Digestión de proteínas, ultrafiltración y cromatografía por exclusión de tamaño para optimizar el aislamiento de exosomas de suero y Plasma de sangre humana

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para purificar exosomas de plasma y suero con menor Co purificación de proteínas de la sangre no exosomal. El protocolo optimizado incluye tratamiento con proteasas y ultrafiltración y cromatografía por exclusión de tamaño. Mayor purificación de exosomas beneficios aguas abajo los análisis, incluyendo la cuantificación más exacta de las vesículas y caracterización proteómica.

Resumen

Exosomas, un tipo de nanovesicle liberado de todos los tipos de célula, pueden ser aislado de cualquier líquido corporal. El contenido de exosomas, incluyendo proteínas y ARN, es único a las células que se derivan y pueden ser utilizados como indicadores de enfermedad. Varios protocolos de enriquecimiento común, como la ultracentrifugación, producen exosomas cargado de contaminantes de la proteína soluble. Específicamente, hemos encontrado que las proteínas más abundantes en la sangre a menudo Co purifican con exosomas y pueden confundir los estudios proteómicos aguas abajo, frustrando la identificación de candidatos de biomarcadores de baja abundancia. De preocupación adicional es irreproducible de exosomas cuantificación de proteína debido a representación incompatible de niveles de proteína no-exosomal. El protocolo detallado aquí fue desarrollado para eliminar las proteínas no exosomal que co purifican junto con exosomas, adición de rigor en el proceso de purificación de exosomas. Cinco métodos se compararon mediante pares plasma de sangre y suero de cinco donantes. Análisis usando nanopartículas de seguimiento análisis y ensayo de proteína ácido bicinchoninic micro reveló que un protocolo combinado utilizando cromatografía por exclusión de tamaño y ultrafiltración dio como resultado el enriquecimiento óptima de la vesícula y la eliminación de la proteína soluble. Western Blot se utilizó para verificar que las proteínas de la sangre abundante esperados, incluyendo albúmina y Apolipoproteínas, estaban agotadas.

Introducción

Exosomas son Nanovesículas (que varían en tamaño desde 30 nm y 150 nm) facilitar la comunicación de célula a célula por casi todas las células en el cuerpo humano procesa^1,2. Curiosamente, la composición de los exosomas cambia dependiendo de las células de origen, así como el estado de salud del individuo^3,4,5. Además, exosomas pueden ser obtenido de varios fluidos biológicos tales como: saliva, orina y sangre². Debido a estas características, exosomas se consideran una buena fuente de biomarcadores de la enfermedad. Desafortunadamente, no existe ningún método estándar para el aislamiento de exosomas. Algunos laboratorios consideran varios pasos centrifugación, con un paso de alta velocidad final a 100.000 x g utilizando gradientes de densidad como el método estándar de oro para el aislamiento de exosomas. Sin embargo, estudios recientes han demostrado que ultracentrifugación induce la agregación de los exosomas con proteínas solubles y otras exosomas, además afectando la integridad de exosomas, que pueden obstaculizar las aplicaciones de bajada^6,7 . Otros métodos de aislamiento de exosomas comunes incluyen, pero no se limitan a: precipitación por comercial polietilenglicol (PEG) basado en reactivos, centrífuga ultrafiltración y cromatografía por exclusión de tamaño (SEC). Los reactivos comerciales usando polímeros de polietilenglicol (PEG) enriquecen exosomas por haciéndolos precipitar y formar una pelotilla. Limitaciones de uso de este polímero son la contaminación con residuales polímeros de PEG y la abundancia de proteínas solubles no exosomal en el producto final. Ultrafiltración utiliza centrifugación para purificar y concentrar las vesículas con membrana de celulosa; exosomas se mantienen por encima del filtro, mientras que las impurezas más pequeñas y otras proteínas atraviesan la membrana^7,8. Al igual que otros métodos de ultrafiltración centrífuga tiene una capacidad limitada para purificar exosomas debido a la retención de altos niveles de proteínas no exosomal, incluyendo agregados y complejos de la proteína. Por último, purificación seg utiliza resina porosa para separar moléculas por tamaño. SEC ha demostrado resultados prometedores, superar la mayoría de los problemas experimentados con otros métodos de captura de la mayoría de las proteínas contaminantes y preservar la integridad de la exosomal, puesto que el aislamiento se basa en la gravedad o sistemas de baja presión^{7, 9}. Sin embargo, el aislamiento Co de mayor proteína agregados y lipoproteínas¹⁰ durante SEC afecta la pureza de la preparación final de exosomas. Mientras que algunos métodos han sido probados para la purificación de exosomas de sobrenadantes de cultivo de células y plasma⁷o^9,de plasma solamente¹¹, no hay información sobre el desempeño de métodos comparando directamente la sangre plasma y el suero del individuo mismo.

