Mediada por CRISPR reorganização da estrutura de Loop de cromatina

Resumo

Loop de cromatina desempenha um papel significativo na regulação gênica; no entanto, tem havido sem avanços tecnológicos que permitem a modificação seletiva e reversível de loops de cromatina. Aqui descrevemos um sistema poderoso para reorganização do laço da cromatina usar CRISPR-dCas9 (CLOuD9), demonstrado para seletivamente e reversivelmente modular a expressão gênica no alvo loci.

Resumo

Estudos recentes demonstraram claramente que cromatina de longo alcance, tridimensional loop jogo de interações, um papel importante na regulação da expressão gênica, mas se o loop é responsável ou um resultado de alterações na expressão gênica é ainda desconhecido. Até recentemente, como cromatina loop afeta a regulação da atividade do gene e a função celular tem sido relativamente ambígua, e limitações de métodos existentes para manipular essas estruturas impediram a exploração profunda dessas interações. Para resolver esta incerteza, nós produzimos um método para a reorganização do laço cromatina seletivo e reversível usando CRISPR-dCas9 (CLOuD9). O dinamismo do sistema CLOuD9 foi demonstrado pelo sucesso localização das construções CLOuD9 para loci genômicos para modular a conformação da cromatina local de destino. Importante, a capacidade de reverter o contato induzido e restaurar a conformação da cromatina endógena também foi confirmada. Modulação da expressão genética com este método estabelece a capacidade de regular a expressão gênica celular e ressalta o grande potencial para aplicações desta tecnologia na criação de loops de cromatina que afetam marcadamente gene estável de novo expressão nos contextos de desenvolvimento e de câncer.

Introdução

A relação entre cromatina dobrar no núcleo e a organização específica do genoma tem atraído interesse significativo nos últimos anos, como tem sido mostrado ser intimamente associada com a expressão de gene^1,2. Enquanto a relação exacta entre a atividade do gene e modulação da estrutura da cromatina permanece obscura, tem sido a hipótese de que as interações entre contatos cromossômicos como resultado da organização da cromatina tridimensional dinâmica servem um Gene regulador de função³. Com efeito, tal efeito foi bem demonstrado no locus do gene da globina humana, onde a região de locus de controle (LCR) regula a atividade dos genes da globina de maneira específica desenvolvente, criando um loop de cromatina entre as duas regiões⁴. No entanto, nesta e outras regiões, não está claro se cromatina loop é uma causa ou a consequência de alterações na expressão gênica.

Até agora, os desafios em estudar este fenômeno permaneceram sem solução. Por exemplo, outras tentativas de indução de loops de cromatina envolveram modificando a sequência de DNA linear ou procedimentos complicados, que exigem uma abundância de conhecimento sobre elementos específicos que facilitam a loop^{5,6, 7,8}. Além disso, enquanto trabalho anterior sugeriu que cromatina loops de expressão gênica de unidade em um contexto específico e restrito de^7,8, o nível no qual cromatina loop afeta transcrição globalmente é incerto. Embora o interesse no impacto de loop de longo alcance na expressão gênica tem crescido continuamente nos últimos anos, perguntas sem resposta sobre como estabelecer e manter contatos de cromatina para alterar a atividade do gene persistirem.

A tecnologia que temos engenharia emprega a nuclease deficiente em cluster regularmente intercaladas curta palíndromo repetições (CRISPR) - CRISPR - associadas proteína 9 (dCas9), para permitir o direcionamento amplamente aplicável de qualquer loci genômicos⁹. Esta tecnologia elimina as questões complexas relacionadas com modificações da sequência de DNA linear e é acessível sem significativo conhecimento prévio dos componentes de loop particulares. Mais notavelmente, a ferramenta é universal e amplamente aplicável às alças de cromatina reconhecidas no desenvolvimento, bem como uma variedade de doenças, como câncer. O poder do CLOuD9 é demonstrado, reversível, alterando a estrutura de loops para efetivamente modular a expressão gênica.

Protocolo

1. gRNA Design

1. Selecione uma ferramenta de projeto padrão gRNA para projetar o guia RNAs¹⁰. Use pares complementares do previamente desenvolvido CLOuD9 construções⁹ (ou seja, pelo menos 1 S. aureus (CSA) e 1 S. pyogenes (CSP) construir) para cada experimento.
   1. Dentro da ferramenta de design on-line selecionado, use a sequência de Protospacer adjacentes Motif (PAM) "NGG" com um comprimento de guia de 20 bp para o PAM e o CSP sequência "NNGRRT" com um comprimento de guia de 21 para CSA.
   2. Guias com base na especificidade de escolher marcar e guias em ambas as vertentes, para maximizar as chances de obter um guia de trabalho de design.
   3. Ordem 2 oligonucleotides por guia de um fabricante de oligo: para avançar oligo, adicione "caccg" à extremidade 5' da sequência de guia e para o reverso oligo, adicionar "aaac" à extremidade 5' e "c" à extremidade 3' antes de encomendar.
2. Inicialmente, o projeto gRNAs de 3 a 5 para cada região de interesse, espalhados por uma região de bp 250-1000. Avalie a gRNA visando eficiência como segue:
   1. GRNAs clone identificado em um plasmídeo Cas9 ativo (consulte a etapa 3) e transfect transitoriamente em 293T células (ver passo 4)¹¹.
   2. Desenvolvem-se células para 2-3 d em de Dulbecco modificado águia médio (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% penicilina-estreptomicina (estreptococos de caneta), em seguida, colher e extrato de DNA genômico¹².
   3. Amplifica regiões específicas por reação em cadeia da polimerase (PCR). Executar produtos em um gel de agarose 1,5% e purificar bandas apropriadas.
   4. Realizar um ensaio de endonuclease T7, conforme descrito no Guschin, et al. protocolo^13,14.
      Nota: Guias eficientes são aqueles determinados a cortam o ADN no local de destino.

2. cultura de pilha

1. Manter as células em um saudável e ativamente dividindo o estado.
   1. Para K562s, cultura em meios de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 com 10% FBS e 1% caneta de estreptococos.
      1. Crescer K562s num balão de pescoço inclinada 25 cm² para manutenção e ajustar a densidade da célula a 400.000 células / mL de cada dia.
      2. Depois de K562s ter sido transfectadas com CLOuD9 constrói, adicionar 2 puromicina µ g/mL e 100 µ g/mL hptII a media de manutenção.
   2. Para 293Ts, cultura em de Dulbecco modificado águia médio (DMEM) com 10% FBS e 1% caneta de estreptococos.
      1. Crescer 293Ts em placas de 10 cm² e separaram-se quando confluentes.

