Mediada por CRISPR reorganización de la estructura de bucles de cromatina

Resumen

Bucles de cromatina juega un papel importante en la regulación de los genes; sin embargo, ha habido no hay avances tecnológicos que permiten la modificación selectiva y reversible de los bucles de cromatina. Aquí describimos un sistema de gran alcance para la reorganización de bucles de cromatina usando CRISPR-dCas9 (CLOuD9), demostró de forma selectiva y reversible modular la expresión génica en blanco loci.

Resumen

Estudios recientes han demostrado claramente a largo plazo, tridimensional cromatina bucle juego de interacciones sigue siendo un papel importante en la regulación de la expresión génica, pero si es responsable de la colocación o el resultado de alteraciones en la expresión génica desconocido. Hasta hace poco, como bucles de cromatina afectan la regulación de la actividad de los genes y función celular ha sido relativamente ambigua, y limitaciones en los métodos existentes para manipular estas estructuras impidieron la exploración en profundidad de estas interacciones. Para resolver esta incertidumbre, hemos diseñado un método para la reorganización de bucles de cromatina selectiva y reversible mediante CRISPR-dCas9 (CLOuD9). El dinamismo del sistema CLOuD9 ha demostrado acertada localización de construcciones CLOuD9 a loci genómicos para modular la conformación local de cromatina. Lo importante es la capacidad de revertir el contacto inducido y restaurar la conformación de la cromatina endógeno también se ha confirmado. Modulación de la expresión génica con este método establece la capacidad de regular la expresión génica celular y pone de relieve el gran potencial de aplicaciones de esta tecnología en la creación estable de novo bucles de cromatina que afectan marcadamente gene expresión en los contextos de desarrollo y cáncer.

Introducción

La relación entre cromatina plegable en el núcleo y la organización específica del genoma ha cosechado gran interés en los últimos años, como se ha demostrado para ser asociado de cerca a gene expression^1,2. Mientras que la relación precisa entre la actividad de los genes y la modulación de la estructura de la cromatina sigue siendo confusa, se ha planteado la hipótesis que las interacciones entre los contactos cromosómicas como resultado de la organización de la cromatina tridimensional dinámica servir un gen función normativa³. De hecho, tal efecto ha sido bien demostrada en el locus del gen de globina humana, donde la región de control del locus (LCR) regula la actividad de los genes de la globina de forma específica al desarrollo mediante la creación de un bucle de cromatina entre las dos regiones⁴. Sin embargo, en esta y en otras regiones, no está claro si la cromatina bucles es una causa o la consecuencia de alteraciones en la expresión génica.

Hasta ahora, los retos en el estudio de este fenómeno seguía siendo sin resolver. Por ejemplo, otros intentos de inducir bucles de cromatina implicó modificar la secuencia de ADN lineal o procedimientos complicados que requieren una gran cantidad de conocimientos sobre los elementos específicos que facilitan la colocación de^{5,6, 7,8}. Además, mientras que el trabajo anterior ha sugerido que la cromatina bucles de expresión génica de unidad en un contexto específico y restringido de^7,8, el nivel en que la cromatina bucle afecta la transcripción a nivel mundial es incierto. Aunque el interés en el impacto de bucle largo alcance sobre la expresión génica ha crecido continuamente en los últimos años, persisten interrogantes sobre establecer y mantener contactos de cromatina para cambiar la actividad de los genes.

La tecnología que hemos diseñado emplea la proteína regularmente otro corto palindrómico repeticiones (CRISPR) - CRISPR - asociadas Cluster deficiente de nucleasa 9 (dCas9), para permitir el targeting ampliamente aplicable de cualquier loci genómicos⁹. Esta tecnología elimina las complejas cuestiones relacionadas con modificaciones de la secuencia lineal de ADN y es accesible sin conocimiento previo importante de colocación de los componentes. En particular, la herramienta es universal y ampliamente aplicable a los bucles de cromatina en desarrollo así como en una variedad de enfermedades como el cáncer. El poder de CLOuD9 demuestra alteración reversible de la estructura de bucles para efectivamente modular la expresión génica.

Protocolo

1. gRNA diseño

1. Seleccione una herramienta de diseño de gRNA estándar para el diseño de la guía RNAs¹⁰. Utiliza pares complementarios de CLOuD9 construcciones previamente desarrollados⁹ (es decir, construyen al menos 1 S. aureus (CSA) y 1 S. pyogenes (CSP)) para cada experimento.
   1. Dentro de la herramienta de diseño en línea seleccionados, utilice la secuencia Protospacer motivo adyacente (PAM) "NGG" con una longitud de guía de 20 bp para CSP y el PAM de la secuencia "NNGRRT" con una longitud de guía de 21 para CSA.
   2. Guías basadas en la especificidad de elegir marcar y diseñar guías en ambos filamentos para maximizar las posibilidades de obtener una guía de trabajo.
   3. Orden 2 oligonucleótidos por guía un oligo fabricante: para el oligo forward, agregar "caccg", en el extremo 5' de la secuencia de la guía y para la inversa oligo, añadir "aaac" al "c" para el extremo 3' y 5' el extremo antes de ordenar.
2. Inicialmente, el diseño gRNAs 3-5 para cada región de interés, sobre una región de bp 250-1000. Evaluar la gRNA dirigidos a eficiencia como sigue:
   1. GRNAs clon identificado en un plásmido de Cas9 activa (ver paso 3) y transitoriamente transfectar en células 293T (ver paso 4)¹¹.
   2. Cultivar células de 2-3 d en de Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) con 10% suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina (strep de pluma), cosecha y extracción de ADN genómico¹².
   3. Amplificar regiones específicas por reacción en cadena de polimerasa (PCR). Ejecutar los productos en gel de agarosa al 1.5% y purificar bandas adecuadas.
   4. Realizar un análisis de endonucleasa de T7 como se describe en el Guschin, et al. Protocolo^13,14.
      Nota: Guías eficientes son los determinados para cortar el ADN en el sitio de destino.

2. cultivo celular

1. Mantener las células sanas y dividiendo activamente el estado.
   1. Para K562s, cultura en medios de comunicación Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 con 10% de SBF y el 1% pluma de strep.
      1. Crecer K562s en un matraz de cuello inclinado de 25 cm² para el mantenimiento y ajuste de la densidad celular a 400.000 células por mL cada día.
      2. Después de K562s han sido transduced con CLOuD9 construye, añadir 2 puromicina μg/mL y 100 de μg/mL Higromicina a los medios de mantenimiento.
   2. Para 293Ts, cultura en de Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) con 10% de SBF y el 1% pluma de strep.
      1. Crecen 293Ts en placas de 10 cm² y dividir al confluente.

