Fluoreszenz Molekulare Computertomographie für die In-Vivo Bildgebung des Glioblastoms Xenotransplantate

Zusammenfassung

Orthotopen intrakraniellen Injektion von Tumorzellen wurde in der Krebsforschung zur Gehirn Tumorbiologie, Fortschreiten, Evolution und therapeutische Reaktion zu studieren. Hier präsentieren wir Ihnen Fluoreszenz Molekulare Tomographie der Tumor Xenografts vorsieht, dass Echtzeit-intravitalen Bildgebung und Quantifizierung eines Tumors in präklinischen Glioblastom Modelle Masse.

Zusammenfassung

Tumorigenität ist die Fähigkeit von Krebszellen, einen Tumor bilden Masse. Ein weit verbreiteter Ansatz um festzustellen, ob die Zellen tumorigenic sind wird durch Injektion immungeschwächte Mäuse subkutan mit Krebszellen und die Tumor-Masse zu messen, nachdem es sichtbar und fühlbar wird. Orthotopen Injektionen von Krebszellen sollen die Xenograft in der Mikroumgebung einzuführen, die am ehesten des Gewebes von Ursprung des Tumors untersucht. Gehirn-Krebs-Forschung erfordert intrakraniellen Krebszellen die Tumorbildung und Analyse in der einzigartigen Mikroumgebung des Gehirns zu ermöglichen. Die in-Vivo -Darstellung der intrakraniellen Xenotransplantate überwacht augenblicklich die Tumor-Masse des Orthotopically pfropfte Mäuse. Hier berichten wir über die Verwendung von Fluoreszenz Molekulare Computertomographie (FMT) von Gehirn Tumor Xenografts. Die Krebszellen sind zunächst mit ausgestrahlt, in der Nähe von Infrarot-fluoreszierende Proteine und dann in das Gehirn des immungeschwächte Mäuse injiziert. Die Tiere werden dann gescannt, um quantitative Informationen über die Tumor-Masse über einen längeren Zeitraum hinweg zu erhalten. Zelle vor Kennzeichnung ermöglicht eine kostengünstige, reproduzierbare und zuverlässige Quantifizierung der tumorlast innerhalb jeder Maus. Wir eliminiert die Notwendigkeit für die Injektion bildgebenden Substrate und reduziert den Stress auf die Tiere. Eine Einschränkung dieses Ansatzes wird durch die Unfähigkeit, sehr kleine Massen erkennen dargestellt; Allerdings hat es besseren Auflösung für größere Massen als andere Techniken. Es kann angewendet werden, um die Wirksamkeit einer medikamentösen Behandlung oder genetische Veränderungen von Gliom-Zell-Linien und Patienten stammenden Proben zu bewerten.

Einleitung

Krebs ist eine der führenden Ursachen für krankheitsbedingte Todesfälle beim Menschen in der industrialisierten Welt. Mit einer extrem hohen Todesopfer sind neue Behandlungen dringend erforderlich. Glioblastoma Multiforme (GBM) ist eine extrem tödliche Art von Hirntumoren, bestehend aus heterogenen Bevölkerung von Gehirn, Stromale und immun Tumorzellen. Laut der zentralen Gehirn Tumor Registrierung der USA ist die Inzidenz des primären malignen und nicht-malignen Hirntumoren etwa 22 Fälle pro 100.000. Rund 11.000 Neuerkrankungen werden voraussichtlich in den USA im Jahr 2017¹diagnostiziert werden.

Präklinische Studien untersuchen die Wahrscheinlichkeit, dass ein Medikament, Verfahren oder Behandlung vor der Prüfung beim Menschen wirksam sein. Einer der frühesten Labor Schritte in präklinischen Studien ist mögliche Molekulare Targets für medikamentöse Behandlung identifizieren, mithilfe von Krebszellen, die in einen Wirtsorganismus, definiert als menschliche Xenograft Modelle implantiert. In diesem Zusammenhang haben intrakraniellen Gehirn Tumor Xenograft Modelle mit Patienten abgeleitet Xenotransplantate (PDXs) weit verbreitet zu studieren Gehirn Tumorbiologie, Fortschreiten, Evolution und therapeutische Reaktion, und vor kurzem für die Entwicklung von Biomarkern, Drogen Screening und personalisierte Medizin^2,3,4.