3. plasmídeo preparação e gRNA inserção¹⁵

Nota: Plasmídeo mapas estão disponíveis no apêndice e primers utilizados nas experiências de exemplo estão disponíveis em complementar a tabela 1.

1. Mistura de 5 µ g da particulas de Lentivirus shRNA CRISPR com 3 µ l de BsmBI, 3 µ l de fosfatase alcalina, 6 µ l de tampão de 10x e 0,6 µ l de recentemente preparada 100 mM DTT. Trazer o volume total de 60 µ l com DDQ₂O e incubar a 37 ° C por 30 min digerir e dephosphorylate o plasmídeo.
2. Gel de purificar o plasmídeo digerido e eluir em ddH₂O.
3. Misturar 1 µ l de cada um dos guias emparelhados em 100 µM com 1 µ l de Buffer de ligadura de T4, 6,5 µ l de DDQ₂O e 0,5 µ l de 10x T4 PNK, para atingir 10 µ l volume total. Incubar a 37 ° C por 30 min, depois de 95 ° C por 5 min, em seguida, rampa até 25 ° C a 5 ° C/min.
   Nota: Isto irá recoze o par de guias.
4. Diluir a 1: 200 guias recozido (da etapa 3.3) em ddH₂O.
5. Misturar 1 µ l do plasmídeo digerido de passo 3.2 com 0,5 µ l dos guias ligados diluídos da etapa 3.4, 2,5 µ l de 2 x Buffer, 1 µ l de DDQ₂O e 0,5 µ l de Ligase, tornar-se uma reação total 5,5 µ l. Isto incube à temperatura ambiente por 10 min para ligate as guias para o plasmídeo BsmBI digerido.
6. Transformar o plasmídeo recém ligado da etapa 3.5 Stbl3 bactérias e amplificar usando qualquer método de preparação do plasmídeo.

4. lentivirus produção

1. Contagem 750.000 293T células por poço para um seis-poço da placa usando um hemocytometer e semente-los em DMEM com 10% FBS e 1% caneta de estreptococos. Use um poço para cada construção.
2. 24 h após a semeadura, alterar a mídia para fresco sem antibióticos DMEM com 10% FBS.
3. Em um tubo, dilua 11 µ l de reagente de transfeccao baseada em lipídios com 150 µ l do meio de OptiMEM, por reação¹¹.
4. Em um tubo separado, dilua 2 µ g do plasmídeo de vetor de Lentivirus CLOuD9 da etapa 3.6, 0,35 µ g de pMDLg/pRRE, 1 µ g de pRSV-Rev e 0,65 µ g de pMD2.G com 150 µ l do meio de OptiMEM, por reação¹¹.
5. Para cada reação, adicionar as misturas diluídas particulas de Lentivirus shRNA com o reagente de transfeccao baseada em lipídios diluída na proporção de 1:1 e incubar durante 5 min¹¹.
6. Adicione todo o volume de cada complexo misto da etapa 4.5 nos respectivos poços das células sem antibióticos 293T da etapa 4.2.
7. 48 h depois, recolher mídia produção viral pipetando num tubo fresco e rotação para baixo a 300 x g por 5 min. Após a centrifugação, mova o sobrenadante para um tubo fresco para remover os resíduos de células residuais.
8. Use mídia produção viral imediatamente para a transdução de células alvo ou congelar a-80 ° C para uso futuro.

5. lentivirus transdução de células

1. Adicione 250 µ l de cada construção viral de interesse (composto de plasmídeos de CLOuD9 complementares) para um tubo cônico de 15 mL contendo 80.000 células para o aplicativo CLOuD9.
2. Trazer o volume total dos meios de comunicação em cada cônica para 1 mL com mídia sem antibióticos e adicionar polybrene para uma concentração final de 1-8 µ g/ml (concentração máxima de polybrene tolerado pelo tipo de célula utilizado precisará ser determinada experimentalmente).
3. Girar as células a 800 x g durante 30 min à temperatura ambiente e, em seguida, resuspenda pipetando sem remover o sobrenadante viral. Mova a suspensão de toda a célula para uma placa de cultura de células.
4. pós-transdução de 24 h, células de rotação para baixo a 300 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
5. Aspirar viral sobrenadante e ressuspender as células em meios de cultura de célula normal.
6. No dia seguinte, adicione puromicina (1 µ g/mL para células 293T) e hptII (25 µ g/mL para células 293T) para o meio de cultura celular para selecionar células duplamente transduzidas. Experimentalmente, determine as concentrações adequadas de puromicina e hptII para um determinada célula tipo antes de começar os experimentos.
7. Manter a células em meios de seleção pelo menos 3 d antes de quaisquer experiências a jusante e em meios de seleção para a duração de todas as experiências.

6. celular dimerização e lavagem para fora

1. Adicionar 1 mM ácido abscísico (ABA) ou uma quantidade equivalente de Dimetilsulfóxido (DMSO) para controles para cultura de células para dimerizam o CLOuD9 selecionado e transfectadas células. Use a ABA dentro de 6 meses da data de recepção, manter-se frio e protegê-lo da luz ao longo do uso. 2 mM ABA pode ser utilizada se necessário.
   1. Mudam diariamente a mídia para fornecer ABA fresco (ou DMSO para controles) para a duração dos experimentos.
      Nota: Há limite para o comprimento de dimerização ainda tem sido observado.
2. Reverta a dimerização através da remoção de mídia contendo a ABA e células de lavagem com suficiente tamponado fosfato salino (PBS) para cobrir a superfície da placa, duas vezes. Daí em diante, cultura de células em meios de comunicação livre de ABA para manter um estado un-dimerized.

7. imunoprecipitação e Co-moleculas

Nota: Verifique todos os buffers fresco e imediatamente antes da utilização.

