단백질 소화, 한, 및 크기 배제 크로마토그래피 인간의 혈장 및 혈 청에서 Exosomes의 절연을 최적화 하

요약

여기, 선물이 exosomes 플라즈마와 비 exosomal 혈액 단백질의 감소 공동 정화와 혈 청에서 순화 하는 프로토콜. 최적화 된 프로토콜 적용, 효소 치료, 및 크기 배타 착 색 인쇄기를 포함 한다. Exosomes 혜택 다운스트림 분석, 소포 및 proteomic 특성의 더 정확한 정량화를 포함 하 여 향상 된 정화.

초록

Exosomes, nanovesicle, 모든 세포 유형에 서 발표의 형식 어떤 신체 유체에서 격리 될 수 있습니다. Exosomes, RNAs, 단백질 등의 내용에서 그들이 파생 되 고 질병의 지시자로 사용 될 수 있는 셀에 독특합니다. Ultracentrifugation를 포함 하 여 몇 가지 일반적인 농축 프로토콜 exosomes 수용 성 단백질 오염 물질와 라덴 항복. 특히, 우리는 발견 혈액 내에서 가장 풍부한 단백질 종종 공동 exosomes와 정화와 다운스트림 proteomic 연구, 혼동 수 있습니다 낮은 풍부한 바이오 마커 후보 식별을 방해. 추가적인 관심사의 비 exosomal 단백질 레벨의 일관성 없는 표현으로 인해 exosome 단백질 정량화의 irreproducibility가입니다. 여기서 설명 하는 프로토콜 공동 exosome 정화 과정을 엄 함 추가, exosomes 함께 정화 비 exosomal 단백질 제거 개발 되었다. 5 개의 메서드 쌍된 혈액 플라스마 및 5 기증자에서 혈 청을 사용 하 여 비교 되었다. 나노 분석 및 마이크로 bicinchoninic 산 성 단백질 분석 결과 추적을 사용 하 여 분석 결합된 프로토콜 적용 및 크기 배제 크로마토그래피를 이용 하 여 최적의 소포 농축 및 수용 성 단백질 제거 나왔고 밝혔다. 서 부 럽 확인 예상된 풍부한 혈액 단백질, 알 부 민 및 apolipoproteins를 포함 하 여 고갈 되었다 사용 되었다.

서문

Exosomes는 nanovesicles (30에서 크기에 이르기까지 150 nm nm)^1,2처리 셀을 통신을 용이 하 게 하는 인체에 거의 모든 세포에 의해 발표. 흥미롭게도, exosomes의 구성 원본 셀 뿐만 아니라 개별^3,,45의 건강 상태에 따라 변경합니다. 또한, exosomes에서에서 검색할 수 있습니다 여러 가지 생물 학적 체액과 같은: 타 액, 소변, 혈액². 이러한 기능 때문에 exosomes 질병 biomarkers의 좋은 원천이 될 여겨진다. 불행히도, exosomes의 격리에 대 한 표준 방법이입니다. 일부 실험실 exosome 격리에 대 한 표준 방법으로 밀도 그라디언트를 사용 하 여 100000 x g에서 최종 고속 단계 다단계 원심 분리를 고려 합니다. 그러나, 최근 연구는 ultracentrifugation exosomes 수용 성 단백질 및 exosome 무결성, 다운스트림 응용 프로그램^{6,7 방해 수 있습니다 둘 다에 영향을 미치는 이외에 다른 exosomes의 유도} . Exosome 고립의 다른 일반적인 방법 포함, 하지만 제한 되지 않는다: 상업적인 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG)에 의해 강 수 기반으로 시 약, 원심 외, 크기 배제 크로마토그래피 (SEC). 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG) 고분자를 사용 하 여 상업용 시 약 그들 침전 한 펠 릿을 형성 하 여 exosomes을 풍부. 이 폴리머를 사용 하 여 제한 잔여 말뚝 폴리머와 최종 제품에 수용 성 비 exosomal 단백질의 풍부한 오염 있습니다. 한 원심 하 정화 하 고 셀 룰 로스 막;를 사용 하 여 소포를 집중 활용 exosomes는 필터 위에 작은 불순물 및 다른 단백질 막^7,8을 통과 하는 동안 유지 됩니다. 다른 방법 처럼 원심 한 정화 exosomes의 비 exosomal 단백질, 단백질 복합물 및 집계를 포함 하 여 높은 수준의 보존 때문에 제한 된 용량을 하고있다. 마지막으로, 초 정화 분자 크기 별로 분리를 다공성 수 지를 사용 합니다. 초 오염 물질 단백질의 대부분을 캡처하고 중력 또는 저압 시스템⁷,^{를 기반으로 하는 고립 exosomal 무결성을 보존 하 여 다른 방법으로 경험이 문제의 대부분을 극복 하는 유망한 결과 보이고 있다 9}. 그러나, 초 동안 더 큰 단백질 집계 및 단백질¹⁰ 의 공동 격리 최종 exosome 준비의 순수성을 영향을 줍니다. 몇 가지 방법이 세포 문화 supernatants 및 플라즈마⁷, 또는 플라즈마^9,11exosome 정화에 대 한 테스트 되었습니다, 혈액을 직접 비교 하는 방법의 성능에 대 한 정보는 플라즈마와 같은 개인에서 혈 청

