Protein sindirimi, Ultrafiltrasyon ve boyutu dışlama Kromatografi insan kan plazması ve Serum Exosomes yalıtım en iyi duruma getirmek için

Özet

Burada, exosomes plazma ve serum exosomal kan proteinleri azaltılmış ortak arıtma ile arındırmak için bir protokol mevcut. En iyi duruma getirilmiş iletişim kuralı Ultrafiltrasyon, proteaz tedavi ve boyutu dışlama Kromatografi içerir. Exosomes yararları aşağı akım analizleri veziküller ve proteomik karakterizasyonu daha doğru miktar dahil olmak üzere, geliştirilmiş arıtma.

Özet

Exosomes, tüm hücre türlerinden serbest nanovesicle bir tür herhangi bir bedensel sıvı ayrılmış olabilir. Protein ve RNA'ların, dahil olmak üzere exosomes, içeriğini benzersiz hücrelere hangi onlar türetilmiştir ve hastalık göstergeleri olarak kullanılabilir. Ultrasantrifüj, birkaç yaygın zenginleştirme iletişim kuralları dahil, çözünür protein kirleticiler ile yüklü exosomes verim. Özellikle, biz kan içinde en bol protein kez exosomes ile birlikte arındırmak ve aşağı akım proteomik çalışmaları, yıkmak düşük bereket biyomarker adaylar tanımlaması engelliyordu bulduk. Ek eksozom protein miktar sigara exosomal protein düzeyleri tutarsız temsil nedeniyle irreproducibility ilgilendirir. Burada ayrıntılı iletişim kuralı ile birlikte exosomes, rigor eksozom arıtma işlemi için ekleme işbirliği arındırmak sigara exosomal proteinler kaldırmak için geliştirilmiştir. Beş yöntem kullanarak eşleştirilmiş kan plazması ve serum beş bağışçılardan karşılaştırıldı. Analiz analizi ve mikro bicinchoninic asit protein tahlil izleme nanopartikül Ultrafiltrasyon ve boyutu dışlama Kromatografi kullanan bir Birleşik iletişim kuralı en iyi vezikül zenginleştirme ve çözünür protein kaldırma verdiğini ortaya koydu. Western Blot albümin ve trigliseritlerin, dahil beklenen bol kan proteinleri tükenmiş doğrulamak için kullanıldı.

Giriş

Exosomes olan nanovesicles (büyüklükleri 30 arasında değişen nm 150 nm) serbest bırakmak yanında insan vücudunun hemen hemen tüm hücrelerde hücre hücre iletişimi kolaylaştırmak için^1,2işler. İlginçtir, exosomes bileşimi kökenli hücrelerinin yanı sıra bireysel^3,4,5sağlık durumunu bağlı olarak değişir. Ayrıca, exosomes birkaç biyolojik sıvıları gibi alınabilir: tükürük, idrar ve kan². Bu özelliğinden dolayı exosomes hastalığı biyolojik iyi bir kaynak olarak kabul edilir. Ne yazık ki, işte exosomes yalıtım için standart bir yöntemi yoktur. Bazı laboratuvarlar ile 100.000 x g eksozom yalıtım için altın standart yöntemi olarak yoğunluk gradyanlar kullanarak, son bir yüksek hızlı adım multistep Santrifüjü göz önünde bulundurun. Ancak, son yıllarda yapılan çalışmalarda bu ultrasantrifüj toplama çözünür proteinler ile exosomes ve ya bütünlüğü, ikisi de aşağı akım uygulamaları^{6,7 engel olabilir etkileyen ek olarak diğer exosomes indükler göstermiştir} . Ya yalıtım diğer yaygın yöntemler içerir, ancak bunlarla sınırlı değildir: yağış ticari polietilen glikol (PEG) tarafından reaktifler, santrifüj Ultrafiltrasyon ve boyutu-dışlama Kromatografi (sn) temel alır. Polietilen glikol (PEG) polimerler kullanılarak ticari reaktifler çökelti ve bir Pelet formu onları neden olarak exosomes zenginleştirmek. Bu polimer kullanarak kalan PEG polimer ve çözünür olmayan exosomal proteinler arasında nihai ürün bolluğu ile kirlenme sınırlamalardır. Ultrafiltrasyon arındırmak ve selüloz membran kullanarak veziküller konsantre Santrifüjü kullanır; küçük yabancı maddeleri ve diğer proteinler membran^7,8-geçmek iken exosomes filtre korunur. Diğer yöntemler gibi santrifüj Ultrafiltrasyon exosomes sigara exosomal proteinler, protein kompleksleri ve toplamları dahil olmak üzere yüksek düzeyde tutma nedeniyle arındırmak için sınırlı bir kapasiteye sahiptir. Son olarak, sn arıtma gözenekli reçine molekül boyutuna göre ayırmak için kullanır. SN umut verici sonuçlar, diğer yöntemler ile deneyimli sorunların çoğu geçen madde proteinler çoğunluğu yakalayarak ve yalıtım yerçekimi veya alçak basınç sistemleri^{7göre bu yana exosomal bütünlüğü, koruma üstesinden göstermiştir, 9}. Ancak, daha büyük protein toplamları ve lipoproteinler¹⁰ eş yalıtım sn sırasında son eksozom hazırlık saflığı etkiler. Bazı yöntemler eksozom arıtma hücre kültür supernatants ve plazma⁷ya da sadece plazma^9,11test edilmiş, orada iken yöntemleri doğrudan kan karşılaştırarak performansı hakkında bilgi yok Plazma ve serum aynı kişiden.