1. Após conclusão dos experimentos de dimerização, coletar e spin para baixo de células e, em seguida, Aspire o sobrenadante.
2. Crosslink e congelar para baixo de células
   1. Fazer um estoque fresco de formol 1% em PBS em temperatura ambiente usando materiais frescos. Para cada 2 milhões de células, resuspenda delicadamente com 1 mL de formaldeído 1% à temperatura ambiente por exatamente 10 min, enquanto roda.
      Nota: Utilize um volume mínimo de 10 mL de reticulação, menos de 10 milhões de células.
   2. Saciar a reticulação com a adição de glicina a uma concentração final de 0,125 M, seguido de incubação durante 5 min à temperatura ambiente, enquanto roda.
   3. Gire para baixo as células e lavar 1-2x com PBS gelado. Pelotas de célula podem então ser snap congelado em nitrogênio líquido e armazenado a-80 ° C ou usado imediatamente.
      Nota: O calor irá inverter ligações cruzadas de formaldeído. Se apressado, as células podem ser armazenadas diretamente no-80 ° C sem congelar o snap.
3. Preparar o conjugado anticorpo/pérola
   Nota: Otimizando condições para anticorpo escolhido (por exemplo, testes buffers de Lise diferentes para lise celular e executar o IP) podem valer a pena. Dois buffers comuns, tampão de Lise Farnham e amortecedor de RIPA modificado, podem ter um efeito significativo sobre a eficiência IP e eficiência sonication. Todas as composições de buffer podem ser encontradas na Tabela de materiais. Além disso, tenha em mente que cromatina sonication pode levar várias horas para completar.
   1. Resuspenda grânulos vortexing brevemente, conforme apropriado para o anticorpo escolhido.
   2. Transferi uma quantidade adequada de grânulos para o experimento para um tubo de 1,5 mL. Como ponto de partida, use 20 µ l de grânulos para cada 1 µ g de anticorpo. Não adicione anticorpo ainda.
      Nota: Use 10 µ g anticorpo com 200 µ l de grânulos para 1mg de total lisado como ponto de partida, a menos que ele é conhecido que o anticorpo é mais ou menos eficiente do que isso implicaria. Para proteínas de baixa abundância, essa proporção pode precisar ser ajustada.
   3. Se usar tampão de lise de Farnham, lave 3 x em tampão de diluição de IP. Se usar tampão de Lise RIPA, lave 3 x em tampão de Lise RIPA.
   4. Resuspenda as contas em um volume final da mesma reserva da etapa 7.3.3 (diluição de IP ou o amortecedor de RIPA) que é > 1 x e < 5 x volume inicial. ou seja Para o volume inicial do grânulo de 100 µ l, use entre 100 e 500 µ l ressuspensão final volume.
   5. Adicione anticorpo para grânulos lavados agora em uma concentração adequada. Para um bom HA ou uma bandeira anticorpos IP CLOuD9 construções, usar anticorpos às 01:50 (µ g proteína: proteína µ g lisada) e incubar entre 8 + h e durante a noite a 4 ° C, enquanto roda. Alternativamente, incube durante 2-4 h à temperatura ambiente.
   6. Retire o sobrenadante de missanga e descarte.
   7. Lavagem de contas 3x com o tampão de lavagem.
   8. Resuspenda em um volume mínimo do buffer utilizado para incubação durante a noite com o anticorpo (diluição de IP ou o amortecedor de RIPA). Manter-se frio até combinado com lisado de proteína.
4. Proceda à sonicação cromatina
   1. Primeiro lyse pilhas com a adição de inchaço buffer para pelotas de célula no gelo por 10 min, passando rapidamente células cada poucos min para evitar a sedimentação.
      Nota: Geralmente, 500 µ l de tampão de inchaço é adicionado a 25 milhões de células e dimensionado de lá, mas fazer não uso inferior a 500 µ l de buffer para < 25 milhões de células.
   2. Homogenizacao manualmente no sentido horário e anti-horário, 13 x cada um.
   3. Então núcleos de rotação para baixo a 4 ° C por 5 min em 1.500 x g. Aspire o sobrenadante completamente e repita o procedimento para remover o sobrenadante restante, então pesam o centrifugado em mg.
   4. Adicionar inibidor da protease de tampão de lise de núcleos (Farnham buffer ou RIPA de buffer, acima, escolha uma).
   5. Adicionar 10 x quantidade de tampão de lise de núcleos para núcleos peletizados para Ressuspender (por exemplo, adicionar 1 mL de tampão de lise de núcleos de uma pelota de 0,100 g). Brevemente o vórtice e lyse por 10 min no gelo.
      Nota: Tenha em mente o tamanho do tubo sonication. Volume ideal é frequentemente < 1 mL, então amostras podem precisar ser dividido se pelotas são muito grandes.
      1. Para Co-IP, proceda à sonicação núcleos brevemente para solubilizar material e saciar SDS para um nível que permita a imunoprecipitação com 2-3 volumes de tampão de diluição e, em seguida, prossiga para a etapa 7.4.6. Para anticorpos muito sensíveis, adicione mais tampão de diluição para reduzir ainda mais a concentração de SDS.
         Nota: Parar sonication quando lisado limpa; mudará de um opaco/translúcido branco para completamente transparente. Manter amostras tão frio quanto possível e não mais proceda à sonicação.
      2. Para ChIP, completamente proceda à sonicação DNA para obter fragmentos de DNA de bp 150-1000, em seguida, prossiga para a etapa 7.4.6.
   6. Ficar fora do material insolúvel na velocidade máxima durante 10 minutos a 4 ° C.
   7. Transferi material solúvel para um tubo de fresco.
   8. Para Co-IP, medir a concentração de proteína e prossiga para o pulldown na etapa 7.5.
   9. Para ChIP, retirar uma alíquota de 10 µ l de desmarcada lisado e adicionar 40 tampão de eluição de IP µ l e 6 µ l 5 M NaCl a isso para um total de 56ul. Ferver durante 15 minutos a 95 ° C, adicionar 5-10 µ l de 3M NaOAc pH 5 e limpar em uma coluna de purificação de PCR. Medir a concentração de DNA medindo a absorbância em 260 nm e padronize as amostras. Vá para o pulldown na etapa 7.5.
      Nota: Extra lisado pode ser snap congelado a-80 ° C e usado em um momento posterior, mas os melhores resultados são obtidos de lisado o fresco. Se congelar, não congelar/descongelar lisado mais de uma vez.
5. Pulldown
   1. Transferi uma quantidade adequada de proteína lisada para um tubo de fresco. Se usar tampão de lise de Farnham, dilua em 2,1 volumes de tampão de diluição de IP (acima).
   2. Reserve 100 µ l do sobrenadante para controle de entrada e armazenar a 4 ° C até o dia seguinte.
   3. Adicione do grânulo/anticorpo conjugado da etapa 7.3.8 para amostras agora.
   4. Gire as amostras a 4 ° C durante a noite e garantir que não há volume suficiente para o movimento de líquidos em tubos de 1,5 mL.
6. Lave e eluir
   1. Após a rotação durante a noite, salve o sobrenadante como a fração nonbinding. Então lave grânulos 3-5 x no tampão de diluição de IP.
   2. Prepare o tampão de eluição IP à temperatura ambiente, sem inibidores.
   3. Eluir complexos com tampão de eluição 50 µ l abalada em um vórtice a 67 ° C por 15 min. eluição de transferência para um novo tubo e repita com mais 50 µ l. Combine os dois para uma eluição total de 100 µ l.
      Nota: Se houver muito fundo deste procedimento de eluição, calor pode ser reduzido ou eliminado durante a incubação/tremendo. Isso geralmente reduz o rendimento de proteína do alvo, mas diminuir significativamente o plano de fundo.
7. Inverter as referências cruzadas por aquecimento a 67 ° C para > 4h.
   Nota: Isto não é estritamente necessário para IPs co... mas pode ser útil.
   1. Para Co-IP, para garantir total dimerização entre os destinos turísticos, execute eluídos em um gel de SDS-page e sonda com anticorpos contra a HA marca ou marca de bandeira, conforme indicado, todos em 1: 1.000. Então vá para a etapa 8.
   2. Para ChIP-qPCR, para garantir a correta localização e segmentação de cada componente CRISPR-dCas9, limpe o produto de eluição em uma coluna e eluir em 10 µ l. executar em tempo real quantitativa cadeia da polimerase (qPCR) de DNA purificado. Primers utilizados nos dados apresentados estão disponíveis no quadro suplementar 1. Então vá para a etapa 8.