3. el plásmido preparación y gRNA inserción¹⁵

Nota: Mapas de plásmidos están disponibles en el apéndice y cartillas utilizadas en los experimentos de ejemplo están disponibles en la tabla adicional 1.

1. Mezcla 5 μg de plásmido CRISPR lentivirales con 3 μl de BsmBI, 3 μl de fosfatasa alcalina, 6 μl de 10 x Buffer y 0,6 μl de recién preparada 100 mM TDT. El volumen total a 60 μL con ddH₂O e incubar a 37 ° C por 30 minutos digerir y dephosphorylate el plásmido.
2. Gel purifican el plásmido digerido y eluir en ddH₂O.
3. Mezclar 1 μl de cada una de las guías sincronizadas de 100 μm con 1 μl de 10 x Buffer de ligadura de T4, 6,5 μl del ddH₂O y 0,5 μl PNK T4, para alcanzar el volumen total de 10 μl. Incubar a 37 ° C durante 30 min, luego de 95 ° C por 5 min, luego la rampa hasta 25 ° C a 5 ° C por minuto.
   Nota: Esto recuece el par de guías.
4. Diluir el recocido guías (paso 3.3) 1: 200 en ddH₂O.
5. Mezclar 1 μl del plásmido digerido del paso 3.2 con 0,5 μl de las guías ligadas diluidas del paso 3.4, 2.5 μl de 2 x de Buffer, 1 μl de ddH₂O y 0,5 μl de ligasa, para hacer una reacción total 5.5 μl. Esto incubar a temperatura ambiente durante 10 min a ligar a las guías para el plásmido digerido BsmBI.
6. Transformar el plásmido recientemente ligado de paso 3.5 en bacterias Stbl3 y amplificar usando cualquier método de preparación de plásmido.

4. lentivirus producción

1. Cuenta 750.000 293T células por pozo para un pozo de seis placa usando un hemocitómetro y les semilla en DMEM con 10% de SBF y el 1% pluma de strep. Utilice un pocillo para cada construcción.
2. 24 h después de la siembra, cambiar los medios de comunicación a fresco sin antibióticos DMEM con 10% FBS.
3. En un tubo, diluir 11 μl de reactivo de transfección basada en lípidos con 150 μL del medio OptiMEM, por reacción¹¹.
4. En un tubo aparte, diluya 2 μg de plásmido vector lentivirales CLOuD9 de paso 3.6 0.35 μg pMDLg/pRRE, 1 μg de pRSV-Rev y 0,65 μg de pMD2.G con 150 μL del medio OptiMEM, por reacción¹¹.
5. Para cada reacción, añadir las mezclas diluidas plásmido lentivirales para el reactivo de transfección basada en lípidos diluidos en una proporción 1:1 e incubar durante 5 minutos¹¹.
6. Agregar todo el volumen de cada complejo mixto de paso 4.5 en los pocillos respectivos de las células 293T sin antibióticos en el paso 4.2.
7. 48 h más tarde, recoger los medios de producción viral por pipetear en un tubo de fresco y vuelta abajo a 300 x g durante 5 minutos. Después de la centrifugación, pasar el sobrenadante a un tubo nuevo para eliminar restos de células residuales.
8. Los medios de producción viral inmediatamente para la transducción de las células diana o congelar a-80 ° C para su uso futuro.

5. lentivirus Transduction de las células

1. Añadir 250 μl de cada construcción viral de interés (compuesto por plásmidos de CLOuD9 complementarios) a un tubo cónico de 15 mL que contiene células de 80.000 para la aplicación de CLOuD9.
2. Llevar el volumen total de los medios de comunicación en cada uno cónico de 1 mL con medio libre de antibiótico y añadir polibreno a una concentración final de entre 1-8 μg/mL (la concentración máxima de polibreno tolerado por el tipo de célula utilizado tendrá que ser determinado experimentalmente).
3. Girar las células a 800 x g durante 30 min a temperatura ambiente, luego resuspender mediante pipeteo sin retirar el sobrenadante viral. Pasar la suspensión de toda la célula a una placa de cultivo celular.
4. 24 h post-transducción de señales, las células de la vuelta abajo a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
5. Aspire viral sobrenadante y resuspender las células en medios de cultivo celular regular.
6. Al día siguiente, añadir puromicina (1 μg/mL para las células 293T) e Higromicina (25 μg/mL para las células 293T) al medio de cultivo celular para seleccionar células transduced doblemente. Determinar experimentalmente las concentraciones apropiadas de puromicina e Higromicina para un tipo celular determinado antes de comenzar los experimentos.
7. Mantener las células en medios de selección de al menos 3 d antes de cualquier posteriores experimentos y mantener en los medios de selección para la duración de todos los experimentos.

6. dimerización y lavado hacia fuera de la célula

1. Añadir 1 mM de ácido abscísico (ABA) o un volumen equivalente de dimetilsulfóxido (DMSO) para controles de cultivo celular que dimerizan la CLOuD9 seleccionado y transduced las células. Usar ABA dentro de 6 meses de la fecha de recepción, mantener frío y proteger de la luz a lo largo de uso. 2 mM ABA puede utilizarse si es necesario.
   1. Cambiar diariamente los medios de comunicación fresco ABA (o DMSO para los controles) para la duración de los experimentos.
      Nota: No hay límite en la longitud de la dimerización se ha observado todavía.
2. Revertir la dimerización a través de la eliminación de los medios de comunicación que contiene ABA y lavar las células con suficiente tamponada fosfato salina (PBS) para cubrir la superficie de la placa, dos veces. Después de eso, células en cultivo en medios libres de ABA para mantener un estado sin dimerized.

7. inmunoprecipitación y Co-immunoprecipitations

Nota: Hacer todas las memorias intermedias fresco e inmediatamente antes de su uso.

