Digestão de proteínas, ultrafiltração e cromatografia de exclusão para otimizar o isolamento do Exosomes do Plasma de sangue humano e soro

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para purificar exosomes do plasma e soro com reduzida co purificação de proteínas do sangue não-exosomal. O protocolo otimizado inclui ultrafiltração, tratamento com proteases e cromatografia de exclusão. Reforçada purificação de exosomes análises benefícios a jusante, incluindo a quantificação mais precisa de vesículas e caracterização proteômica.

Resumo

Exosomes, um tipo de nanovesicle liberado de todos os tipos de células, pode ser isolado de qualquer fluido corporal. O conteúdo de exosomes, incluindo proteínas e RNAs, é exclusivo para as células do qual eles são derivados e podem ser usados como indicadores de doença. Vários protocolos comuns de enriquecimento, incluindo ultracentrifugação, rendem exosomes carregado com contaminantes de proteína solúvel. Especificamente, nós encontramos que as proteínas mais abundantes no sangue muitas vezes co purificam com exosomes e podem confundir a jusante proteomic estudos, frustrar a identificação dos candidatos de biomarcador de baixa abundância. De preocupação adicional é a reprodutibilidade de quantificação de proteína exossomo devido inconsistente representação dos níveis de proteína não-exosomal. O protocolo detalhado aqui foi desenvolvido para remover as proteínas não-exosomal que purificam co juntamente com exosomes, adicionando o rigor do processo de purificação do exossomo. Cinco métodos foram comparados usando emparelhado plasma de sangue e soro de cinco doadores. Usando nanopartículas, acompanhamento, análise e ensaio de ácido da proteína de bicinchoninic micro a análise revelou que um protocolo combinado utilizando cromatografia de exclusão de ultrafiltração e tamanho rendeu o enriquecimento de vesículas ideal e remoção de proteína solúvel. Mancha ocidental foi utilizado para verificar que as proteínas do sangue abundante esperado, incluindo albumina e apolipoproteínas, foram esgotadas.

Introdução

Exosomes são nanovesicles (variando em tamanho de 30 nm a 150 nm) lançado por quase todas as células no corpo humano facilitar a comunicação célula a célula processa^1,2. Curiosamente, a composição do exosomes muda dependendo das células de origem, bem como o estado de saúde do indivíduo^3,4,5. Além disso, exosomes pode ser obtido em vários fluidos biológicos tais como: saliva, urina e de sangue². Devido estas características, exosomes são considerados para ser uma boa fonte de biomarcadores da doença. Infelizmente, não há nenhum método padrão para a isolação de exosomes. Alguns laboratórios consideram centrifugação várias etapas, com uma etapa final de alta velocidade a 100.000 x g usando gradientes de densidade, como o método padrão-ouro para exossomo isolamento. No entanto, estudos recentes têm mostrado que ultracentrifugação induz agregação de exosomes com proteínas solúveis e outras exosomes, além de afetar a integridade do exossomo, ambos os quais podem dificultar a aplicações a jusante^6,7 . Outros métodos comuns de isolamento do exossomo incluem, mas não estão limitados a: precipitação por comercial polietileno glicol (PEG) com base em reagentes, ultrafiltração centrífuga e cromatografia de exclusão-tamanho (SEC). Os reagentes comerciais usando polímeros de polietileno glicol (PEG) enriquecem exosomes, causando-lhes para precipitar e formar um pellet. Limitações de utilização deste polímero são contaminação residual polímero PEG e uma abundância de proteínas solúveis não-exosomal no produto final. Ultrafiltração utiliza centrifugação para purificar e concentrar-se vesículas usando uma membrana de celulose; exosomes são mantidos acima do filtro, enquanto as impurezas menores e outras proteínas atravessam a membrana^7,8. Assim como outros métodos, ultrafiltração centrífuga tem uma capacidade limitada para purificar exosomes devido a manutenção de altos níveis de proteínas não-exosomal, incluindo agregados e complexos da proteína. Finalmente, purificação SEC usa resina porosa para separar moléculas por tamanho. SEC tem mostrado resultados promissores, superando a maioria dos problemas experientes com outros métodos, capturando a maioria das proteínas contaminantes e preservando a integridade exosomal, desde que o isolamento é baseado na gravidade ou sistemas de baixa pressão^{7, 9}. No entanto, o isolamento co de proteínas maiores agregados e lipoproteínas¹⁰ durante o SEC afeta a pureza da preparação final exossomo. Enquanto alguns métodos foram testados para a purificação do exossomo de sobrenadantes de cultura de células e plasma⁷ou apenas plasma^9,11, não há nenhuma informação sobre o desempenho dos métodos diretamente comparando o sangue plasma e soro do mesmo indivíduo.