Aquí, nos centramos en la purificación de la sangre exosomas comparando una variedad de flujos de trabajo para determinar si las técnicas de enriquecimiento vesícula son traducibles entre plasma y suero. Nanopartículas de seguimiento análisis y western blot fueron utilizados para cuantificar las diferencias en la composición de proteína, concentración y pureza de exosomas en los productos finales. El método final, detallado en el presente Protocolo, aumenta el número de vesículas y reduce los niveles de proteína no-exosomal. Lo importante, se demostró una reducción drástica de común Co precipitando proteínas como albúmina y Apolipoproteínas. La gran abundancia de estas dos proteínas en sangre y la frecuencia en que co purifican con exosomas causas inconsistencias entre las muestras "purificadas", sesgando el análisis descendentes. Este protocolo incluye el uso de una resina de s disponible en el mercado; la resina se compone de granos porosos en que las proteínas menores de 700 kDa pueden introducir los granos. Una vez dentro, las proteínas son retenidas por un ligando Octilamina. El eluido se compone de exosomas y moléculas más grandes que 700 kDa¹². Además, con el fin de reducir los agregados de proteínas y Apolipoproteínas que evaden captura de grano, se incluye un paso de digestión de proteasa en el flujo de trabajo. Actualmente, no es capaz de maximizar el rendimiento de exosomas reduciendo el co purificación proteínas no exosomal solo técnica. Este estudio muestra que un protocolo de purificación que combina un tratamiento previo de digestión de proteasa con varios métodos de recuperación y purificación puede usarse para aumentar el rendimiento de exosomas y pureza del suero sanguíneo y plasma.

Protocolo

Este trabajo se determinó no investigación de sujeto humano sobre la revisión inicial de Colorado State University institucional revisar Board (IRB), todas las muestras humanas fueron obtenidas como muestras anónima del biorepositorio de IVT Bioreclamation y recogido bajo protocolos IRB aprobado.

1. preparación de crudo muestra (Plasma o suero) por vesículas de mayor granulación y detritos celulares

Nota: Consideración de seguridad: plasma, suero y otros fluidos biológicos son materiales con riesgo biológico y debe manipularse con especial cuidado, usando equipo de protección personal básico, incluyendo guantes y bata de laboratorio. Se recomienda que las muestras biológicas se procesan en una bioseguridad gabinete; Si no está disponible, se recomienda el uso de protección para los ojos.

1. Equilibrar un suero o una muestra de plasma colocando el tubo en condiciones de no sacudir en el refrigerador de 4 ° C durante la noche (de cualquiera de los dos -20 o -80 ° C).
2. Alícuota de 250 μl de la muestra en un tubo de microcentrífuga utilizando una pipeta de 1000 μl.
3. Centrifugar la muestra a 18.000 x g durante 30 min a 4 ° C.
4. Con una pipeta de 200 μL, quitar 200 μL del sobrenadante despejado y añadir a un nuevo tubo de microcentrífuga. Evitar cualquier material peletizado al transferir el sobrenadante. Deseche el material peletizado.
5. Cuantificar el contenido de proteína de la muestra de ensayo de bicinchoninic ácido (BCA), usando el protocolo del fabricante. Para realizar el ensayo, diluir la muestra 1:50 en 1 x solución salina tamponada con fosfato (PBS). Probar cada muestra por duplicado.
   Nota: Uso de 1 x PBS a través del Protocolo a menos que se indique lo contrario. En promedio, 200 μL de suero clarificado o plasma (después de 18.000 x g) dará 15 mg de proteína total. Otros tipos de muestras, con contenido de proteínas superior o inferior, pueden requerir diluciones adicionales de BCA.
6. Alícuota 10 mg de la muestra en un tubo nuevo de microcentrífuga. Utilizar la concentración obtenida en el paso 1.5 para calcular el volumen correspondiente de muestra. Parte alícuota de la muestra con una pipeta de 200 μl.
   Nota: Se recomienda almacenar la muestra restante a-80 ° C. Utilice alícuota de la muestra en diferentes tubos de 10 mg por tubo para evitar múltiples hielo-deshielo ciclos en el futuro.