Die meisten erschwinglich und nicht-invasive in Vivo bildgebende Verfahren zur Überwachung der intrakraniellen Xenotransplantate gehört Biolumineszenz imaging (BLI)^5,6,7,8. Jedoch enthalten einige BLI Einschränkungen Substrat Verwaltung und Verfügbarkeit, Enzymstabilität, abschrecken und Streuung während imaging Erwerb⁹. Hier berichten wir über die Infrarot-FMT als Alternative bildgebendes Verfahren zur Überwachung der präklinischen Glioblastom Modelle. In dieser Methode, Signalerfassung und Quantifizierung der intracranially implantierten PDXs, mit dem Ausdruck ein Nahinfrarot-fluoreszierende Protein iRFP720^10,11 (fortan als FP720 bezeichnet) oder turboFP635 (fortan als FP635 bezeichnet), wird mit einer FMT imaging-System durchgeführt. Mit der FMT-Technologie überwacht der orthotopen können Tumoren sein in Vivo vor, während oder nach der Behandlung in einer nicht-invasiven, frei von Substrat und quantitative Weise für präklinische Beobachtungen.

Protokoll

Experimentelle forschungstiere und Krankheitserreger, wie z. B. Lentivirus, die Krebszellen transduzieren benötigen Zustimmung vom institutionellen Tierbetreuung Programm und der institutionellen Biosafety-Ausschuss. Dieses Protokoll erfolgt nach den Richtlinien der Pflege der Tiere von der University of California San Diego (UCSD).

1. Kennzeichnung von Glioblastom-Zellen mit FP635 oder FP720 Konstrukt

1. Zu produzieren Sie und zu reinigen Sie Lentivirus gemäß dem Protokoll von Tiscornia Et Al. beschrieben ¹²
2. Kultur ca. 2,0 x 10⁶ Zellen aus einer menschlichen Gliom-Zelllinie mit DMEM plus 10 % fetalen bovine Serum (FBS) in einem 15-cm-Schüssel; oder Kultur 2.0 x 10⁶ menschlichen Glioblastom Patienten abgeleitet (GBM-PDX) Kugeln mit DMEM/F12 1:1 Medium mit B27 ergänzen plus human rekombinanten epidermalen Wachstumsfaktor (EGF; 20 ng/mL) und FGF (10 ng/mL) in ein Auffanggefäß T75.
3. Alle Zellen bei 37 ° C, 5 % CO₂und 100 % relativer Luftfeuchte zu erhalten.
4. Die Zellen zu trennen.
   1. Für die Gliom-Zellen: den überstand von den Platten zu entfernen und das Gliom-Zellen 3-5 mL Trypsin 1 X hinzufügen.
   2. Für die GBM Sphären: die Zellen zu sammeln, indem Sie die Zellen in ein 15-mL-Röhrchen pipettieren.
      1. Spin-down der GBM-Kugeln 200 X g für 5 min mit einer Tischplatte Zentrifuge bei Raumtemperatur.
      2. Entfernen des Überstands und 3-5 mL Zelle Ablösung Lösung.
   3. Inkubieren Sie alle Zellen bei 37 ° C für 10-15 min.
5. Sorgfältig trennen die Zellen durch pipettieren nach oben und unten mehrmals (sicherzustellen, dass die Kugeln und Gliom Zellen abgeschlossen sind getrennt) und Spin-down bei 200 X g für 5 min.
6. Entfernen des Überstands und Aufschwemmen der Zellen mit 5 mL Medium durch nach oben und unten mehrmals pipettieren. Bestimmen Sie die Zellviabilität Trypan blau ausgeschlossen.
7. Platte 1,0 x 10⁶ der Zielzellen in einem 10-cm-Schüssel mit 5 mL Medium durch pipettieren.
8. Transduzieren Sie Zellen mit Lentivirus auszudrücken fluoreszierende Proteine bei der Multiplizität der Infektion (MOI) 5 wie von Tiscornia Et Al. beschrieben wird ¹² und bei 37 ° c inkubieren
9. Entfernen Sie nach 24 h das Medium aus den transduced Zellen, 5 mL frisches Medium hinzufügen und weitere 48 h bei 37 ° c inkubieren
10. Distanzieren Sie die infizierten Zellen in eine einzelne Zelle Suspension wie beschrieben in Schritten 1,4-1,6. Spin-down der Zellen bei 200 X g für 5 min und Aufschwemmen in 500 µL Lösung zu sortieren (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 1 % FBS).
11. Pipette die Zellsuspension in FACS Röhren. Co färben Sie die Zellen mit 1 µL/mL 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) Dihydrochloride, abgestorbenen Zellen auszuschließen. Negative Kontrollen sind erforderlich, um den Flow Cytometer Toren einzurichten (nicht ausgestrahlt und nicht ausgestrahlt Zellen / DAPI gefärbt).
12. Sortieren Sie die Leuchtstoff-positiven/DAPI-negativen Zellen in Sortierung Lösung, wie von Basu Et Al. beschrieben ¹³, und sammeln Sie die sortierten Zellen in ein 15 mL konische Röhrchen.
13. Spin-down der sortierten Zellen bei 200 X g für 5 min, den überstand zu entfernen und in 5 mL Kulturmedium aufzuwirbeln. Samen der sortierten Zellen in einer 10 cm Petrischale durch pipettieren. Inkubation bei 37 ° C für mindestens 48-72 h.
14. Erweitern der sortierten Zellen durch Wehre die Zellen folgende Schritte 1,4-1,6 und Beschichtung in mehrere Gerichte für in Vivo Experimente.
    Hinweis: Näheres zur Zelle Sortierung, Aufbereitung und Reinigung siehe Basu Et al. ¹³