여기, 우리는 다양 한 소포 농축 기술 플라즈마와 세럼 사이 번역 확인 하려면 워크플로 비교 하 여 exosomes 혈액의 정화에 초점. 나노 분석 및 서쪽 오 점 추적 exosome 농도, 순도, 단백질 구성 최종 제품에서의 차이 척도를 사용 했다. 마지막 방법은,이 프로토콜에 대 한 자세한 소포 번호를 증가 하 고 비 exosomal 단백질 수준을 감소 시킨다. 중요 한 것은, 일반적인 공동 계기 단백질 알 부 민 및 apolipoproteins 등의 급격 한 감소는 보여 줍니다. 피 고는 그들은 공동 정화 exosomes와 다운스트림 분석 기울이기 "순화" 샘플 간의 원인 불일치 하는 주파수에이 두 가지 단백질의 높은 풍부. 이 프로토콜은 상업적으로 사용할 수 있는 초 수 지;의 사용을 포함 수 지는 다공성 구슬 단백질 700 kDa 보다 작은 구슬을 입력할 수 있습니다 구성 된다. 한 번 안쪽으로, 단백질 octylamine 리간드에 의해 유지 됩니다. Exosomes와 700 kDa¹²보다 큰 분자는 eluate 구성 됩니다. 또한, 단백질 집계 및 구슬 트랩을 피하기 위해 apolipoproteins을 줄이기 위해 우리는 워크플로의 효소 소화 단계는. 현재, 공동 정화 비 exosomal 단백질을 줄이면서 exosome 수익률을 극대화 할 수 없는 하나의 기술이입니다. 이 연구는 여러 복구 및 정화 방법 효소 소화 전처리를 결합 하는 정화 프로토콜 exosome 수율 및 순도 혈액 혈 청 및 혈장에서 증가 사용할 수 있습니다 보여줍니다.

프로토콜

이 작품을 결정 했다 하지 인간의 주제 연구 초기 검토에서 콜로라도 주립 대학의 기관 검토 위원회 (IRB), 모든 인간의 샘플 Bioreclamation IVT biorepository에서 취소 확인 된 견본으로 가져온 고 했다 IRB 승인 프로토콜에서 수집.

1. 산 큰 소포 및 세포질 파편에 의해 원유 샘플 (플라스마 또는 혈 청)의 준비

참고: 안전 고려 사항: 플라스마, 혈 청, 그리고 다른 생물 학적 체액 유해 재료 이며 장갑 및 실험실 외 투를 포함 하 여 기본적인 개인 보호 장비를 착용 하는 동안 특별 한 관리와 처리 해야 합니다. 생물 학적 샘플 biosafety 내각;에서 처리 되는 것이 좋습니다. 그렇지 않다면, 눈 보호를 사용 하 여 것이 좋습니다.

1. 4 ° C 냉장고에 하룻밤 떨고 비 조건에서 튜브를 배치 하 여 혈 청 또는 혈장 샘플을 equilibrate (중-20에서 또는-80 ° C).
2. Aliquot 250 µ L 1000 µ L 피 펫을 사용 하 여 microcentrifuge 튜브에 샘플의.
3. 4 ° c.에 30 분 18000 x g에서 샘플을 원심
4. 200 µ L 피 펫을 사용 하 여, 허가 상쾌한의 200 µ L을 제거 하 고 새로운 microcentrifuge 튜브에 추가. 상쾌한 전송 하는 동안 수송과 자료를 하지 마십시오. 수송과 자료를 삭제 합니다.
5. Bicinchoninic 산 (BCA) 분석 결과, 제조 업체의 프로토콜을 사용 하 여 샘플의 단백질 함량을 계량. 분석 결과 수행 하려면 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 1의 1:50 샘플을 희석. 중복에서 각 샘플을 테스트 합니다.
   참고: 프로토콜에 걸쳐 1 x PBS를 사용 하 여 달리 명시 하지 않는 한. 평균적으로, 명백 하 게 혈 청 또는 플라스마 (18000 x g) 후의 200 µ L 총 단백질의 15 mg을 얻을 것입니다. 낮은 또는 높은 단백질 콘텐츠, 다른 샘플 형식 추가 BCA 희석 해야 합니다.
6. 새로운 microcentrifuge 관으로 샘플의 aliquot 10 밀리 그램. 1.5 단계에서 얻은 농도 사용 하 여 계산 하는 샘플의 해당 볼륨. 약 200 µ L 피 펫을 사용 하 여 샘플 수입니다.
   참고: -80 ° c.에 나머지 샘플을 저장 하는 것이 좋습니다. Aliquot 샘플을 피하기 위해 여러 동결-해 동 주기 미래에 튜브 당 10 마그네슘에 다른 튜브에 사용 합니다.