1. Tras la realización de experimentos de dimerización, recoger y girar por las células, luego aspirar el sobrenadante.
2. Reticulación y congelación de células
   1. Hacer un caldo fresco de formaldehído al 1% en PBS a temperatura ambiente utilizando materiales frescos. Por cada 2 millones de células, resuspender suavemente con 1 mL de formaldehído al 1% a temperatura ambiente durante exactamente 10 minutos, mientras gira.
      Nota: Utilizar un volumen mínimo de 10 mL para la reticulación células menos de 10 millones.
   2. Saciar el entrecruzamiento con la adición de glicina a una concentración final de 0,125 M, seguido por la incubación durante 5 minutos a temperatura ambiente, mientras gira.
   3. Desactivación de las células y lavar x 1-2 con PBS helado. Gránulos de la célula pueden ser complemento congelado en nitrógeno líquido y almacenados a-80 ° C o utilizados inmediatamente.
      Nota: Calor invertirá reticulaciones de formaldehído. Si prisa, las células pueden almacenarse directamente en-80 ° C sin congelar el cierre.
3. Preparar el conjugado de anticuerpo/grano
   Nota: Optimizando las condiciones para el anticuerpo elegido (es decir, pruebas de buffers diferentes lisis lisis celular y la realización de IP) pueden ser que vale la pena. Dos tampones comunes, tampón de lisis de Farnham y almacenador intermediario de RIPA modificado, pueden tener un efecto significativo sobre la IP eficiencia y eficacia de sonicación. Todas las composiciones de búfer pueden encontrarse en la Tabla de materiales. Además, tenga en cuenta que la cromatina sonicación puede tomar varias horas para completar.
   1. Resuspender los granos con un vórtex brevemente como apropiado para el anticuerpo solicitado.
   2. Transferir una cantidad apropiada de granos para el experimento a un tubo de 1,5 mL. Como punto de partida, utilice 20 μl de granos para cada 1 μg de anticuerpo. No añadir anticuerpo aún.
      Nota: Use 10 de μg de anticuerpo con 200 μL de granos para 1 mg de total lisado como punto de partida, a menos que se sabe que el anticuerpo es más o menos eficiente que esto implicaría. Para las proteínas de baja abundancia, esta relación puede necesitar ajustarse.
   3. Si se utiliza el tampón de lisis de Farnham, lavar 3 x en tampón de dilución de la propiedad intelectual. Si se utiliza el tampón de lisis RIPA, lavar 3 x en tampón de lisis RIPA.
   4. Resuspender los granos en un volumen final del mismo buffer de paso 7.3.3 (dilución de IP o almacenador intermediario RIPA) que es > 1 x y < 5 veces el volumen inicial. es decir Para el volumen de grano inicial μl 100, utilizar entre 100 y el volumen de resuspensión final de 500 μl.
   5. Añadir el anticuerpo para granos lavados en una concentración adecuada. Para un buen anticuerpo HA o bandera al IP CLOuD9 construcciones, uso de anticuerpos a 1:50 (μg proteína: μg proteína lisada) e incubar entre 8 + h y durante la noche a 4 ° C, mientras gira. Por otra parte, incuban durante 2-4 h a temperatura ambiente.
   6. Retire el sobrenadante de granos y deseche.
   7. De perlas de lavado 3 veces con el tampón de lavado.
   8. Vuelva a suspender en un volumen mínimo de la memoria intermedia utilizada para la incubación con el anticuerpo (dilución de IP o almacenador intermediario RIPA). Mantener fría hasta combinar con lisado de proteínas.
4. Someter a ultrasonidos cromatina
   1. Primero lyse las células con la adición de tampón al Pellet celular en hielo durante 10 minutos la hinchazón, sacudiendo las células cada pocos minutos para evitar colocar.
      Nota: Generalmente, 500 μl de tampón de la hinchazón se añade a células 25 millones y escala a partir de ahí, pero no uso a menos de 500 μl tampón para < 25 millones de células.
   2. Dounce manualmente hacia la derecha y hacia la izquierda, 13 cada uno.
   3. Núcleos de vuelta abajo a 4 ° C por 5 min a 1.500 x g. aspiración el sobrenadante totalmente y repita el procedimiento para retirar el sobrenadante restante a continuación, pesan el precipitado de células en mg.
   4. Agregar inhibidor de la proteasa al tampón de lisis de núcleos (Farnham buffer o RIPA buffer, por encima, elegir una).
   5. Añadir 10 cantidad de x de tampón de lisis de núcleos núcleos concentrados para suspender de nuevo (por ejemplo, añadir 1 mL de tampón de lisis de núcleos a una pelotilla de 0,100 g). Brevemente vortex y lyse durante 10 min en hielo.
      Nota: Tenga en cuenta el tamaño del tubo de sonicación. Volumen ideal a menudo es < 1 mL, las muestras pueden necesitar dividir si los gránulos son muy grandes.
      1. Para Co-IP, someter a ultrasonidos para solubilizar el material y saciar SDS a un nivel que permite la inmunoprecipitación con 2-3 volúmenes de tampón de dilución de los núcleos y, a continuación, proceda al paso 7.4.6. Anticuerpos muy sensibles, añadiendo más tampón de dilución para reducir la concentración de SDS.
         Nota: Sonicación de parada cuando borra lisado; cambia de un opaco, translúcido blanco a transparente. Mantener las muestras tan frío como sea posible y no sobre someter a ultrasonidos.
      2. Fondo para ChIP, someter a ultrasonidos ADN para obtener fragmentos de ADN de 150-1000 bp, luego proceda al paso 7.4.6.
   6. Centrifugar material insoluble a la máxima velocidad durante 10 min a 4 ° C.
   7. Transferencia de material soluble a un tubo nuevo.
   8. Para Co-IP, medir la concentración de proteína y proceder a la desconexión en el paso 7.5.
   9. Para ChIP, sacar una alícuota de 10 μl de despejó lisado y agregar 40 μl de tampón de elución IP y 6 μl 5 M NaCl para que de un total de 56ul. Hervir durante 15 min a 95 ° C, añadir 5-10 μl de 3 M NaOAc pH 5 y limpiar en una columna de purificación de la polimerización en cadena. Medir la concentración de ADN midiendo la absorbancia a 260 nm y estandarizar en las muestras. Luego proceder a la desconexión en el paso 7.5.
      Nota: Extra lisado puede snap congelado a-80 ° C y utilizar en un momento posterior, pero los mejores resultados se obtienen de la fresca lisada. Si la congelación, no congelar/descongelar más lisado de una vez.
5. Telecine
   1. Transferir una cantidad apropiada de proteína lisada a un tubo nuevo. Si se utiliza el tampón de lisis de Farnham, diluir en 2,1 volúmenes de tampón de dilución de la propiedad intelectual (arriba).
   2. Reservar 100 μl del sobrenadante para control de entrada y almacenar a 4 ° C hasta el día siguiente.
   3. Añadir grano/anticuerpo conjugado de paso 7.3.8 a muestras ahora.
   4. Rotar las muestras a 4 ° C durante la noche y asegurar que hay suficiente volumen de movimiento de líquidos en tubos de 1,5 mL.
6. Lavar y eluir
   1. Después de la rotación durante la noche, guarde el sobrenadante como la fracción no vinculante. Luego lavar granos 3-5 veces en tampón de dilución de la propiedad intelectual.
   2. Preparar el tampón de elución de IP a temperatura ambiente, sin inhibidores.
   3. Complejos de eluir con 50 μl de tampón de elución agita en el vortex a 67 ° C mín. 15 transferencia de elución a un tubo nuevo y repita con el otro 50 μl. combinar ambos para una elución de 100 μl total.
      Nota: Si hay demasiado fondo de este procedimiento de elución, calor puede reducirse o eliminado durante la agitación/incubación. Esto generalmente reduce la producción de la proteína diana pero significativamente disminuir el fondo.
7. Revertir vínculos cruzados por calefacción a 67 º C durante > 4 h.
   Nota: Esto no es estrictamente necesario para la IPs pero puede ser útil.
   1. Para Co-IP, para asegurar el completo dimerización entre los objetivos de interés, ejecutar eluatos en un gel de SDS-page y sonda con anticuerpos específicos contra la HA tag o etiqueta de la bandera, como se indica, todo en 1: 1.000. Luego continúe con el paso 8.
   2. ChIP-qPCR, para garantizar la correcta localización y focalización de cada componente CRISPR-dCas9, limpiar producto de elución en una columna y eluir en 10 μl. realizar en tiempo real cuantitativo reacción en cadena polimerasa (qPCR) de DNA purificado. Iniciadores utilizados en los datos presentados están disponibles en la tabla adicional 1. Luego continúe con el paso 8.