2. digestión de proteínas de la sangre no exosomal

Nota: El paso de digestión está diseñado para reducir las proteínas no exosomal que pueden purificar conjuntamente con exosomas. Si preservación de proteínas de superficie de exosomas se requiere para los análisis posteriores, debe tenerse en cuenta que este paso tiene el potencial de interferir en este análisis. La detección de la exosomal CD63, una proteína de superficie expuesta tetraspanina, no fue afectada significativamente negativamente por este proceso.

1. Preparar solución de proteinasa K a una concentración de 500 μg/mL en PBS. Añadir la cantidad correspondiente de proteinasa K en un tubo cónico. Luego añadir el tampón y el vortex durante 30 s, 3 x a temperatura ambiente.
2. Añadir 50 μl de solución de proteinasa K a la alícuota de muestra de 10 mg y suavemente mezclar mediante pipeteo arriba y abajo con una pipeta μl 200.
3. Incubar la muestra a 37 ° C en un baño de agua durante 30 minutos lugar el tubo en un bastidor de tubo de flotador y evitar la completa inmersión del tubo en el baño de agua para evitar posibles fugas.
4. Transferir la muestra y bastidor de tubo flotante para un baño de agua de 60 ° C durante 10 minutos, para inactivar la proteinasa K.

3. eliminación de pequeñas proteínas y péptidos por ultrafiltración de la centrífuga

1. Enjuagar un dispositivo de ultrafiltración que contiene 100 kDa peso molecular (MWCO) de corte filtro previo de PBS a usar. Para ello, Añadir 500 μl de PBS, usando una pipeta de 1000 μl del filtro. Gire el dispositivo a 3.700 x g por 5 min descartar cualquier restante retenido así como el efluente.
   Nota: La capacidad de volumen de muestra del dispositivo de ultrafiltración debe ser 0,5 mL - 4 mL para asegurar que el volumen de muestra reducido final de 50 μl es alcanzable.
2. Tomar la muestra del paso 2.4 y aumentar el volumen a 500 μl agregando PBS. Pipetear la muestra en el dispositivo de ultrafiltración previamente enjuagada.
   Nota: En promedio, el volumen de muestra en el paso 2.4 es 185 μl (120 a 150 μL de muestra y 50 μl de solución de proteinasa K).
3. Coloque el dispositivo de ultrafiltración en una centrífuga de ángulo fijo sobremesa a 3.700 x g a 4 ° C hasta que la muestra se reduce a un volumen de 50 μl.
   PRECAUCIÓN: Cuando se utilicen dispositivos de ultrafiltración con paro volumen, debe tenerse cuidado para evitar la completa sequedad de la membrana del filtro durante los pasos de centrifugación.
4. Añadir 500 μl de PBS directamente en el filtro de membrana y la pipeta hacia arriba y abajo 5 veces. Centrifugar como en el paso 3.3. Realizar este paso de lavado un total de 3 veces.
5. Transferir el retenido final de 50 μL en un nuevo tubo de microcentrífuga.
6. Enjuague el filtro de membrana con 200 μL de PBS pipeteo arriba y abajo 10 veces y transferir el lavado al tubo de paso 3.5.
7. Coloque el soporte del filtro en la posición inversa en un tubo nuevo. Ejecute una recuperación vuelta inversa por 5 min a 2.000 x g para recuperar la muestra restante de la membrana. Piscina la muestra con la muestra del paso 3.5.