2. 비 exosomal 혈액 단백질의 소화

참고: 소화 단계는 exosomes와 공동 정화 수 있는 비 exosomal 단백질을 줄이기 위해 설계 되었습니다. 보존 exosome 표면 단백질의 다운스트림 분석에 필요한 경우이 단계는이 분석을 방해 하는 고려 사항으로 취해야 한다. Exosomal CD63, 표면 노출 tetraspanin 단백질의 검출은이 과정에 의해 크게 부정적인 영향을 하지.

1. PBS에서 500 µ g/mL의 농도에서 가수분해 K 솔루션을 준비 합니다. 원뿔 튜브에 가수분해 K의 해당 금액을 추가 합니다. 그런 다음 버퍼와 30에 대 한 소용돌이 추가 s, 실 온에서 3 배.
2. Aliquot 10 mg 샘플을 가수분해 K 솔루션의 50 µ L을 추가 하 고 200 µ L 피 펫을 사용 하 여 위아래로 pipetting으로 부드럽게 혼합.
3. 플 로트 튜브 랙에서 튜브 30 분 장소에 대 한 물 목욕에서 37 ° C에서 샘플을 품 어 하 고 잠재적인 누설을 피하기 위해 물 목욕에서 튜브의 완전 한 침수를 방지.
4. 가수분해 K. 비활성화를 샘플 및 부동 튜브 랙 10 분 동안 60 ° C 물 목욕을 전송

3. 작은 단백질 및 펩 티 드 원심 분리기 외에 의해의 제거

1. 린스 사용 하기 전에 PBS와 100 kDa 분자량 컷오프 (MWCO) 필터를 포함 한 장치. PBS의 500 µ L 1000 µ L 피 펫을 사용 하 여 필터를 추가 하 여 이렇게 합니다. eluate 뿐만 아니라 모든 나머지 retentate 5 분 삭제에 대 한 3700 x g에 장치를 회전 합니다.
   참고: 한 장치 샘플 볼륨 용량 0.5 mL-4 mL 50 µ L의 최종 감소 샘플 볼륨 달성 되도록 해야 합니다.
2. 2.4 단계에서 샘플 하 고 PBS를 추가 하 여 500 µ L 볼륨을 증가. 미리 씻어 서 한 장치에 샘플을 플라스틱.
   참고: 평균, 샘플 볼륨 단계 2.4에서에서 185 µ L (120 ~ 150 µ L의 샘플 및 가수분해 K 솔루션의 50 µ L)입니다.
3. 샘플은 50 µ L의 볼륨을 줄일 때까지 4 ° C에서 3700 x g에서 고정 각도 벤치탑 원심 분리기에서 한 장치를 놓습니다.
   주의: 죽은 중지 한 장치를 사용할 때 볼륨을 주의 해야 합니다 원심 분리 단계 필터 멤브레인의 완전 한 건조를 피하기 위해.
4. 직접 필터 막 5 번 위아래로 피 펫에 PBS의 500 µ L를 추가 합니다. 3.3 단계에서 원심. 이 세척 단계 총 3 번을 수행 합니다.
5. 새로운 microcentrifuge 튜브에 최종 50 µ L retentate를 전송 합니다.
6. 200 µ L PBS, 10 번, 위아래로 pipetting으로 필터 막 헹 구 고 단계 3.5에서에서 튜브를 세척을 전송.
7. 새로운 튜브에서 역 위치에 필터 홀더를 배치 합니다. 2000 x g 막에서 나머지 샘플을 검색에 5 분에 대 한 역방향 회전 복구를 실행 합니다. 수영장 단계 3.5에서에서 샘플 샘플.