8. ARN extracción y PCR cuantitativa

1. Para investigar los cambios inducidos por la CLOuD9 en la expresión génica, en primer lugar, aislar y purificar RNA total de control celular pellets y pellets dimerized celular.
2. ADN complementario (cDNA) desde el RNA purificado por transcripción inversa¹⁷ y realizar análisis de qPCR. Cartillas están disponibles en la tabla adicional 1.

9. ensayo de captura de conformación de cromosoma

1. Observar los cambios en la frecuencia de los contactos de los loci genómicos inducida por CLOuD9, realizar captura de conformación del cromosoma (3C) ensayos de⁸.
2. Cuantificar los productos de 3C ligadura en dos conjuntos de duplicados para cada una de las tres réplicas biológicas por PCR cuantitativa en tiempo real. Normalizar las muestras a las señales de 3C de lo locus de tubulina. Cartillas están disponibles en la tabla adicional 1.

Resultados

CLOuD9 induce reversible β-globina promotor-LCR bucle. Uso adecuado del sistema CLOuD9 induce contacto reversible de la CSA complementaria y CSP CLOuD9 construye a través de la adición o eliminación de ABA para medios de cultivo celular (Figura 1a). CSP y CSA construcciones (Figura 1b) se localizan en regiones genómicas apropiadas usando estándar CRISPR gRNAs. Teniendo en cuenta la vasta documentación del locus de la globina humana así como el plegamiento cromosómicos frecuentes y cambio que se produce allí durante el desarrollo, esta región fue elegida para demostrar la utilidad del sistema CLOuD9. Además, la línea de celular K562 fue seleccionada porque se ha demostrado que constantemente expresan altos niveles del gen fetal γ-globina, en comparación con el gen de la β-globina que normalmente se expresa en células del linaje eritroide adultos sanos. Mediante el uso de las células K562, la capacidad de CLOuD9 para modificar la expresión génica puede ser examinada al tratar de restaurar la expresión del gen β-globina en esta línea celular.

Antes de la inducción de dimerización, cromatina inmunoprecipitación cuantitativa PCR (ChIP-qPCR) fue utilizado para asegurar la localización exacta y la orientación de cada componente de CLOuD9 (figura 1 complementaria). Además, co-inmunoprecipitación (Co-IP) con y sin ABA había verificado dimerización CSP y CSA en presencia del ligando como reversibilidad en ausencia de ligando (figura 1C y suplementario Figura 2). 24 h después de agregar el ABA, un mayor contacto entre la β-globina y la LCR apareció como es medido por captura de la conformación del cromosoma (3C) en las células con ambas partes de dimerización, pero no los controles que contiene sólo dos construcciones CSA o CSP, validando así la especificidad del cambio de la cromatina en los sitios específicos (figura 1 c y complementarias figuras 3, 4). Crear la interacción de LCR-β-globina no eliminó totalmente el contacto de LCR-globina endógeno, pero por el contrario, añadido al contacto original, como previamente divulgados⁸. Se observaron aumentos de β-globina/LCR contactos para un máximo de 72 h de dimerización, independientemente de la región exacta en la específicos LCR y β-globina región promotora (complementarios figuras 5,6). Por último, la reversibilidad del sistema fue confirmada con el 3C después de retirar la ABA, que demostró una completa renovación de la conformación endógena (Figura 1D y complementaria figuras 3-6).

Consideramos que el éxito demostrado en las células K562 puede ser el resultado de la ubicación del locus de globina en una región de eucromatina (figura 1 d), por lo que una segunda línea celular fue utilizada para explorar esta idea. Se aplicó el sistema de CLOuD9 a células HEK 293T regiones heterochromatic y no expresan genes de globina (Figura 1e). El resultado fue similar a lo observado en K562s; más asociaciones de LCR de la β-globina fueron medidas por 3C después de 24 h con ABA (Figura 1e y suplementario Figura 3), proporcionando evidencia de capacidad robusta de CLOuD9 para funcionar en diferentes entornos celulares, a pesar del estado original de la cromatina o conformación.

Loci adicionales fueron probados para asegurar la amplia aplicabilidad de CLOuD9, incluyendo el promotor Oct4 y un potenciador distal 5' dentro de las células 293T. Previamente, ha habido ninguna expresión perceptible de Oct4 en esta línea celular y además, ningún contacto endógeno descrito. Pruebas de expresión Oct4 en células madre embrionarias resultando de contacto con el potenciador distal 5' motivaron este experimento, y el mismo resultado se observó en el lugar geométrico de la β-globina del¹⁸. Contacto entre el Oct4 promotor y potenciador distal fue identificado en las células de CLOuD9 habilitado, pero no las células control (figura 1f). Además, se observó que el promotor Oct4 y distal 5' potenciador de interacción también incitaron un potenciador del 3' a en contacto con el promotor de Oct4. Este evento es consistente con la evidencia que el 3' reforzador interactúa con el promotor de Oct4/5 ' potenciador distal compleja durante la activación de genes endógenos¹⁰.