8. RNA extração e PCR quantitativo

1. Para investigar as alterações induzidas pelo CLOuD9 na expressão gênica, primeiro, isolar e purificar o RNA total de pelotas de célula de controle e célula dimerized Pelotas.
2. Fazer DNA complementar (cDNA) a partir do RNA purificado pela transcrição reversa¹⁷ e realizar análises de qPCR. Cartilhas estão disponíveis na tabela complementar 1.

9. ensaio de captura de conformação de cromossomo

1. Para observar alterações na frequência dos contactos de loci genômicos induzidos pela CLOuD9, realizar captura de conformação de cromossomo (3c) ensaios de⁸.
2. Quantificar os produtos de ligadura 3C em dois conjuntos de duplicatas para cada uma das três réplicas biológicas por PCR quantitativo em tempo real. Normalize as amostras aos sinais 3C do locus de tubulina. Cartilhas estão disponíveis na tabela complementar 1.

Resultados

CLOuD9 induz reversível de β-globina promotor-LCR loop. Uso adequado do sistema CLOuD9 induz contato reversível do CSA complementar e CSP CLOuD9 constrói através da adição ou remoção de ABA para meios de cultura de células (Figura 1a). Construções de CSA e CSP (Figura 1b) estão localizadas apropriadas regiões genômicas usando padrão CRISPR gRNAs. Considerando a vasta documentação do locus de globina humana bem como frequente de dobramento cromossômica e rearranjo que ali ocorre durante o desenvolvimento, esta região foi escolhida para demonstrar a utilidade do sistema CLOuD9. Além disso, a linhagem celular K562 foi selecionada porque mostrou consistentemente expressar altos níveis do gene γ-globina fetal, ao contrário do gene de β-globina que é normalmente expressa em células de linhagem eritroide adulto saudável. Usando as células K562, a capacidade de CLOuD9 para modificar a expressão gênica pode ser examinada por tentar restaurar a expressão do gene da β-globina nesta linha de celular.

Antes da indução de dimerização, cromatina PCR quantitativo de imunoprecipitação (ChIP-qPCR) foi utilizado para assegurar a localização exata e direcionamento de cada componente CLOuD9 (complementar a Figura 1). Além disso, o co-imunoprecipitação (Co-IP) com e sem ABA verificado dimerização CSA e CSP na presença do ligante, bem como a reversibilidade na ausência do ligante (Figura 1C e complementar a Figura 2). 24 h após a adição de ABA, maior contato entre β-globina e o LCR apareceu como medido pela captura de conformação de cromossomo (3c) nas células com ambas as partes de dimerização, mas não os controles contendo apenas duas construções CSA ou CSP, validando, assim, o especificidade da mudança da cromatina para os sites alvo (Figura 1C e complementares figuras 3,4). Criando a interação de LCR-β-globina não eliminam completamente o contato de LCR-globina endógeno, mas em vez disso, adicionado ao contato de original, como relatado anteriormente⁸. Foram observados aumentos nos contactos de β-globina/LCR para até 72 h de dimerização, independentemente da região exata dentro da LCR e β-globina promotor região de destino (figuras complementares 5,6). Por último, a reversibilidade do sistema foi confirmada com 3C depois de retirar a ABA, que mostrou uma renovação completa da conformação endógena (Figura 1 d e complementar figuras 3-6).

Consideramos que o sucesso mostrado nas células K562 pode ser um resultado do local locus globina em uma região da eucromatina (Figura 1 d), então uma segunda linha de celular foi utilizada para explorar essa ideia. O sistema CLOuD9 foi aplicado às células de 293T HEK em regiões que são heterocromático e não expressar genes de globina (Figura 1e). O resultado foi semelhante ao que foi observado em K562s; mais associações de LCR de β-globina foram medidas por 3C após 24 h com ABA (Figura 1e e complementar a Figura 3), fornecendo evidências para capacidade de robusta do CLOuD9 para funcionar em ambientes celulares diferentes, apesar do estado original de cromatina ou conformação.