(2) intrakranielle Injektion von iRFP getaggt Glioblastom-Zellen in immungeschwächte Mäuse

Hinweis: Vor Beginn der Operation, stellen Sie sicher, dass die OP und Werkzeuge für die Prozedur sauber sind. Verwenden Sie immungeschwächte Athymic nackt (Foxn1^Nu) männliche oder weibliche Mäuse, zwischen 4-5 Wochen alt und 17-19 g intrakraniellen Injektionen. Tiere sollten für mindestens 3 Tage nach Ankunft und vor der Operation untergebracht werden.

1. Handy-Vorbereitung
   1. Ernte und fluoreszierende positiv-Gliom Zellen in eine einzelne Zelle Suspension (Schritte 1,4-1,6) zu distanzieren und Aufschwemmen 0,5 oder 1,0 x 10⁶ Zellen in 2 bis 5 µL PBS pro Injektion pro Tier. Pipette die Zellsuspension in einen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und auf Eis.
2. Anästhesie-Vorbereitung und Verwaltung
   1. Bereiten Sie 200 µL Kochsalzlösung mit Ketamin (100 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) pro 20 Gramm Körpergewicht Maus vor. Wiegen Sie der Tiere und berechnen Sie die entsprechende Dosis der Narkose zu.
   2. Bieten Sie eine intraperitoneale Injektion von Anästhesie und gelten Sie ophthalmologischen Salbe für die Augen, um Austrocknung zu verhindern. Weitere Details zu diesem Schritt finden Sie unter Kathleen Et al. Legen Sie ¹⁴ das Tier auf einer vorgewärmten Wasser Wärmeleitpad bei 37 ° C.
   3. Überprüfen Sie, dass die Tiere betäubt sind durch die Überwachung der Zehe Prise Antwort (Pedal Reflex), in der Regel innerhalb von 5-10 Minuten.
3. Intrakranielle Injektion
   1. Laden 5 µL Hamilton-Spritze (stumpfe Spitze Nadel) mit Zellsuspension und Berg in Sondenhalter.
   2. Platzieren Sie den Mauszeiger in einem kleinen Tier Stereotaktische Rahmen und fixieren Sie den Kopf mit der Ohr-Bars und den Schneidezahn-Adapter nach den beschriebenen Details von Cetin Et al. ¹⁵
   3. Desinfizieren Sie den Kopf mit 70 % Ethanol und Betadine Lösung. Stellen Sie sicher, dass der Operationsstelle ist komplett steril. Führen Sie einen mittleren Schnitt mit einem kleinen Skalpell und trennen Sie die Haut und Bindegewebe.
   4. Ort der Hamilton-Spritze am Bregma Punkt mit dem Mikromanipulator.
   5. Bewegen Sie die Sonde Halter 1,0 mm Anteroposterior und 2.0 mm seitliche vom Bregma Punkt. Markieren Sie diese Position mit einem Bleistift.
   6. Machen Sie an dieser Stelle aufmerksam ein Loch in den Schädel mit einem Mikromotor handgeführte Bohrer durch leichten Druck nach unten bis die Blutgefäße sichtbar werden. Stören Sie nicht die Arachnoidea Mater und Gehirn Parenchym.
   7. Führen Sie die Nadel in die Bohrlochs und 3,0 mm unterhalb der pial Oberfläche voraus.
   8. Richten Sie das Volumen (2 bis 5 µL) und die Durchflussmenge (1 µL/min) der Injektion mittels eines motorisierten stereotaktischen Injektors oder manuell durchführen der Injektion.
   9. Entfernen Sie nach der Injektion die Nadel langsam durch aufsteigende 1,0 mm alle 1 min und reinigen Sie die Injektionsstelle mit 70 % Ethanol.
   10. In der Nähe die Haut Wunde mit chirurgischen Klammern oder durch chirurgisches Nahtmaterial (oft als Stiche) und siehe Kathleen Et al. ¹⁴ für weitere Informationen.
4. Tierische Erholung
   1. Übertragen Sie das Tier auf ein Wärmeleitpad Wasser (37 ° C) und überwachen Sie die Körpertemperatur, Atemfrequenz und Herzfrequenz, bis zur endgültigen Genesung. Verwalten Sie Analgesie pro standard-Protokolle.
      Hinweis: Weitere Informationen über die Stereotaktische Verfahren, Chirurgie und Koordinaten, siehe andere Berichte^5,14,15.