CLOuD9 induce alteraciones específicas de contexto en loci gen. Después de confirmar que el sistema de CLOuD9 de hecho inducir cromosómicas contactos en lugares geométricos del gene, se buscó analizar efecto los lazos sobre la expresión génica. Se ha documentado que la transcripción de los genes Oct4 y globina son contingentes en los contactos entre los lugares geométricos del gene LCR y globina y entre el potenciador distal 5' y promotor de Oct4, respectivamente^1,11. Por lo tanto, la hipótesis de que la utilización de la CLOuD9 sistema formación de bucles de cromatina unidad en cada una de estas regiones tendría como resultado convincente expresión génica.

En ambos loci, RT-qPCR demostró que ABA inducida por la cromatina bucles condujo aumentos Oct4 expresión en células 293T y en la expresión de la β-globina en células K562, aunque no en 293Ts (Figura 2a). Aunque la adición de ABA a cultura para tan poco como 24 expresión mayor h β-globina de la célula, expresión continuó aumentando constantemente hasta 72 horas y fue reversible al derrubio de ABA (Figura 2a). Todas las células K562 a excepción de los controles había seguido esta tendencia, no importa donde los componentes de dimerización fueron situados en las regiones promotoras LCR y β-globina (Figura 2a y complementarias figuras 7,8). En apoyo de estas conclusiones, ChIP-qPCR de H3K4me3 y RNA Pol II en el locus de la β-globina en K562s y 293Ts correspondió con las alteraciones observadas en la transcripción (figura 2 c-f).

CLOuD9 establece lazos de cromatina estable. Aunque a corto plazo inducción de bucle con CLOuD9 seguido claramente las expectativas, ya sea inducción a largo plazo de bucle efectos diferenciales permaneció a observar. Para investigar esto, las células fueron cultivadas en presencia de ABA durante 10 días. Mientras que K562s y 293Ts exhiben mayor frecuencia de contacto entre el locus de la β-globina y el LCR en relación con los controles (figura 3a, b y figuras complementarios 9,10), sólo se observaron alteraciones en la expresión de β-globina en las células K562 (Figura 3C). Curiosamente, sin embargo, se observó que a largo plazo dimerización en K562s, donde la transcripción era fuertemente alza, no era más largo reversible (figura 3a y complementaria figuras 9-11). Sin embargo, en 293Ts, donde se observó ninguna alteración en la transcripción después de dimerización a largo plazo, induce alteraciones en los contactos de la cromatina permanecidos reversibles (figura 3b y suplementario Figura 9).

En general, sólo una pequeña disminución en la expresión génica se observó después de 10 días de retiro de la ABA, que seguía siendo significativamente mayor que los niveles de expresión del gen antes de dimerización (Figura 3C). En consonancia con esto, las células K562, pero no células 293T, demostraron alteraciones sostenidas en H3K4me3 y RNA Pol II en el locus de la β-globina por ChIP-qPCR, comparados a los controles, incluso después de 10 días de retiro de ABA (Figura 3d-f). Por lo tanto, nuestros resultados indican que la estabilidad del bucle de cromatina implica más genes sostenible.