Aqui, focalizamos a purificação do sangue exosomes, comparando uma variedade de fluxos de trabalho para determinar se as técnicas de enriquecimento de vesículas são traduzíveis entre plasma e soro. Nanopartículas, acompanhamento, análise e borrão ocidental foram usadas para quantificar as diferenças na composição de concentração, a pureza e a proteína exossomo em produtos finais. O método final, detalhado no presente protocolo, aumenta o número de vesículas e reduz os níveis de proteína não-exosomal. Importante, uma redução drástica das proteínas co precipitantes comuns, incluindo albumina e apolipoproteínas é demonstrada. A abundância destas duas proteínas no sangue e a frequência em que eles co purificam com exosomes causas inconsistências entre as amostras "purificadas", desviando as análises a jusante. Este protocolo inclui o uso de uma resina SEC comercialmente disponível; a resina é composta de grânulos porosos em que proteínas menores que 700 kDa podem inserir os grânulos. Uma vez dentro, as proteínas são retidas por um ligante de octylamine. O eluato é composto de exosomes e moléculas maiores que 700 kDa¹². Além disso, a fim de reduzir a proteína agregados e apolipoproteínas que evade armadilhas do grânulo, incluímos um protease digestão passo do fluxo de trabalho. Atualmente, não existe única técnica capaz de maximizar o rendimento do exossomo reduzindo co purificação proteínas não-exosomal. Este estudo mostra que um protocolo de purificação que combina um pré-tratamento de digestão de protease com vários métodos de purificação e recuperação pode ser usado para aumentar o rendimento do exossomo e pureza de sangue soro e plasma.

Protocolo

Este trabalho foi determinado a não ser sujeito humano pesquisa sobre revisão inicial da Colorado State University institucional Review Board (IRB), como todas as amostras humanas foram obtidas como amostras de identificados da biorepositórios Bioreclamation IVT e foram recolhidos no âmbito de protocolos IRB aprovado.

1. preparação da amostra bruta (Plasma ou soro) por vesículas maior granulação e restos celulares

Nota: Consideração de segurança: plasma, soro e outros fluidos biológicos são materiais de risco biológico e devem ser manuseados com cuidado especial, enquanto usava o equipamento de protecção pessoal básico, incluindo luvas e jaleco. É altamente recomendável que as amostras biológicas são processadas em uma biossegurança do armário; Se não disponível, o uso de óculos de proteção é recomendado.

1. Equilibrar um soro ou uma amostra de plasma, colocando o tubo sob condições não-tremendo em um frigorífico de 4 ° C durante a noite (de qualquer -20 ou armazenamento-80 ° C).
2. Alíquota de 250 µ l da amostra em um tubo de microcentrifugadora usando uma pipeta de 1.000 µ l.
3. Centrifugar a amostra a 18.000 x g durante 30 min a 4 ° C.
4. Utilizando uma pipeta de 200 µ l, remover 200 µ l do sobrenadante apurado e adicioná-lo para um novo tubo de microcentrifugadora. Evite qualquer material granulado ao transferir o sobrenadante. Descarte o material granulado.
5. Quantificar o teor de proteína da amostra por ensaio de bicinchoninic ácido (BCA), usando o protocolo do fabricante. Para realizar o ensaio, dilua a amostra 01:50 em 1 x tampão fosfato salino (PBS). Teste cada amostra em duplicado.
   Nota: Use 1X PBS em todo o protocolo, salvo indicação em contrário. Em média, 200 µ l de esclareceu soro ou plasma (depois de 18.000 x g) irá produzir 15 mg de proteína total. Outros tipos de amostra, com teor de proteínas inferior ou superior, podem exigir diluições adicionais do BCA.
6. Alíquota 10 mg da amostra em um tubo de microcentrifugadora novo. Use a concentração obtida na etapa 1.5 para calcular o volume correspondente da amostra. Alíquota da amostra com uma pipeta de 200 µ l.
   Nota: Recomenda-se armazenar a amostra restante a-80 ° C. Alíquota da amostra em diferentes tubos de 10 mg por tubo para evitar o congelamento-descongelamento múltiplos ciclos no futuro usar.