Loci adicionais foram testados para garantir a plena aplicabilidade da CLOuD9, incluindo o promotor Oct4 e um potenciador distal 5' dentro das células 293T. Anteriormente, não houve nenhuma expressão Oct4 detectável nesta linha de célula e ainda mais, sem contatos endógenos descritos. Provas de Oct4 expressão em células-tronco embrionárias resultantes de contactos com o enhancer distal 5' motivaram esta experiência, e o mesmo resultado foi observado com o locus de β-globina¹⁸. Contato entre o Oct4 promotor e enhancer distal foi identificada em células CLOuD9 habilitado, mas não as células de controle (Figura 1f). Além disso, observou-se que o promotor de Oct4 e interação de enhancer distal 5' também será solicitado um potenciador de 3' para entrar em contato com o promotor de Oct4. Este evento é consistente com a evidência que o amplificador de 3' interage com o promotor de Oct4/5 ' distal realçador do complexo durante o gene endógeno ativação¹⁰.

CLOuD9 induz alterações específicas do contexto em loci gene. Após a confirmação de que o sistema CLOuD9 realmente induzir cromossômicos contatos em loci de gene, procuramos examinar efeito dos loops na expressão gênica. Foi documentado que a transcrição de genes Oct4 e globina são contingentes sobre os contatos entre os Locus do gene LCR e globina e entre a distal 5' enhancer e o promotor Oct4, respectivamente,^1,11. Assim, formulamos a hipótese que o uso do sistema de formação de laço de cromatina de unidade em cada uma destas regiões resultaria na expressão de gene convincente CLOuD9.

Em ambos os loci, RT-qPCR demonstrou essa ABA induzido cromatina loops dirigiu aumentos em Oct4 expressão em células de 293T e na expressão da β-globina em células K562, embora não em 293Ts (Figura 2a). Embora a adição de uma ABA para celular cultura para tão pouco como 24 expressão h β-globina aumentada significativamente, expressão continuou a aumentar progressivamente até 72 horas e foi reversível após fracasso de ABA (Figura 2a). Todas as células K562 exceto os controles seguiram esta tendência, não importa onde os componentes de dimerização estavam localizados nas regiões de promotor LCR e β-globina (Figura 2a e figuras complementares 7,8). Em apoio essas conclusões, ChIP-qPCR de H3K4me3 e RNA Pol-II no locus de β-globina em K562s e 293Ts correspondeu-se com as alterações observadas na transcrição (Figura 2 c-f).

CLOuD9 estabelece laços de cromatina estável. Embora a curto prazo indução de laço com CLOuD9 seguido claramente as expectativas, se a longo prazo indução de loop diferenciais efeitos permaneceram a ser observado. Para investigar isso, as células foram cultivadas na presença de ABA para 10 dias. Enquanto ambos K562s e 293Ts exibiu maior frequência de contato entre o locus de β-globina e o LCR em relação a controles (Figura 3a, b e complementares figuras 9,10), alterações na expressão de β-globina ainda só foram observadas nas células K562 (Figura 3C). Curiosamente, no entanto, observou-se que a longo prazo dimerização em K562s, onde a transcrição foi fortemente upregulated, era não mais reversível (Figura 3a e complementar figuras 9-11). No entanto, em 293Ts, onde nenhuma alteração na transcrição foi observada após longo prazo dimerização, induzida por alterações na cromatina contatos permanecidos reversíveis (Figura 3b e complementar a Figura 9).

Em geral, apenas uma pequena diminuição na expressão do gene foi observada após 10 dias de afastamento de ABA, que permaneceu significativamente mais elevados do que os níveis de expressão do gene antes da dimerização (Figura 3C). De acordo com isto, as células K562, mas não 293T células, mostraram alterações sustentadas em H3K4me3 e RNA Pol-II no locus de β-globina pelo ChIP-qPCR, comparados aos controles, mesmo depois de 10 dias antes da remoção da ABA (Figura 3d-f). Assim, nossos resultados indicam que a estabilidade do loop da cromatina implica mais sustentável de expressao.