Figura 1: CLOuD9 induce reversible β-globina promotor-LCR bucle. (a) adición de ácido abscísico (ABA, verde) trae dos construcciones complementarias de CLOuD9 (CLOuD9 S. pyogenes (CSP), CLOuD9 S. aureus (CSA), rojo y azul, respectivamente) en proximidad, remodelación de la estructura de la cromatina. Retiro de ABA restaura la conformación de la cromatina endógena. (b) CLOuD9 construcciones combinan la tecnología CRISPR-dCas9 de S. aureus y S. pyogenes con dominios PYL1 y ABI1 reversible dimerizeable. (c) línea de tiempo de CLOuD9 dimerización experimentos. (d) 3 C ensayo medición frecuencias de reticulación por todo el lugar geométrico de β-globina en células K562 después de 24 h de tratamiento con ABA (rojo) y posterior lavado (azul) muestra reversibilidad de inducida por contactos de β-globina/LCR (resaltadas en gris). Puntas de flecha naranja indican regiones de destino de construcción de CLOuD9 específicas. El fragmento de EcoRI que contienen sitios de hipersensibilidad 1-4 de la LCR (barra negra) fue utilizado como la región de anclaje. Se evaluaron su frecuencia de entrecruzamiento con otros fragmentos de EcoRI indicados (nombres en la parte superior del gráfico). Los genes de la β-globina humana y LCR hipersensibilidad son representados en la parte inferior de la gráfica con las coordenadas de posición cromosómica. Datos de ChIP-seq H3K4me3 y H3K9me3 demuestran que esta región euchromatic en K562s. (e) similares se observan cambios reversibles en la estructura de la cromatina en células HEK 293T, a pesar de la evidencia de datos H3K4me3 y H3K9me3 ChIP-seq que la globina región es heterochromatic en este tipo celular. (f) 3 C ensayo medición de frecuencias de reticulación todo el locus Oct4 en 293T células después de 72 h de tratamiento con ABA (rojo) mostrando inducida Oct4 distal contactos enhancer (resaltadas en gris). Puntas de flecha naranja indican regiones de destino de construcción de CLOuD9 específicas. El fragmento de MboI que contienen el promotor Oct4 (barra negra) fue utilizado como la región de anclaje. Se evaluaron su frecuencia de entrecruzamiento con otros fragmentos de MboI indicadas (nombres en la parte superior del gráfico). Las regiones Oct4 humanas están representadas en la parte inferior de la gráfica con las coordenadas de posición cromosómica. Todos los resultados de 3C se obtuvieron por lo menos tres experimentos independientes. 3C los valores se normalizaron a la tubulina. Para β-globina, la frecuencia de interacción entre el fragmento de anclaje y el fragmento que abarca el fragmento β/HS fueron fijada a cero. Para Oct4, frecuencia de interacción entre el fragmento de anclaje y un fragmento de control negativo fuera de la región de interacción Oct4 se establece en cero. Barras de error indican s.d. n = 3. Esta cifra ha sido modificada de la figura 1 en Morgan, Stefanie L., et al. ⁹. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: CLOuD9 induce alteraciones específicas de contexto en gene expresión y cromatina. (a) inducida de CLOuD9 cromatina bucles en el locus de la β-globina resulta en la inducción reversible de la expresión de β-globina en K562s pero no en 293Ts. significación dada en relación con las células del control tratado. Dos colas estudiante t-pruebas * P < 0.05, t = 3.418, df = 5; P < 0.0001, t = 10.42 df = 5; n.s. no significativo. Barras de error indican s.d. n = 3. (b) bucle de inducción de Oct4 expresión fue observada en 293Ts tras CLOuD9-inducida en el mismo lugar geométrico. Importancia se da en relación con las células del control tratado. Dos colas estudiante t-pruebas * P < 0.05, t = 4.562, df = 2. Barras de error indican s.d. (c) esquema de localizaciones de cartilla ChIP-qPCR a lo largo del cuerpo del gen β-globina. (d, e) ChIP-qPCR demuestra alteraciones reversibles en H3K4me3 en el locus de la β-globina en K562s pero no en 293Ts después de CLOuD9 inducida por bucle. Dos colas estudiante t-pruebas * P < 0.05, ** P < 0.001, *** P < 0.0001. Barras de error indican s.d. (f) CLOuD9 mediada por alteraciones en la transcripción de la β-globina en K562s corresponden con aumentos en la ocupación de la RNA Pol II a través de la totalidad del cuerpo gen β-globina. Dos colas estudiante t-pruebas * P < 0.05, ** P < 0.001, *** P < 0.0001. Barras de error indican s.d. Esta figura ha sido modificada desde la figura 2 en Morgan, Stefanie L., et al. ⁹. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: CLOuD9 establece lazos de cromatina estable que sustentan la expresión del gen robusta después de dimerización a largo plazo. (a, b) 3 C análisis demuestra que en K562s pero no 293Ts, bucles de cromatina CLOuD9-inducida se convierte en irreversible después de 10 días de tratamiento ABA, incluso cuando se quita el ABA hasta 10 días más. Todos 3C se obtuvieron resultados de por lo menos tres experimentos independientes. 3C los valores se normalizaron a la tubulina, y frecuencias de interacción entre el fragmento de anclaje y el fragmento que abarca el fragmento β/HS fueron fijadas a cero. Barras de error indican s.d. n = 3. (c) estabilización de bucle en K562s resultados en expresión persistente de β-globina, incluso después de 10 días de lavado de ABA. No hay cambios en la expresión de β-globina se observan en 293Ts. significación dada en relación con las células del control tratado. Dos colas estudiante t-pruebas *** P < 0.0001, t = 5.963, df = 5; aumento no significativo (d) ChIP-qPCR mostrando n.s. H3K4me3 marcas sobre el locus de la β-globina en respuesta a la inducida por la CLOuD9 bucle se sostiene después de 10 días de lavado ligando en K562s. dos colas del estudiante t-pruebas * P < 0.05, ** P < 0.001, *** P < 0.0001. (e) no hay alteraciones significativas en H3K4me3 señales siguientes a largo plazo dimerización fueron observados por ChIP-qPCR en 293Ts. (f) ocupación aumentó ARN Pol II del lugar geométrico del β-globin tras inducción de lazo a largo plazo se mantuvo en K562s después de 10 días de lavado de ligando. Dos colas estudiante t-pruebas * P < 0.05, ** P < 0.001, *** P < 0.0001. Todas las barras de error indican s.d. Esta figura ha sido modificada desde la figura 3 en Morgan, Stefanie L., et al. ⁹. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 1 complementaria: CLOuD9 construcciones localización a sus regiones objetivo. Inmunoprecipitación de cromatina y cuantitativo PCR de CLOuD9 construcciones demuestran localización correcta a sus loci genómicos previstos. Esta figura ha sido modificada desde suplementario Figura 1 Morgan, Stefanie L., et al. ⁹. haga clic aquí para descargar esta figura.

Suplementario Figura 2: CLOuD9 construcciones reversible asocian en respuesta al tratamiento ABA. Co-immunoprecipitations demostrar la Asociación de las proteínas dCas9 siguiente 72 h de tratamiento ABA es invertido siguiente posterior 72 h de lavado ligando. Esta figura ha sido modificada desde suplementario Figura 2 Morgan, Stefanie L., et al. ⁹. haga clic aquí para descargar esta figura.

Suplementario Figura 3: tratamiento de Control no induce ningún cambio en los contactos de cromatina. El tratamiento con DMSO, un agente de control, por 24 horas no induce ningún cambio en la conformación de la cromatina endógena 3 c en cualquiera de los dos células K562 o HEK 293Ts. 3C los valores se normalizaron a la tubulina y frecuencias de interacción entre el fragmento de anclaje y el fragmento que abarca el fragmento β/HS fueron fijados a cero. Barras de error indican SD. n = 3. Esta figura ha sido modificada desde suplementario Figura 3 en Morgan, Stefanie L., et al. ⁹. haga clic aquí para descargar esta figura.

Suplementario figura 4: las células Control CLOuD9 transduced no mostrar ninguna alteración en bucles de cromatina. Dirigir dos CLOuD9 construye a cualquiera el LCR o el promotor de la β-globina no induce ningún cambio significativo en la estructura de la cromatina por 3C después del tratamiento de la ABA en relación con tratamiento de control. 3C los valores se normalizaron a la tubulina, y frecuencias de interacción entre el fragmento de anclaje y el fragmento que abarca el fragmento β/HS fueron fijadas a cero. Barras de error indican SD. n = 3. Esta figura ha sido modificada desde suplementario figura 4 en Morgan, Stefanie L., et al. ⁹. haga clic aquí para descargar esta figura.

Suplementario Figura 5: CLOuD9 bucles de cromatina permanece reversible después de 72 horas de dimerización. Ensayo de C 3 en K562s demuestra reversibilidad de CLOuD9 inducida por β-globina/LCR contactos después de 72 horas de tratamiento ABA. 3C los valores se normalizaron a la tubulina, y frecuencias de interacción entre el fragmento de anclaje y el fragmento que abarca el fragmento β/HS fueron fijadas a cero. Barras de error indican SD. n = 3. Esta figura ha sido modificada desde suplementario Figura 5 en Morgan, Stefanie L., et al. ⁹. haga clic aquí para descargar esta figura.