4. 소포 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 정화

1. 구슬 1000 µ L 피 펫을 사용 하 여 빈, 출장 중력 흐름 열에 700 kDa의 MWCO 데 초 슬러리의 850 µ L를 추가 합니다. 적절 한 랙 똑 트레이 장착 크기에 열을 배치 합니다.
2. 칼럼의 하단을 벗기다 하 고 5 분 동안 액체 드레인. 일단 물기, 수 지를 세척 하는 PBS의 10 mL를 추가 합니다. 허용 열에서 세척에 대 일 분.
3. 집중 배치, 가수분해 K 15 mL 원뿔 튜브에 3.5 단계에서 샘플을 처리 하 고 5 ml 혈 청 학적인 피 펫으로 PBS를 추가 샘플 볼륨을 증가. 1 분 동안 흔들어 하 여 튜브를 부드럽게 혼합 하 고 천천히 단계 4.2 혈 청 학적인 피 펫에서에서 준비 하는 열에 샘플을 적용.
   참고: 열의 모자가 제거 되 면 샘플은 통과 수 지 중력; 5 mL 샘플 10 분에 열을 통해 완전히 흐름 것입니다.
4. 새로운 15 mL 원뿔 튜브에서를 통해 흐름을 수집 합니다.
5. 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여, 수집 된 자료 700 kDa 아래 남아 있는 자료를 제거 하려면 다시 수 지 적용 됩니다.
6. 새로운 15 mL 원뿔 튜브에서를 통해 흐름을 수집 합니다. PBS의 1 mL를 두 번 추가 하는 수 지를 세척. 4.5; 단계에서 튜브를 통해 흐름을 수집 총 마지막 볼륨 7 mL 대략 있을 것입니다.
   참고: 4.6 단계, 후 샘플 것입니다 희석 약 35 번에서 원래 샘플 볼륨; 다음 단계는 볼륨 하 정화 exosome 샘플을 집중 하십시오.

5. 정화 Exosomes와 부 총 단백질 량의 농도

1. 3.1 단계에서 설명한 대로 3 kDa MWCO 필터 적용 장치 사용, PBS 전에 린스 합니다.
2. 한 장치 및 4 ° c.에 3700 x g에서 진동 물통 회전자에 원심 분리기 샘플 단계 4.6에서 추가 버퍼는 필터를 통과 하 고 삭제 될 수 있습니다. 집중된 exosomes 필터 위에 유지 됩니다. 샘플을 원심 필터 (retentate) 위에 볼륨 200 µ L로 감소 될 때까지.
3. 새로운 microcentrifuge 튜브에는 retentate를 전송.
4. 10 번 막에 pipetting으로 200 µ L PBS 가진 필터 멤브레인을 헹 구 고 단계 5.3에서에서 튜브를 세척을 전송. 이것은 어떤 잔여 exosome 샘플의 컬렉션에 대 한 허용.
5. PBS를 추가 하 여 500 µ L 최대 샘플 볼륨을 가져와. 10 번 위아래로 천천히 pipetting으로 혼합.
   참고: 프로토콜 여기 일시 중지 될 수 있습니다. 샘플 4 ° C 하룻밤 사이에 또는 긴 기간 저장을 위해-20/80 ° C에서 저장 되어야 한다.
6. BCA 분석 결과, 제조 업체의 프로토콜을 사용 하 여 샘플의 단백질 함량을 계량. 예제 1시 10분과 1:50 PBS에 희석. 중복에서 각 샘플을 실행 합니다.
   참고: 혈 청 또는 플라스마의 총 단백질의 10mg에서 시작 해 서, 단계 5.6에서에서 순화 exosomes에 총 단백질 수확량은, 평균, 150 µ g. 추가 희석 해야 경우 혈 청 또는 혈장 샘플 사용 됩니다; yield 샘플 유형으로 달라질 수 있습니다.

6. 정량화 및 나노 분석 (NTA)를 추적 하 여 Exosomes의 크기 조정

1. 추가 정화 exosomes의 5 µ g (5.6에서 계량) 1 mL의 PBS와 15에 대 한 소용돌이를 낮은 중간 속도에 s.
   1. 1 mL 일회용 주사기에 샘플을 놓습니다. 가능한 경우, 희석된 exosome 샘플 30 µ L/min의 속도로 주입을 설정 하는 자동 주사기 펌프에 주사기를 설정 합니다.
   2. NTA 측정 비디오 캡처 설정을 사용 하 여 수행: 12-13의 3-4 및 카메라 레벨의 이득 화면.
   3. 30의 최소 3 기술 복제를 실행 하려면 분석 스크립트 정의 지속적인 흐름을 사용 하 여 모든 복제에 대 한 s. 분석을 위해 5에서 캡처 임계값을 설정 합니다.
      참고: 비디오 캡처에 대 한 설정과 자동 주사기의 사용에 관한 세부 기준¹³사용할 수 있습니다. 주권에 대 한 캡처 및 분석 설정을 comparability을 보장 하기 위해 다른 샘플에서 일치 해야 합니다.