4. purificación de vesículas por cromatografía por exclusión de tamaño (SEC)

1. Agregar 850 μl de la mezcla de la SEC, con los granos con MWCO de 700 kDa, en una columna de flujo de gravedad vacío, tapado con una pipeta de 1000 μl. Colocar las columnas en un tamaño apropiado rack equipado con bandeja de goteo.
2. Destape la parte inferior de la columna y dejar que el drenaje líquido durante 5 minutos. Una vez escurrido, añadir 10 mL de PBS para lavar la resina. Deje 20 minutos para el lavado drenar desde la columna.
3. La concentrada, proteinasa K tratados muestra de paso 3.5 en un tubo cónico de 15 mL y aumentar el volumen de muestra de 5 mL añadir PBS con una pipeta serológica. Mezclar el tubo suavemente, meciendo durante 1 minuto y luego lentamente la muestra a la columna preparada en el paso 4.2 con una pipeta serológica.
   Nota: Una vez que se quita la tapa de la columna, la muestra fluirá a través de la resina por gravedad; la muestra de 5 mL totalmente fluirá a través de la columna en 10 minutos.
4. Recoge el flujo a través de un nuevo tubo cónico de 15 mL.
5. Utilizando una pipeta serológica, aplique el material recogido a la resina para remover cualquier material restante por debajo de 700 kDa.
6. Recoge el flujo a través de un nuevo tubo cónico de 15 mL. Lavar la resina dos veces añadiendo 1 mL de PBS. Recoger el flujo a través del tubo de paso 4.5; el volumen final total será aproximadamente de 7 mL.
   Nota: Tras el paso 4.6, la muestra se diluirá aproximadamente 35 veces del volumen de muestra original; los pasos siguientes se reducen el volumen y concentrar la muestra purificada exosomas.

5. concentración de exosomas purificada y cuantificación de proteínas totales

1. Aclarar un dispositivo de ultrafiltración con filtro de 3 kDa MWCO con PBS antes como se describe en el paso 3.1.
2. Agregue la muestra de paso 4.6 en el dispositivo de ultrafiltración y centrífuga de un rotor del cubo que hace pivotar a 3.700 x g a 4 ° C. Almacenador intermediario pasará a través del filtro y se puede desechar. Exosomas concentrado serán retenido sobre el filtro. Centrifugue la muestra hasta que el volumen por encima del filtro (retenido) se reduce a 200 μl.
3. Transferir el retenido a un nuevo tubo de microcentrífuga.
4. Enjuague el filtro de membrana con 200 μL PBS mediante pipeteo sobre la membrana 10 veces y transferir el lavado al tubo de paso 5.3. Esto permitirá que para la recogida de cualquier muestra de exosomas residual.
5. Llevar el volumen hasta 500 μl de la muestra agregando PBS. Mezclar mediante pipeteo lentamente arriba y abajo 10 veces.
   Nota: El protocolo puede hacer una pausa aquí. Las muestras deben almacenarse a 4 ° C durante la noche o a-20 /-80 ° C para almacenamiento a largo plazo.
6. Cuantificar el contenido de proteína de la muestra de ensayo BCA, usando el protocolo del fabricante. Diluir la muestra 1:10 y 1:50 en PBS. Ejecute cada muestra por duplicado.
   Nota: A partir de 10 mg de proteína total del suero o plasma, la producción de proteína total en exosomas purificada de paso 5.6 es, en promedio, 150 μg. diluciones adicionales pueden ser necesarias si se utilizan muestras que no sean de suero o plasma; rendimiento puede variar con el tipo de muestra.

6. cuantificación y dimensionamiento de los exosomas por nanopartículas seguimiento análisis (NTA)

1. Añadir 5 μg de exosomas purificada (como cuantificado en 5.6) a 1 mL de PBS y agitar por 15 s en velocidad media-baja.
   1. Colocar la muestra en una jeringa desechable de 1 mL. Si está disponible, establezca la jeringa en una bomba de jeringa automática para inyectar la muestra de exosomas diluido a razón de 30 μL/min.
   2. Mida la NTA utilizando las opciones de captura de vídeo: pantalla de ganancia de nivel de 3-4 y cámara de 12-13.
   3. Definir la secuencia de comandos para análisis realizar tres repeticiones técnicas durante un mínimo de 30 s usando un flujo constante para cada repetición. Para el análisis, establecer el umbral de captura en 5.
      Nota: Detalles sobre el uso de la jeringa automática y configuración de captura de vídeo están disponibles en la referencia¹³. Configuración de captura y análisis NTA debe ser coherente a través de diferentes muestras para asegurar la comparabilidad.