(3) FMT Imaging

Hinweis: Nach der experimentellen Ziel überwacht die iRFP getaggt Glioblastom, die Zellen werden können in Vivo vor, während oder nach der Behandlung. Für imaging-Zweck, Tiere mit einer Isofluran Induktion Kammer zu betäuben, halten in einer bildgebenden Kassette beim Scannen und Bild in die Docking-Station von der FMT-Imager.

1. Entfernen Sie das Tier aus dem Käfig und stellen in der Isofluran-Induktion-Kammer. Schließen Sie die Kammer und schalten Sie Sauerstoffzufuhr und Verdampfer auf ca. 3-5 %.
2. Überwachen Sie das Tier bis es vollständig betäubt ist, in der Regel innerhalb von 1-2 min. unbewussten Tiere sollte nicht reagieren auf äußere Reize.
3. Entfernen Sie das narkotisierten Tier aus der Kammer und setzen Sie das Tier in der bildgebenden Kassette indem man den Kopf Adapter zuerst, indem man das Tier nach unten gefolgt. Stellen Sie sicher, dass der Kopf in die Mitte der Kassette befindet.
4. Legen Sie die obere Platte der Kassette auf und ziehen Sie die Einstellknöpfen bis 17 mm.
5. Einmal, dass das Tier ist sicher in der bildgebenden Kassette, fahren Sie mit Bildgebung durch Einsetzen der Kassette in die interne docking-Station von der FMT-Imager, wo die Isofluran gepumpt wird, um das Tier betäubt zu halten.
6. Führen Sie die Imager und Analyzer Software durch Doppelklick auf das Symbol Software.
7. Wählen Sie im Fenster "experimentelle Registerkarte""die"Datenbank"und"Study Group".
8. Gehen Sie zum Fenster "Registerkarte" Scannen "" und wählen Sie den Betreff Bild durch Klicken auf "Thema auswählen". Außerdem wählen Sie den Laser-Kanal im Bereich "Laser-Kanal". Für die FP635-markierte Zellen wählen Sie "Laser Kanal 635 nm" und für FP720-markierte Zellen, "laser-Kanal 680 nm".
9. Erwerben Sie ein Bild, indem Sie auf die Option "Capture" im Fenster "Registerkarte" Scannen "". Passen Sie dann den Scan-Bereich durch Klicken und ziehen das Scan-Feld in das aufgenommene Bild auf eine bestimmte Anzahl von Quellspeicherorten, in der Regel innerhalb von 20-25 Quellen für die ipsilateralen Seite.
10. Aktivieren Sie die Option "Zur Rekonstruktion Warteschlange hinzufügen" und getroffen Sie "Scan" im Fenster "Registerkarte" Scannen "".
11. Warten Sie, bis der Scan abgeschlossen ist und entfernen Sie dann die bildgebende Kassette aus der Docking-Station.
12. Entfernen Sie die obere Platte der Kassette und legen Sie das Tier zurück in den Käfig.
13. Wiederholen Sie die Schritte 3.1-3.12 für den Rest der Tiere.

