câncer e desenvolveu um número de técnicas de imagem bem estabelecidas: BLI; ressonância magnética (MRI); tomografia por emissão de positrões (PET), computado (CT); FMT. Cada uma dessas abordagens vem com prós e contras, mas no final se complementam com o tipo de informação fornecida. Um do mais comumente usado em vivo tecnologia de imagem é BLI^5,6,7

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/High Glucose	HyClone/GE	SH30022.1
DMEM/F12 1:1	Gibco	11320-082
FBS	HyClone/GE	SH30071.03
Accutase	Innovative cell technologies	AT-104
Trypsin	HyClone/GE	SH30236.01
B27 supplement	Gibco	17504044
human recombinant EGF	Stemcell Technologies	2633
human recombinant FGF	Stemcell Technologies	2634
DPBS	Corning	21-031-00
FACS tubes	Falcon	352235
DAPI	ThermoFisher Scientific	62248
Blasticidin	ThermoFisher Scientific	A1113903
p24 ELISA	Clontech	632200
Xylazine	Akorn	NDC 59399-110-20
Ketamine	Zoetis	NADA 043-403	Controlled substance
Ointment	Dechron	NDC 17033-211-38
Absorbable suture	CpMedical	VQ392
5 ul syringe	Hamilton	26200-U	Catalog number as sold by Sigma-Aldrich
Cell Sorter	Sony	SH8007
Mouse stereotaxic frame	Stoelting	51730
Motorized stereotaxic injector	Stoelting	53311
Micromotor hand-held drill	Foredom	K1070
Mouse warming pad	Ken Scientific Corporation	TP-22G
Fluorescence Tomography System	PerkinElmer	FMT 2500 XL
TrueQuant Imaging Software	Perkin Elmer	7005319
Ultra-centrifuge Optima L-80 XP	Beckman Coulter	392049
Tissue Culture 100mm Dishes	Olympus Plastics	25-202
Tissue Culture 150mm Dishes	Olympus Plastics	25-203
Tissue Culture Flasks T75	Corning	430720U
50 mL conical tubes	Corning	430290
15 mL conical tubes	Olympus Plastics	28-101
Centrifuge Avanti J-20	Beckman Coulter	J320XP-IM-5
Tube, Polypropylene, Thinwall, 5.0 mL	Beckman Coulter	326819
Tube, Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm	Beckman Coulter	326823
Athymic nude mice	Charles River Laboratories	Strain Code  490 (Homozygous)	Prior approval by the Institutional Animal Care Program and by the Institutional Biosafety Committee required.