Figura 1: CLOuD9 induz reversível de β-globina promotor-LCR loop. (a) adição de ácido abscísico (ABA, verde) traz duas construções complementares de CLOuD9 (CLOuD9 s. pyogenes (CSP), CLOuD9 S. aureus (CSA), vermelho e azul, respectivamente) em proximidade, remodela a estrutura da cromatina. Remoção da ABA restaura a conformação da cromatina endógena. (b) CLOuD9 construções combinam tecnologia CRISPR-dCas9 de S. aureus e S. pyogenes com domínios PYL1 e ABI1 reversível dimerizeable. (c) cronograma de CLOuD9 dimerização experimentos. (d) 3 C do ensaio medição frequências de reticulação todo o locus de β-globina em células K562 após 24 h de tratamento com ABA (vermelho) e posterior esmaecimento (azul) mostrando a reversibilidade do induzido contatos de β-globina/LCR (destacados em cinza). Pontas de seta laranja indicam regiões-alvo específicas CLOuD9 construção. O fragmento de EcoRI contendo sites de hipersensibilidade 1-4 do LCR (barra preta) foi usado como a região de âncora. Sua frequência de reticulação com outros fragmentos de EcoRI indicados (nomes no topo do gráfico) foram avaliados. Os genes de β-globina humana e sites de hipersensibilidade LCR são descritos na parte inferior do gráfico com as coordenadas de posição cromossômica. Os dados do ChIP-seq de H3K4me3 e H3K9me3 demonstram que esta região é eucromatina em K562s. (e) semelhante reversíveis mudanças na estrutura da cromatina são vistas nas células HEK 293T, apesar das evidências de dados H3K4me3 e H3K9me3 ChIP-seq que o globin a região é heterocromático neste tipo de célula. (f) 3 C ensaio medindo frequências de reticulação todo o locus Oct4 em 293T células após 72 h de tratamento com ABA (vermelho) mostrando induzida contatos de potenciador Oct4/distal (destacados em cinza). Pontas de seta laranja indicam regiões-alvo específicas CLOuD9 construção. O fragmento de MboI contendo o promotor Oct4 (barra preta) foi usado como a região de âncora. Sua frequência de reticulação com outros fragmentos de MboI indicados (nomes no topo do gráfico) foram avaliados. As regiões de Oct4 humanas são descritas na parte inferior do gráfico com as coordenadas de posição cromossômica. Todos os resultados de 3C foram obtidos de pelo menos três experimentos independentes. C 3 valores foram normalizados para tubulina. Para β-globina, frequências de interação entre o fragmento de âncora e o fragmento englobando o fragmento β/HS foram definidas como zero. Para Oct4, frequências de interação entre o fragmento de âncora e um fragmento de controlo negativo fora da região de interação Oct4 estavam definidas como zero. Barras de erro indicam s.d. n = 3. Esta figura foi modificada da Figura 1 em Morgan, Stefanie L., et al ⁹. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: CLOuD9 induz alterações específicas do contexto em estado de expressão e cromatina de gene. (a) induzida pela CLOuD9 cromatina loop no locus de β-globina resulta na indução da expressão da β-globina em K562s mas não em 293Ts. significado dado em relação ao controle Tratado células reversível. De student bicaudal t-testes * P < 0.05, t = 3.418, df = 5; P < 0,0001, t = 10,42 df = 5; n.s. não significativas. Barras de erro indicam s.d. n = 3. (b) indução de Oct4 expressão foi observada em 293Ts após induzida pela CLOuD9 loop para o mesmo locus. Importância é dada em relação ao controle Tratado células. De student bicaudal t-testes * P < 0.05, t = 4.562, df = 2. Barras de erro indicam s.d. (c) esquema de ChIP-qPCR locais de primeira demão ao longo do corpo do gene de β-globina. (d, e) ChIP-qPCR demonstra alterações reversíveis em H3K4me3 no locus de β-globina em K562s mas não em 293Ts induzida pela CLOuD9 loop a seguir. De student bicaudal t-testes * P < 0.05, * * P < 0,001, * * * P < 0,0001. Barras de erro indicam s.d. (f) CLOuD9 mediada por alterações na transcrição de β-globina em K562s correspondem com aumentos na ocupação de RNA Pol-II em toda a totalidade do organismo de gene de β-globina. De student bicaudal t-testes * P < 0.05, * * P < 0,001, * * * P < 0,0001. Barras de erro indicam s.d. Esta figura foi modificada da Figura 2 em Morgan, Stefanie L., et al. ⁹. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: CLOuD9 estabelece laços de cromatina estável que sustentam a expressão de gene robusto seguinte dimerização a longo prazo. (a, b) 3 C ensaio demonstra que em K562s mas não 293Ts, cromatina induzida pela CLOuD9 loop torna-se irreversível após 10 dias de tratamento ABA, mesmo quando a ABA é removido por até 10 dias adicionais. 3C todos os resultados foram obtidos de pelo menos três experimentos independentes. C 3 valores foram normalizados para tubulina, e frequências de interação entre o fragmento de âncora e o fragmento englobando o fragmento β/HS foram definidas como zero. Barras de erro indicam s.d. n = 3. (c) estabilização de Loop em K562s resulta em expressão persistente de β-globina, mesmo após 10 dias de esmaecimento de ABA. Sem mudanças na expressão de β-globina são observadas no 293Ts. significado dado em relação ao controle Tratado células. De student bicaudal t-testes * * * P < 0,0001, t = 5.963, df = 5; Não-significativas (d) ChIP-qPCR apresentando aumentos n.s. H3K4me3 marcas sobre o locus de β-globina em resposta a induzida pela CLOuD9 loop são sustentados após 10 dias de esmaecimento de ligante em do K562s. student bicaudal t-testes * P < 0.05, * * P < 0,001, * * * P < 0,0001. (e) sem alterações significativas na H3K4me3 sinaliza a longo prazo seguinte dimerização foram observados por ChIP-qPCR em 293Ts. (f) ocupação aumentou RNA Pol-II do locus de β-globina após indução de laço a longo prazo foi mantido em K562s após 10 dias de esmaecimento de ligante. De student bicaudal t-testes * P < 0.05, * * P < 0,001, * * * P < 0,0001. Todas as barras de erro indicam s.d. Esta figura foi modificada de Figura 3 em Morgan, Stefanie L., et al. ⁹. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Complementar Figura 1: CLOuD9 construções localizar às suas regiões-alvo pretendido. Imunoprecipitação da cromatina e quantitativo PCR de CLOuD9 construções demonstram a localização correta de seus loci genômicos pretendido. Esta figura foi modificada de complementar Figura 1 em Morgan, Stefanie L., et al. ⁹. , por favor clique aqui para baixar esta figura.

Complementar Figura 2: CLOuD9 construções reversível associam em resposta ao tratamento ABA. Co-moleculas demonstrando a Associação das proteínas dCas9 seguinte 72 h de tratamento ABA é revertida seguinte subsequentes 72 h de esmaecimento de ligante. Esta figura foi modificada de complementar Figura 2 em Morgan, Stefanie L., et al. ⁹. , por favor clique aqui para baixar esta figura.

Complementar Figura 3: tratamento controle não induz nenhuma alteração nos contatos de cromatina. Tratamento com DMSO, um agente de controle, para 24 horas não induz nenhuma alteração na conformação da cromatina endógena por 3C em qualquer células K562 ou HEK 293Ts. C 3 valores foram normalizados para tubulina e frequências de interação entre o fragmento de âncora e o fragmento englobando o fragmento β/HS foram definidos como zero. Barras de erro indicam SD. n = 3. Esta figura foi modificada de complementar Figura 3 em Morgan, Stefanie L., et al. ⁹. , por favor clique aqui para baixar esta figura.

Complementar Figura 4: células de controle CLOuD9 transfectadas não mostram nenhuma alteração na cromatina loop. Dirigindo dois CLOuD9 constrói a qualquer um o LCR ou o promotor de β-globina induz sem alterações significativas na estrutura da cromatina por 3C ABA no tratamento em relação ao tratamento controle. C 3 valores foram normalizados para tubulina, e frequências de interação entre o fragmento de âncora e o fragmento englobando o fragmento β/HS foram definidas como zero. Barras de erro indicam SD. n = 3. Esta figura foi modificada de complementar Figura 4 em Morgan, Stefanie L., et al. ⁹. , por favor clique aqui para baixar esta figura.

Complementar Figura 5: CLOuD9 cromatina loop permanece reversível após 72 horas de dimerização. 3C ensaio em K562s demonstra a reversibilidade das CLOuD9 induzido β-globina/LCR contatos após 72 horas de tratamento ABA. C 3 valores foram normalizados para tubulina, e frequências de interação entre o fragmento de âncora e o fragmento englobando o fragmento β/HS foram definidas como zero. Barras de erro indicam SD. n = 3. Esta figura foi modificada de complementar Figura 5 em Morgan, Stefanie L., et al. ⁹. , por favor clique aqui para baixar esta figura.