2. digestão de proteínas do sangue não-exosomal

Nota: A etapa de digestão é projetada para reduzir as proteínas não-exosomal que co podem purificar com exosomes. Se a preservação das proteínas de superfície exossomo é necessária para as análises a jusante, isso deve ser levado em consideração que essa etapa tem o potencial de interferir com esta análise. A detecção do exosomal CD63, uma proteína de superfície exposta tetraspaninas, não foi significativamente negativamente impactada por este processo.

1. Prepare a solução de proteinase K em uma concentração de 500 µ g/mL de PBS. Adicione a quantidade correspondente de proteinase K em um tubo cônico. Em seguida, adicione o buffer e o vórtice por 30 s, 3x à temperatura ambiente.
2. Adicionar 50 µ l de solução de proteinase K, à alíquota de amostra de 10 mg e misture suavemente pipetando acima e para baixo usando uma pipeta de 200 µ l.
3. Incubar a amostra a 37 ° C em banho-maria por 30 min. lugar o tubo em uma cremalheira do tubo do flutuador e evitar a imersão completa do tubo no banho para evitar possíveis fugas.
4. Transferir a amostra e suporte flutuante para um banho de água 60 ° C durante 10 min, para inactivar a proteinase K.

3. remoção de pequenas proteínas e peptídeos por ultrafiltração centrífuga

1. Enxágue com um dispositivo de ultrafiltração contendo 100 kDa filtro de corte (MWCO) de peso molecular com prévio de PBS para usar. Faça isso adicionando-se 500 µ l de PBS para o filtro, usando uma pipeta de 1.000 µ l. Gire o dispositivo a 3.700 x g por 5 min. Descarte qualquer retentate restante, bem como o eluato.
   Nota: A capacidade de volume de amostra do dispositivo ultrafiltração deve ser 0,5 mL - 4 mL para assegurar que o volume final de amostra reduzida de 50 µ l é alcançável.
2. Tomar a amostra do passo 2.4 e aumentar o volume de 500 µ l, adicionando PBS. Pipete a amostra para o dispositivo de ultrafiltração previamente enxaguado.
   Nota: Em média, o volume de amostra da etapa 2.4 é 185 µ l (120 a 150 µ l de amostra e 50 µ l de solução de proteinase K).
3. Coloque o dispositivo de ultrafiltração em uma centrífuga de bancada de ângulo fixo a 3.700 x g a 4 ° C até que a amostra tem reduzir a um volume de 50 µ l.
   Atenção: Quando utilizar dispositivos de ultrafiltração com capim pela raiz volume, deve ter cuidado para evitar a secura completa da membrana filtro durante as etapas de centrifugação.
4. Adicione 500 µ l de PBS directamente para o filtro de membrana e a pipeta e descer 5 vezes. Centrifugue a etapa 3.3. Execute esta etapa de lavagem, um total de 3 vezes.
5. Transferi o retentate final 50 µ l em um tubo de microcentrifugadora novo.
6. Lavar o filtro de membrana com 200 µ l de PBS, pipetagem acima e para baixo 10 vezes e transferir a lavagem ao tubo de passo 3.5.
7. Coloque o suporte do filtro na posição inversa em um tubo novo. Execute uma recuperação de rotação inversa por 5 min a x 2.000 g para recuperar a amostra restante da membrana. A amostra com a amostra da etapa 3.5 de piscina.