Suplementario Figura 6: CLOuD9 inducida por β-globina/LCR bucle no se ven afectado por el sitio de destino de la globina. Dirección de CSP y CSA construye a regiones alternativas de la LCR o los resultados de promotor de β-globina en similares cambios reversibles en la inducción del ciclo por 3C tras 72 horas de tratamiento ABA. 3C los valores se normalizaron a la tubulina, y frecuencias de interacción entre el fragmento de anclaje y el fragmento que abarca el fragmento β/HS fueron fijadas a cero. Barras de error indican SD. n = 3. Esta figura ha sido modificada desde suplementario Figura 6 en Morgan, Stefanie L., et al. ⁹. haga clic aquí para descargar esta figura.

Suplementario Figura 7: CLOuD9 inducida por alteraciones en la expresión génica se mantienen independientemente del sitio de destino de la globina. Dirección de CSP y CSA construye alternativa regiones del promotor de β-globina y LCR no tiene impacto sobre la inducción de la expresión génica después de 72 h de dimerización. Sin embargo, mientras algunos impactan fuerza de expresión del gen siguiente dimerización a largo plazo (10 días) se observó, altos niveles de β-globina en relación con las células del control tratado fueron sostenido siguientes lavado de ligando posterior durante 10 días adicionales. Importancia se da en relación con las células del control tratado. p < 0.001, t = 10.25, df = 5; p < 0.0001, de izquierda a derecha t = 8.697, df = 6, t = 40.31, df = 7; n.s. no significativo. Todas las barras de error indican SD Esta figura ha sido modificada desde suplementario Figura 7 en Morgan, Stefanie L., et al. ⁹. haga clic aquí para descargar esta figura.

Suplementario Figura 8: Control CLOuD9 transduced las células no muestran alteraciones en la expresión de β-globina. Dirigir dos CLOuD9 construye a cualquiera el LCR o el promotor de la β-globina no induce ningún cambio significativo en la expresión de β-globina tratamiento ABA en relación con tratamiento de control. Importancia se da en relación con las células del control tratado. n.s. no significativo. Esta figura ha sido modificada desde suplementario Figura 8 Morgan, Stefanie L., et al. ⁹. haga clic aquí para descargar esta figura.

Suplementario Figura 9: tratamiento de control a largo plazo no induce ningún cambio en los contactos de cromatina. El tratamiento con DMSO, un agente de control, durante 10 días no induce ningún cambio en la conformación de la cromatina endógena 3 c en cualquiera de los dos células K562 o HEK 293Ts. 3C los valores se normalizaron a la tubulina y frecuencias de interacción entre el fragmento de anclaje y el fragmento que abarca el fragmento β/HS fueron fijados a cero. Barras de error indican SD. n = 3. Esta figura ha sido modificada desde suplementario Figura 9 en Morgan, Stefanie L., et al. ⁹. haga clic aquí para descargar esta figura.

Suplementario Figura 10: CLOuD9 a largo plazo inducida por β-globina/LCR bucle no se ven afectado por el sitio de destino de la globina. Dirección de CSP y CSA construye regiones alternativas de la LCR o los resultados de promotor de la β-globina en sostenido asimismo lazo de inducción según lo demostrado por el 3C después de 10 días de tratamiento ABA y 10 días de lavado posterior ligando. 3C los valores se normalizaron a la tubulina, y frecuencias de interacción entre el fragmento de anclaje y el fragmento que abarca el fragmento β/HS fueron fijadas a cero. Barras de error indican SD. n = 3. Esta figura se ha modificado de 10 Figura complementaria en Morgan, Stefanie L., et al. ⁹. haga clic aquí para descargar esta figura.

Suplementario Figura 11: CLOuD9 construcciones irreversible asocian en respuesta al tratamiento a largo plazo de ABA. Co-immunoprecipitations demostrando Asociación irreversible de las proteínas dCas9 CSP y CSA después de 10 días de tratamiento ABA y 10 días posteriores de lavado ligando. Esta figura ha sido modificada desde suplementario Figura 11 en Morgan, Stefanie L., et al. ⁹. haga clic aquí para descargar esta figura.

Complementario tabla 1: lista de cartilla secuencias gRNAs, qRT-PCR, C 3 y ChIP qPCR. Esta tabla ha sido modificada desde complementario tabla 1 Morgan, Stefanie L., et al. ⁹. por favor haga clic aquí para descargar esta tabla

Discusión

The Most son pasos críticos en bucles de cromatina de CLOuD9: 1) el diseño o utilizando el correcto gRNAs, 2) cambiante media diaria en las células transduced CLOuD9, incluyendo ABA o DMSO, 3) mantener la frescura de la ABA y 4) realizar evaluaciones precisas y cuidadosas de conformación de la cromatina.

Los límites de CLOuD9 residen principalmente en la habilidad de diseñar guías de la región de destino de elección. RNAs guía realizan la importante tarea de localizar los componentes de la dCas9 a regiones de ADN blanco para ser dimerized y la eficacia de las guías se basan en su sitio de destino específico. Sin los componentes de gRNA adecuada, CLOuD9 sistema no será capaz de formar reversible inducida por bucles. Así, al diseño de guías múltiples para cada región de interés y difusión de las guías en una región de 250-1000 bp, se garantizará al menos una guía acertada. Guía de ubicación también es esencial para resultados precisos. Es importante evitar guías situadas en sitios de unión del factor de transcripción u otras regiones críticas para evitar efectos de fondo tales como arriba o abajo la regulación de la transcripción. Además, la ubicación precisa de la construcción de CLOuD9 puede afectar ligeramente transcripción del gene blanco. Esto pone de relieve la importancia de probar múltiples pares de guías para cada región de destino, para identificar al par más robusto para los propósitos experimentales. Además, en cada par de regiones de destino, la construcción de la CSA debe estar dirigida con gRNAs para S. aureus, y el constructo CSP debe estar dirigido con gRNAs para S. pyogenes para apuntar la especificidad.

Para asegurar resultados exactos y dimerización correcto, también es importante mantener la frescura de los ambientes celulares después de la transducción de las construcciones de CLOuD9. Cambio de media diaria y la adición de dimerizer fresca (o control) garantiza que las construcciones complementarias quedarán en proximidad y preservar la conformación de la cromatina alterada. Además, garantizar el ABA es fresco y se ha almacenado adecuadamente según protocolo del fabricante (abierto plazo de 6 meses, mantenidos frío, protegidos de la luz) es esencial para obtener resultados auténticos.