(4) Bildanalyse

1. Wählen Sie aus dem Imager und Analyzer Software das "Registerkarte Analyse"-Fenster.
2. Laden Sie das Dataset und das Thema, indem Sie auf die Taste "+" im Bereich "Dataset Auswahl" des Fensters "Registerkarte Analyse" zu analysieren.
3. Sobald das Bild im Fenster "Registerkarte Analyse" geladen wurde, Ausführen der Region of Interest (ROI) Analyse durch das Ellipsoid-Symbol in der oberen linken Ecke des Fensters "Registerkarte Analyse" auswählen.
4. Passen Sie den Schwellenwert auf NULL mit der rechten Maustaste die "Schwelle" Spalte im Fenster "Registerkarte" Analysis "" im Bereich "Statistik".
5. Der Gesamtwert im Bereich "Statistik" stellt das Signal aus den Leuchtstoff-Tags Glioblastom-Zellen in das Gehirn der Maus implantiert.
6. Wiederholen Sie die Schritte 4.2-4.4 für den Rest der Tiere. Laden oder ein neues Thema zu entfernen, indem Sie auf das "+" oder "−"-Taste, bzw. in "Dataset" Auswahljury des Fensters "Registerkarte Analyse".
   Hinweis: Weitere Informationen über die FMT Bildgebung und Betrieb der Software finden Sie unter^20.

Ergebnisse

Glioblastom-Zellen U87EGFRvIII (U87 Zellen zum Ausdruck über der EGF-Rezeptor-Variante III) wurden nach dem Schritt 1.2 kultiviert. Lentivirus wurde produziert und gemäß Schritt 1.1 gereinigt. Die virale Konzentration von p24 bestimmt war ELISA Analyse. Zellen wurden mit Lentivirus mit Infrarot-fluoreszierende Proteine nach Schritt 1,8 ausgestrahlt. Das Plasmid FP720^10,11 -Codierung wurde freundlicherweise zur Verfügung gestel...

Diskussion

Tumor Xenografts haben ausgiebig in der Krebsforschung verwendet worden und eine Reihe von etablierten bildgebenden Verfahren entwickelt: BLI; Magnetresonanztomographie (MRT); Positronen-Emissions-Tomographie (PET), berechnet Computertomographie (CT); FMT. Jeder dieser Ansätze kommt mit vor- und Nachteile, aber letztlich ergänzen sich mit der Art der bereitgestellten Informationen. Eines der am häufigsten verwendeten in-Vivo imaging-Technologie ist BLI^5,6

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/High Glucose	HyClone/GE	SH30022.1
DMEM/F12 1:1	Gibco	11320-082
FBS	HyClone/GE	SH30071.03
Accutase	Innovative cell technologies	AT-104
Trypsin	HyClone/GE	SH30236.01
B27 supplement	Gibco	17504044
human recombinant EGF	Stemcell Technologies	2633
human recombinant FGF	Stemcell Technologies	2634
DPBS	Corning	21-031-00
FACS tubes	Falcon	352235
DAPI	ThermoFisher Scientific	62248
Blasticidin	ThermoFisher Scientific	A1113903
p24 ELISA	Clontech	632200
Xylazine	Akorn	NDC 59399-110-20
Ketamine	Zoetis	NADA 043-403	Controlled substance
Ointment	Dechron	NDC 17033-211-38
Absorbable suture	CpMedical	VQ392
5 ul syringe	Hamilton	26200-U	Catalog number as sold by Sigma-Aldrich
Cell Sorter	Sony	SH8007
Mouse stereotaxic frame	Stoelting	51730
Motorized stereotaxic injector	Stoelting	53311
Micromotor hand-held drill	Foredom	K1070
Mouse warming pad	Ken Scientific Corporation	TP-22G
Fluorescence Tomography System	PerkinElmer	FMT 2500 XL
TrueQuant Imaging Software	Perkin Elmer	7005319
Ultra-centrifuge Optima L-80 XP	Beckman Coulter	392049
Tissue Culture 100mm Dishes	Olympus Plastics	25-202
Tissue Culture 150mm Dishes	Olympus Plastics	25-203
Tissue Culture Flasks T75	Corning	430720U
50 mL conical tubes	Corning	430290
15 mL conical tubes	Olympus Plastics	28-101
Centrifuge Avanti J-20	Beckman Coulter	J320XP-IM-5
Tube, Polypropylene, Thinwall, 5.0 mL	Beckman Coulter	326819
Tube, Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm	Beckman Coulter	326823
Athymic nude mice	Charles River Laboratories	Strain Code  490 (Homozygous)	Prior approval by the Institutional Animal Care Program and by the Institutional Biosafety Committee required.