4. purificação das vesículas por cromatografia de exclusão (SEC)

1. Adicione 850 µ l de chorume SEC, com grânulos tendo um MWCO de 700 kDa, em uma coluna de fluxo de gravidade vazio, tampado com uma pipeta de 1.000 µ l. Coloque as colunas em um tamanho apropriada cremalheira equipada com uma bandeja de gotejamento.
2. Destampe a parte inferior da coluna e deixar que o líquido Escorra por 5 min. Uma vez drenado, adicione 10 mL de PBS para lavar a resina. Permitir que 20 min. para a lavagem escorrer da coluna.
3. Coloque o concentrado, proteinase K tratada amostra da etapa 3.5 em um tubo cônico de 15 mL e aumentar o volume da amostra de 5 mL, adicionando PBS com uma pipeta sorológica. Misture o tubo delicadamente agite-o por 1 min e em seguida, aplicar lentamente a amostra para a coluna preparada na etapa 4.2 com uma pipeta sorológica.
   Nota: Depois de remover a tampa da coluna, a amostra fluirá através da resina por gravidade; a amostra de 5 mL completamente fluirá através da coluna em 10 min.
4. Colete o fluxo através de um novo tubo cônico de 15 mL.
5. Usando uma pipeta sorológica, aplica o material coletado para a resina novamente para remover qualquer material restante abaixo de 700 kDa.
6. Colete o fluxo através de um novo tubo cônico de 15 mL. Lave a resina duas vezes, adicionando 1 mL de PBS. Coletar o fluxo através do tubo da etapa 4.5; o volume total final será de aproximadamente 7 mL.
   Nota: Após a etapa 4.6, a amostra será diluída cerca de 35 vezes do volume da amostra original; as etapas a seguir irão reduzir o volume e concentrar a amostra exossomo purificado.

5. concentração de Exosomes purificado e quantificação de proteínas totais

1. Lave um dispositivo de ultrafiltração com um filtro MWCO 3 kDa com antes da PBS utilização, conforme descrito na etapa 3.1.
2. Adicionar a amostra da etapa 4.6 para o dispositivo de ultrafiltração e centrífuga em um rotor de balde balançando a 3.700 x g a 4 ° C. Buffer passará através do filtro e pode ser descartada. Exosomes concentrado será retida acima do filtro. Centrifugar a amostra até o volume acima do filtro (retentate) é reduzido a 200 µ l.
3. Transferi o retentate para um novo tubo de microcentrifugadora.
4. Lave o filtro de membrana com 200 µ l de PBS pipetando sobre a membrana 10 vezes e a lavagem de transferência ao tubo da etapa 5.3. Isto permitirá a coleção de qualquer amostra exossomo residual.
5. Traga o volume até 500 µ l de amostra adicionando PBS. Misture lentamente pipetando acima e para baixo 10 vezes.
   Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. As amostras devem ser armazenadas a 4 ° C durante a noite ou a-20-80 ° C para armazenamento a longo prazo.
6. Quantificar o teor de proteína da amostra por meio de ensaio BCA, usando o protocolo do fabricante. Dilua a amostra 01:10 e 01:50 em PBS. Execute cada amostra em duplicado.
   Nota: Começando com 10 mg de proteína total do soro ou plasma, o rendimento de proteína total em exosomes purificado da etapa 5.6 é, em média, 150 µ g. diluições adicionais podem ser necessárias se amostras diferente de soro ou plasma são usadas; rendimento pode variar com o tipo de amostra.

6. quantificação e dimensionamento de Exosomes por nanopartículas acompanhamento análise (NTA)

1. Adicionar 5 µ g de exosomes purificado (conforme quantificada em 5.6) a 1 mL de PBS e vórtice por 15 s na baixa e média velocidade.
   1. Coloca a amostra em uma seringa descartável 1 mL. Se disponível, defina a seringa em uma bomba de seringa automática definida para injetar a amostra diluída exossomo a uma taxa de 30 µ l/min.
   2. Realizar medições de NTA usando as configurações de captura de vídeo: tela com ganho de nível 3-4 e câmera de 12-13.
   3. Definir o roteiro de análise executar três repetições técnicas por um período mínimo de 30 s usando um fluxo constante para cada replicar. Para a análise, defina o limite de captura em 5.
      Nota: Detalhes sobre a utilização da seringa automática e configurações de captura de vídeo estão disponíveis na referência¹³. Configurações de captura e análise de NTA devem ser consistentes através de diferentes amostras, para assegurar a comparabilidade.