En particular, el dimerizer ABA de CLOuD9 fue utilizado con las proteínas de dimerización de ABI y PYL, en lugar de los más comúnmente utilizaron sistema FRB y FKBP. La necesidad de un rapalog para el sistema FRB/FKBP habría limitado la aplicabilidad de CLOuD9, debido a la toxicidad para las células cancerosas. El sistema alternativo de ABI/PYL eludido esta limitación, con eficacia permitiendo CLOuD9 ser más ampliamente utilizable.

Colectivamente, hemos desarrollado CLOuD9, una tecnología única y robusta que puede a la fuerza pero reversible crear contactos entre los lugares geométricos genomic objetivo a largo plazo. A través de la inducción de bucles de cromatina, también demostramos que CLOuD9 pueden ser utilizados para modificar la expresión génica en el apropiado contexto celular. La adaptabilidad de la tecnología permite el estudio libre de las interacciones entre cualquier dos loci genómicos, sin necesidad de conocimiento previo de la colocación de regiones o mecanismos de colocación. Además, exclusiva reversibilidad demostrada de CLOuD9 permite más análisis de los mecanismos de colocación en la enfermedad y el desarrollo. Mientras que los efectos en el blanco de bucles de cromatina han demostrado claramente, hay todavía datos que ofrece información sobre los efectos del objetivo de colocación y el posterior impacto en los lazos en blanco.

Nuestros datos muestra sólo algunas aplicaciones de esta herramienta sino que implica la importante idea subyacente que arreglo de cromatina es indicativo de la expresión génica. Nuestra tecnología puede utilizarse para estudiar y revelar los matices de la estructura de la cromatina en la regulación de los genes, mejorando así la comprensión general del papel de la cromatina plegable en la transcripción de genes. Una mejor comprensión de las sutilezas de dinámicas transcripcionales puede liderar el camino en la investigación y tratamiento del cáncer, enfermedades hereditarias y enfermedades congénitas, en que la cromatina distinta Asamblea altera sin duda gene expresión^{20, 21,22,23}. Trabajos posteriores utilizando la tecnología de CLOuD9 iluminarán aún más detalles sobre el arreglo y la dinámica de los dominios de la cromatina y cómo conducen plegable para sustentar la expresión génica estable en el desarrollo y la enfermedad.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640  media	Life Technologies	11875-119	For K562 cell culture
DMEM media	Life Technologies	11995-065	1X, for 293T cell culture
lentiCRISPR v2	Addgene plasmid	#52961	For CLOuD9 plasmid development
pRSV-Rev	Addgene plasmid	#12253	For lentivirus production
pMD2.G	Addgene plasmid	#12259	For lentivirus production
pMDLg/pRRE	Addgene plasmid	#12251	For lentivirus production
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668-019	For lentivirus production
anti-HA antibody	Cell Signaling	3724	For immunoprecipitation
anti-Flag antibody	Sigma	F1804	For immunoprecipitation
DNeasy Blood and Tissue Kit	Qiagen	69504	For DNA extraction
TRIzol	Life Technologies	15596-018	For RNA extraction
RNeasy Kit	Qiagen	74106	For RNA extraction
Superscript VILO	Life Technologies	11754-050	For cDNA
SYBR Green I MasterMix	Roche	4707516001	For qPCR analysis
Light Cycler 480II	Roche		For qPCR analysis
anti-H3K4me3 antibody	AbCam	ab8580	For ChIP-qPCR
anti-RNA Pol-II antibody	Active Motif	61083	For ChIP-qPCR
EDTA free protease inhibitor	Roche	11873580001	For protein extraction
4-12% Tris Glycine gel	Biorad		Any size, For western blot
anti-Rabbit HRP antibody	Santa Cruz	sc-2030	For western blot
anti-mouse HRP antibody	Cell Signaling	7076S	For western blot
K562 and H3K293 ChIP-Seq data	Encode	ENCSR000AKU	For ChIP-seq analysis
K562 and H3K293 ChIP-Seq data	Encode	ENCSR000APE	For ChIP-seq analysis
K562 and H3K293 ChIP-Seq data	Encode	ENCSR000FCJ	For ChIP-seq analysis
K562 and H3K293 ChIP-Seq data	GEO	GSM1479215	For ChIP-seq analysis
Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation	Thermo Fisher Scientific	10001D	For immunoprecipitation
Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation	Thermo Fisher Scientific	10004D	For immunoprecipitation
RNA Clean & Concentrator-5	Zymo Research	R1015	For RNA purification
Pierce 16% Formaldehyde Methanol-free	Thermo Fisher Scientific	28908	For crosslinking
PX458 Plasmid	Addgene	48138	Suggested active Cas9 plasmid for gRNA cloning, but any active Cas9 plasmid will do
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104	For PCR purification
FastDigest BsmBI	Thermo Fisher Scientific	FD0454	For cloning guide RNAs
FastAP	Thermo Fisher Scientific	EF0651	For cloning guide RNAs
10X FastDigest Buffer	Thermo Fisher Scientific	B64	For cloning guide RNAs
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	For cloning guide RNAs
10X T4 Ligation Buffer	NEB	B0202S	For cloning guide RNAs
T4 PNK	NEB	M0201S	For cloning guide RNAs
2X Quick Ligase Buffer	NEB	B2200S	For cloning guide RNAs
Quick Ligase	NEB	M2200S	For cloning guide RNAs
Buffers
Farnham lysis buffer			1% Tris-Cl pH 8.0, 1% SDS, 1% protease inhibitor water solution (non-EDTA), and 1 mM EDTA in water
Modified RIPA buffer			1% NP40/Igepal, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 1 mM EDTA, and 1% protease inhibitor water solution (non-EDTA) in PBS pH 7.8 or 7.4
IP dilution buffer			0.01% SDS, 1.1% Triton-X 100, 1.2 mM EDTA, 16.7 mM Tris-HCl pH 8.0, 167 mM NaCl, 0.1x protease inhibitor
Wash buffer			100 mM Tris pH 9, 100 mM LiCl, 1% NP-40, and 1% sodium deoxycholate
Swelling buffer			0.1 M Tris pH 7.5, 10 mM potassium acetate, 15 mM magnesium acetate, 1% NP-40
Dilution buffer			0.01% SDS, 1.1% Triton X-100, 1.2 mM EDTA, 16.7 mM Tris pH 8 and 167 mM NaCl
IP elution buffer			1% SDS, 10% NaHCO3