7. determinación de la reducción de la proteína Soluble de

1. Añadir 1-10 μg de exosomas purificada a solución tampón de muestras de la SDS y realizar electroforesis de gel de poliacrilamida (PAGE) utilizando un Gel de Tris Bis 4-12% de 1 SDS x MES funcionamiento tampón durante 35 minutos a 200 V. transferencia resueltos proteínas a una membrana de nitrocelulosa 0.2 μm aplicando un voltaje o f 50 V de 1-1.5 h. realizar análisis de western blot para evaluar la presencia de albúmina, apolipoproteínas A y B y el marcador de exosomas CD 63 siguiendo metodologías estándar.
   Nota: Protocolos de los métodos en 7.1 se pueden encontrar en la referencia¹⁴; específicamente, SP007: de geles de poliacrilamida y SP011: Protocolo de Western blot.
2. Separar 10 μg de exosomas purificada usando la página como en el paso 7.1 y las bandas de proteínas usando colorante coomassie, recomendaciones estándar, para visualizar la variación de proteína y reducción entre muestras de la mancha.
   Nota: Más detalles sobre el protocolo específico de CD63 manchas blancas /negras occidentales son descritos por Díaz et al. ¹⁵

Resultados

Los datos presentados a continuación fueron obtenidos usando las muestras pareadas de suero y plasma de donantes de sangre sanos de cinco. Para determinar los efectos de cada paso de proceso, se realizaron cinco variaciones del protocolo presentado, y se compararon los exosomas no exosomas y recuperación extracción de proteína. Los métodos probados incluyen: 1) seg 700 kDa + ultrafiltración 3 kDa; 2) ultrafiltración 100 kDa; 3) proteinasa K + ultrafiltración 100 kDa; 4) SEC 700 kD...

Discusión

Un método optimizado para aumentar la pureza y rendimiento de exosomas de sangre aumentará la capacidad de mina con precisión las vesículas extracelulares como fuente de biomarcadores para varias enfermedades. Los métodos estándar actualmente utilizados para aislar exosomas, específicamente, ultracentrifugación y métodos de precipitación, tienen varias desventajas incluyendo agregación de exosomas y granulación de proteínas solubles^7,17, ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nanosight	Malvern	NS300
Benchtop microcentrifuge	Thermo	Legend Mico21
Benchtop centrifuge	Beckman Coulter	Allegra 6R
Waterbath	Benchmark	B2000-4
Microplate reader	BIOTEK	Epoch
Pierce BCA Protein Assay Kit	THERMO	23227
Micro BCA Protein Assay Kit	THERMO	23235
Phosphate buffered saline	Corning	21-040-CV
96 well plate	Corning	15705-066
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane	EMD-Millipore	UFC510096
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units	EMD-Millipore	UFC800324
Capto Core 700	GE Healthcare	17548103
Poly-Prep Chromatography Columns	BIORAD	7311550
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels	THERMO	NP0323BOX
Nitrocellulose Membrane, Roll, 0.2 µm	BIORAD	1620112
Proteinase K, Tritirachium album	EMD-Millipore	539480
SimplyBlue SafeStain	THERMO	LC6065
SIGMAFAST BCIP/NBT	Millipore-SIGMA	B5655
4-Chloro-1-naphthol	Millipore-SIGMA	C6788
Anti-CD63 Antibody (rabbit anti-human) with goat anti-rabbit HRP secondary antibody	SYSTEM BIOSCIENCES	EXOAB-CD63A-1	Primary and secondary antibodies
ALB Antibody (F-10)	SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.	sc-271605	Primary antibody
apoB Antibody (C1.4)	SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.	sc-13538	Primary antibody
apoA-I Antibody (B-10)	SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.	sc-376818	Primary antibody