7. determinação da redução de proteína solúvel

1. Adicionar 1-10 µ g de exosomes purificado de tampão de amostra SDS e executar eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) usando um Gel de Bis-Tris 4-12% em 1 x MES SDS, executando o buffer para 35 min a 200 V. transferência resolveu proteínas para uma membrana de nitrocelulose 0,2 µm, aplicando uma tensão o f 50 V para 1-1.5 h realizar análise ocidental do borrão para avaliar a presença de albumina, apolipoproteínas A e B e o marcador de exossomo CD 63 seguindo metodologias padrão.
   Nota: Protocolos completo para os métodos em 7.1 podem ser encontrados na referência¹⁴; especificamente, SP007: execução de géis de poliacrilamida e SP011: protocolo de Western blot.
2. Separar 10 µ g de exosomes purificada usando a página como no passo 7.1 e mancha as bandas de proteínas usando corante coomassie, seguir as recomendações padrão, para visualizar a variação de proteína e redução entre amostras.
   Nota: Para mais informações sobre o protocolo para borrões ocidentais específicos para CD63 são descritas por Diaz et al. ¹⁵

Resultados

Os dados apresentados abaixo foram obtidos utilizando amostras de plasma e soro pareadas de cinco doadores de sangue saudáveis. Para determinar os efeitos de cada etapa de processamento, foram realizadas cinco variações do protocolo apresentado, e remoção de proteínas de recuperação e não-exossomo exossomo foram comparados. Os métodos julgados incluídos: 1) SEC 700 kDa + ultrafiltração 3 kDa; 2) ultrafiltração 100 kDa; 3) proteinase K + ultrafiltração 100 kDa; 4) SEC 700 ...

Discussão

Um método otimizado para aumentar a pureza e o rendimento de exosomes de sangue irá aumentar a capacidade de precisão meu vesículas extracelulares como fonte de biomarcadores para várias doenças. O padrão métodos atualmente usados para isolar exosomes, especificamente, ultracentrifugação e métodos de precipitação, tem várias desvantagens incluindo exossomo agregação e granulação de proteínas solúveis^{7,17, 18}...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nanosight	Malvern	NS300
Benchtop microcentrifuge	Thermo	Legend Mico21
Benchtop centrifuge	Beckman Coulter	Allegra 6R
Waterbath	Benchmark	B2000-4
Microplate reader	BIOTEK	Epoch
Pierce BCA Protein Assay Kit	THERMO	23227
Micro BCA Protein Assay Kit	THERMO	23235
Phosphate buffered saline	Corning	21-040-CV
96 well plate	Corning	15705-066
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane	EMD-Millipore	UFC510096
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units	EMD-Millipore	UFC800324
Capto Core 700	GE Healthcare	17548103
Poly-Prep Chromatography Columns	BIORAD	7311550
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels	THERMO	NP0323BOX
Nitrocellulose Membrane, Roll, 0.2 µm	BIORAD	1620112
Proteinase K, Tritirachium album	EMD-Millipore	539480
SimplyBlue SafeStain	THERMO	LC6065
SIGMAFAST BCIP/NBT	Millipore-SIGMA	B5655
4-Chloro-1-naphthol	Millipore-SIGMA	C6788
Anti-CD63 Antibody (rabbit anti-human) with goat anti-rabbit HRP secondary antibody	SYSTEM BIOSCIENCES	EXOAB-CD63A-1	Primary and secondary antibodies
ALB Antibody (F-10)	SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.	sc-271605	Primary antibody
apoB Antibody (C1.4)	SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.	sc-13538	Primary antibody
apoA-I Antibody (B-10)	SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.	sc-376818	Primary antibody