Complementar Figura 6: CLOuD9 loop de β-globina/LCR induzido não é afetado pelo site de destino de globina. Direção de CSA e CSP constrói para regiões alternativas do LCR ou os resultados de promotor de β-globina em semelhantes alterações reversíveis na indução de laço por 3C após 72 horas de tratamento ABA. C 3 valores foram normalizados para tubulina, e frequências de interação entre o fragmento de âncora e o fragmento englobando o fragmento β/HS foram definidas como zero. Barras de erro indicam SD. n = 3. Esta figura foi modificada de complementar Figura 6 em Morgan, Stefanie L., et al. ⁹. , por favor clique aqui para baixar esta figura.

Complementar Figura 7: CLOuD9 induzida por alterações na expressão gênica são sustentadas independentemente do local de destino da globina. Direção de CSA e CSP constrói para regiões alternativas promotor da β-globina e LCR não tem impacto na indução da expressão do gene após 72 h de dimerização. No entanto, enquanto alguns impactam na força de expressão gênica seguir dimerização de longo prazo (dia 10) foi observada, altos níveis de β-globina em relação ao controle Tratado células foram esmaecimento de ligante subsequentes seguir sustentado por 10 dias adicionais. Importância é dada em relação ao controle Tratado células. p < 0,001, t = 10.25, df = 5; p < 0,0001, da esquerda para a direita t = 8.697, df = 6, t = 40,31, df = 7; n.s. não significativas. Todas as barras de erro indicam SD Esta figura foi modificada de complementar a Figura 7 em Morgan, Stefanie L., et al. ⁹. , por favor clique aqui para baixar esta figura.

Complementar Figura 8: controle CLOuD9 transfectadas células não mostram nenhuma alteração na expressão da β-globina. Dirigindo dois CLOuD9 constrói a qualquer um o LCR ou o promotor de β-globina não induz nenhuma mudança significativa na expressão de β-globina ABA no tratamento em relação ao tratamento controle. Importância é dada em relação ao controle Tratado células. n.s. não significativas. Esta figura foi modificada de complementar Figura 8 em Morgan, Stefanie L., et al. ⁹. , por favor clique aqui para baixar esta figura.

Complementar Figura 9: tratamento de controle a longo prazo não induz nenhuma alteração nos contatos de cromatina. Tratamento com DMSO, um agente de controle, por 10 dias não induz nenhuma mudança na conformação da cromatina endógena por 3C em qualquer células K562 ou HEK 293Ts. C 3 valores foram normalizados para tubulina e frequências de interação entre o fragmento de âncora e o fragmento englobando o fragmento β/HS foram definidos como zero. Barras de erro indicam SD. n = 3. Esta figura foi modificada de complementar Figura 9 em Morgan, Stefanie L., et al. ⁹. , por favor clique aqui para baixar esta figura.

Complementar Figura 10: Long-Term CLOuD9 loop de β-globina/LCR induzido não é afetado pelo site de destino de globina. Direcionar o CSA e CSP constrói para regiões alternativas do LCR ou os resultados de promotor de β-globina da mesma forma sustentada laço de indução, como demonstrado por 3C após 10 dias de tratamento ABA e 10 dias de esmaecimento de ligante subsequentes. C 3 valores foram normalizados para tubulina, e frequências de interação entre o fragmento de âncora e o fragmento englobando o fragmento β/HS foram definidas como zero. Barras de erro indicam SD. n = 3. Esta figura foi modificada de complementar Figura 10 em Morgan, Stefanie L., et al. ⁹. , por favor clique aqui para baixar esta figura.

Complementar Figura 11: CLOuD9 construções irreversivelmente associam em resposta ao tratamento a longo prazo da ABA. Co-moleculas demonstrando Associação irreversível das proteínas dCas9 CSA e CSP após 10 dias de tratamento ABA e 10 dias subsequentes do esmaecimento do ligante. Esta figura foi modificada de complementar Figura 11 em Morgan, Stefanie L., et al. ⁹. , por favor clique aqui para baixar esta figura.

Suplementares tabela 1: lista de primer sequências para gRNAs, qRT-PCR, qPCR ChIP e 3C. Esta tabela foi modificada de complementar a tabela 1 em Morgan, Stefanie L., et al. ⁹. por favor clique aqui para baixar esta tabela

Discussão

The Most passos críticos no loop de cromatina CLOuD9 são: 1) projetando ou usando o gRNAs correto, mídia 2) mudando diariamente em células transfectadas CLOuD9, incluindo a ABA ou DMSO, 3) manter o frescor da ABA e 4) executar avaliações de precisa e cuidadosos de conformação da cromatina.

Os limites de CLOuD9 principalmente residem na capacidade de criar guias para a região de destino de escolha. Guia de RNAs realizar a importante tarefa de localizar os componentes dCas9 para regiões de DNA alvo para ser dimerized e a eficácia dos guias baseiam-se em seu local de destino específico. Sem os componentes de gRNA adequada, o sistema não será capaz de formar reversivelmente CLOuD9 induzida por laços. Assim, projetando vários guias para cada região de interesse e espalhando os guias sobre uma região de 250-1000 bp, será assegurado pelo menos um guia bem sucedido. Guia local é também parte integrante resultados precisos. É importante evitar guias localizados em locais de ligação do fator da transcrição ou outras regiões críticas para evitar efeitos de fundo como acima ou para baixo de regulação da transcrição. Além disso, a localização precisa da construção de CLOuD9 ligeiramente pode afetar a transcrição do gene alvo. Isto enfatiza a importância de testar vários pares de guias para cada região de destino, para identificar o par mais robusto para fins experimentais. Além disso, em cada par de regiões-alvo, a construção da CSA deve ser alvejada com gRNAs por S. aureus, e construção de CSP deve ser alvejada com gRNAs por S. pyogenes para segmentação de especificidade.

Para garantir resultados precisos e dimerização correta, também é importante manter o frescor dos ambientes celulares seguindo a transdução das construções CLOuD9. Muda de mídia diária e a adição de dimerizer fresco (ou controle) garante que as construções complementares permanecerá na proximidade e preservar a conformação da cromatina alterado. Além disso, garantir a ABA é fresco e foi armazenado adequadamente de acordo com o protocolo do fabricante (aberto no prazo de 6 meses, ficou frio, protegidos da luz) é essencial para a obtenção de resultados autênticos.