7입니다. 수용 성 단백질 감소의 결정

1. SDS 샘플 버퍼에 순화 exosomes의 1-10 µ g을 추가 하 고 수행 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (페이지) 4-12% 두번째-트리 스 젤을 사용 하 여 1 x MES SDS 200에서 35 분에 대 한 버퍼를 실행에 V. 전송 전압 o를 적용 하 여 니트로 0.2 µ m 막 단백질을 해결 f 50 V 1-1.5 헤 알 부 민, apolipoproteins A 및 B, exosome 마커 CD 63의 존재를 평가 하기 위해 수행 서쪽 오 점 분석을 위한 표준 방법론에 따라.
   참고: 7.1에서 메서드에 대 한 전체 프로토콜 참조¹⁴;에서 찾을 수 있습니다. 특히, SP007: polyacrylamide 젤 및 SP011의 실행: 서쪽 오 점 프로토콜.
2. 7.1 단계 에서처럼 페이지를 사용 하 여 순화 exosomes의 10 µ g 하 고 얼룩 단백질 밴드 coomassie 염료를 사용 하 여 단백질 변형 및 샘플 간의 감소를 시각화 하기 위해 다음과 같은 표준 권장 합니다.
   참고: 서쪽 오 점 CD63에 대 한 프로토콜에 대 한 자세한 내용은 디아즈 외에 의해 설명 되어 있습니다. ¹⁵

결과

아래 데이터는 5 명의 건강 한 혈액 기증자 로부터 쌍된 플라스마와 혈 청 샘플을 사용 하 여 얻은 했다. 그리고 각 처리 단계에의 효과 확인 하려면 제시 프로토콜의 5 개의 변형 수행 했다, exosome 복구 및 비 exosome 단백질 제거 비교 했다. 포함 된 메서드 trialed: 1) SEC 700 kDa + 외 3 kDa; 2) 한 100 kDa; 3) 가수분해 K + 외 100 kDa; 4) 초 700 kDa + 외 100 kDa, 및 5) 성분을 K + 외 100 kDa + 초 700 ...

토론

순도 및 혈액에서 exosomes의 수확량을 증가 하는 최적화 된 방법 정확 하 게 여러 가지 질병에 대 한 생체의 원천으로 extracellular 소포 내 능력을 증가할 것 이다. 표준 방법 현재 exosomes, 특히, 분리 하는 데 사용 ultracentrifugation과 강 수 방법, exosome 집계 및 수용 성 단백질^{7,,17판 몇 가지 단점이 있다 18}. 또는, SEC의 사용 exosome 격리,...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nanosight	Malvern	NS300
Benchtop microcentrifuge	Thermo	Legend Mico21
Benchtop centrifuge	Beckman Coulter	Allegra 6R
Waterbath	Benchmark	B2000-4
Microplate reader	BIOTEK	Epoch
Pierce BCA Protein Assay Kit	THERMO	23227
Micro BCA Protein Assay Kit	THERMO	23235
Phosphate buffered saline	Corning	21-040-CV
96 well plate	Corning	15705-066
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane	EMD-Millipore	UFC510096
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units	EMD-Millipore	UFC800324
Capto Core 700	GE Healthcare	17548103
Poly-Prep Chromatography Columns	BIORAD	7311550
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels	THERMO	NP0323BOX
Nitrocellulose Membrane, Roll, 0.2 µm	BIORAD	1620112
Proteinase K, Tritirachium album	EMD-Millipore	539480
SimplyBlue SafeStain	THERMO	LC6065
SIGMAFAST BCIP/NBT	Millipore-SIGMA	B5655
4-Chloro-1-naphthol	Millipore-SIGMA	C6788
Anti-CD63 Antibody (rabbit anti-human) with goat anti-rabbit HRP secondary antibody	SYSTEM BIOSCIENCES	EXOAB-CD63A-1	Primary and secondary antibodies
ALB Antibody (F-10)	SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.	sc-271605	Primary antibody
apoB Antibody (C1.4)	SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.	sc-13538	Primary antibody
apoA-I Antibody (B-10)	SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.	sc-376818	Primary antibody