Notavelmente, o dimerizer de ABA para CLOuD9 foi usado com as proteínas de dimerização ABI e PYL, ao invés do mais comumente utilizaram sistema FRB e FKBP. A necessidade de uma rapalog para o sistema FRB/FKBP teria limitado a aplicabilidade da CLOuD9, devido a toxicidade para as células cancerosas. O sistema alternativo de ABI/PYL contornado essa limitação, permitindo efetivamente CLOuD9 ser mais amplamente utilizáveis.

Coletivamente, nós desenvolvemos CLOuD9, uma tecnologia exclusiva e robusta que pode forçosamente mas reversível criar contatos entre loci genômicos de longo alcance do alvo. Através da indução de loops de cromatina, demonstramos também que CLOuD9 pode ser utilizada para modificar a expressão do gene no contexto celular adequado. A adaptabilidade da tecnologia permite o estudo irrestrito das interações entre qualquer dois loci genômicos, sem a necessidade de conhecimento prévio do loop regiões ou mecanismos de loop. Além disso, reversibilidade de demonstrada exclusiva do CLOuD9 mais permite análise dos mecanismos de loop em doença e desenvolvimento. Enquanto os efeitos no alvo de cromatina loop demonstraram claramente, ainda há a ser dados, oferecendo uma visão sobre os efeitos de loop fora do alvo e o subsequente impacto sobre os loops no alvo.

Nossos dados ilustra apenas alguns aplicativos desta ferramenta, mas implica a principal ideia subjacente que arranjo de cromatina é indicativo da expressão do gene. Nossa tecnologia pode ser usada para estudar e revelar as nuances da estrutura da cromatina na regulação gênica, melhorando assim a compreensão global do papel da cromatina dobradura na transcrição de genes. Uma melhor compreensão das sutilezas da dinâmica transcriptional pode liderar o caminho na investigação e tratamento de câncer, doenças hereditárias e doenças congénitas, na qual cromatina distinta assembleia, sem dúvida, altera gene expressão^{20, 21,22,23}. Trabalhos posteriores, utilizando a tecnologia CLOuD9 acenderá ainda mais detalhes sobre a organização e a dinâmica dos domínios da cromatina e como eles conduzem a dobradura para sustentar a expressão do gene estável no desenvolvimento e na doença.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640  media	Life Technologies	11875-119	For K562 cell culture
DMEM media	Life Technologies	11995-065	1X, for 293T cell culture
lentiCRISPR v2	Addgene plasmid	#52961	For CLOuD9 plasmid development
pRSV-Rev	Addgene plasmid	#12253	For lentivirus production
pMD2.G	Addgene plasmid	#12259	For lentivirus production
pMDLg/pRRE	Addgene plasmid	#12251	For lentivirus production
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668-019	For lentivirus production
anti-HA antibody	Cell Signaling	3724	For immunoprecipitation
anti-Flag antibody	Sigma	F1804	For immunoprecipitation
DNeasy Blood and Tissue Kit	Qiagen	69504	For DNA extraction
TRIzol	Life Technologies	15596-018	For RNA extraction
RNeasy Kit	Qiagen	74106	For RNA extraction
Superscript VILO	Life Technologies	11754-050	For cDNA
SYBR Green I MasterMix	Roche	4707516001	For qPCR analysis
Light Cycler 480II	Roche		For qPCR analysis
anti-H3K4me3 antibody	AbCam	ab8580	For ChIP-qPCR
anti-RNA Pol-II antibody	Active Motif	61083	For ChIP-qPCR
EDTA free protease inhibitor	Roche	11873580001	For protein extraction
4-12% Tris Glycine gel	Biorad		Any size, For western blot
anti-Rabbit HRP antibody	Santa Cruz	sc-2030	For western blot
anti-mouse HRP antibody	Cell Signaling	7076S	For western blot
K562 and H3K293 ChIP-Seq data	Encode	ENCSR000AKU	For ChIP-seq analysis
K562 and H3K293 ChIP-Seq data	Encode	ENCSR000APE	For ChIP-seq analysis
K562 and H3K293 ChIP-Seq data	Encode	ENCSR000FCJ	For ChIP-seq analysis
K562 and H3K293 ChIP-Seq data	GEO	GSM1479215	For ChIP-seq analysis
Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation	Thermo Fisher Scientific	10001D	For immunoprecipitation
Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation	Thermo Fisher Scientific	10004D	For immunoprecipitation
RNA Clean & Concentrator-5	Zymo Research	R1015	For RNA purification
Pierce 16% Formaldehyde Methanol-free	Thermo Fisher Scientific	28908	For crosslinking
PX458 Plasmid	Addgene	48138	Suggested active Cas9 plasmid for gRNA cloning, but any active Cas9 plasmid will do
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104	For PCR purification
FastDigest BsmBI	Thermo Fisher Scientific	FD0454	For cloning guide RNAs
FastAP	Thermo Fisher Scientific	EF0651	For cloning guide RNAs
10X FastDigest Buffer	Thermo Fisher Scientific	B64	For cloning guide RNAs
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	For cloning guide RNAs
10X T4 Ligation Buffer	NEB	B0202S	For cloning guide RNAs
T4 PNK	NEB	M0201S	For cloning guide RNAs
2X Quick Ligase Buffer	NEB	B2200S	For cloning guide RNAs
Quick Ligase	NEB	M2200S	For cloning guide RNAs
Buffers
Farnham lysis buffer			1% Tris-Cl pH 8.0, 1% SDS, 1% protease inhibitor water solution (non-EDTA), and 1 mM EDTA in water
Modified RIPA buffer			1% NP40/Igepal, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 1 mM EDTA, and 1% protease inhibitor water solution (non-EDTA) in PBS pH 7.8 or 7.4
IP dilution buffer			0.01% SDS, 1.1% Triton-X 100, 1.2 mM EDTA, 16.7 mM Tris-HCl pH 8.0, 167 mM NaCl, 0.1x protease inhibitor
Wash buffer			100 mM Tris pH 9, 100 mM LiCl, 1% NP-40, and 1% sodium deoxycholate
Swelling buffer			0.1 M Tris pH 7.5, 10 mM potassium acetate, 15 mM magnesium acetate, 1% NP-40
Dilution buffer			0.01% SDS, 1.1% Triton X-100, 1.2 mM EDTA, 16.7 mM Tris pH 8 and 167 mM NaCl
IP elution buffer			1% SDS, 10% NaHCO3