Burada, kan exosomes arınma vezikül zenginleştirme tekniklerini plazma ve serum arasında çevrilebilir özellikte olup olmadığını belirlemek için iş akışları çeşitli karşılaştırarak ele. İzleme analizi ve western blot nanopartikül eksozom konsantrasyon, saflık ve protein kompozisyon içinde son ürün farklılıkları ölçmek için kullanılmıştır. Bu protokol için ayrıntılı son yöntem vezikül numaralarını artırır ve sigara exosomal protein düzeyleri azaltır. Önemlisi, albümin ve trigliseritlerin dahil olmak üzere ortak işbirliği Hizlandirici proteinlerin sert bir düşüş gösterdi. Bu iki protein kan ve hangi onlar exosomes ile aşağı akım analizleri eğriltme "saf" örnekleri arasında neden tutarsızlıklar co arındırmak frekans yüksek bolluk. Bu iletişim kuralı bir piyasada bulunan sn reçine kullanımını içerir; reçine proteinler 700 kDa küçük boncuklar girebileceği gözenekli boncuk oluşur. Bir kez içinde proteinler bir octylamine ligand tarafından korunur. Eluate exosomes ve 700 kDa¹²' den daha büyük moleküllerin oluşur. Ayrıca, protein toplamları ve boncuk bindirme kaçmasına trigliseritlerin azaltmak için biz bir proteaz sindirim adım iş akışı içinde dahil. Şu anda, ortak arındırıcı sigara exosomal proteinler azaltırken eksozom verim maksimize yeteneğine sahip tek hiçbir tekniği yoktur. Bu çalışmada bir proteaz sindirim Önarıtma birden fazla kurtarma ve arıtma yöntemleri ile birleştirir bir arıtma protokol eksozom verim ve saflık kan serumu ve plazma artırmak için kullanılabileceğini gösterir.

Protokol

Bu eser olarak tüm insan örnekleri Bioreclamation IVT biorepository de-tanımlanan örnekleri olarak elde edilmiştir ve edildi insan konu araştırma ilk gözden geçirme gelen Colorado State Üniversitesi Kurumsal inceleme Kurulu (IRB), üzerine olmamak belirlendi onaylı IRB protokolleri altında toplanan.

1. ham örnek (plazma veya Serum) daha büyük veziküller peletleme ve hücresel enkaz tarafından hazırlanması

Not: Emanet dikkate: plazma, serum ve diğer biyolojik sıvı biyolojik malzemeler ve özel bakım ile eldiven ve önlük gibi temel kişisel koruyucu ekipman giyerken ele alınması gerekir. Biyolojik örnekler bir biyogüvenlik kabini işlenir önerilir; Aksi takdirde mevcut, göz-koruma kullanılması tavsiye edilir.

1. Gecede 4 ° C buzdolabında sallayarak olmayan koşullar altında tüp yerleştirerek bir serum veya plazma örnek equilibrate (her iki -20 üzerinden veya-80 ° C).
2. Örnek bir 1000 µL pipet kullanarak bir microcentrifuge tüp içine aliquot 250 µL.
3. 18.000 x g 4 ° C'de 30 dk için de örnek santrifüj kapasitesi
4. 200 µL pipet kullanarak, temizlenen süpernatant ile 200 µL kaldırın ve yeni bir microcentrifuge tüp ekleyin. Pelleted herhangi bir malzeme süpernatant aktarma sırasında kaçının. Pelleted malzemesini.
5. Örnek protein içeriği üreticinin iletişim kuralını kullanarak bicinchoninic asit (BCA) tahlil tarafından ölçmek. Tahlil gerçekleştirmek için örnek 1:50 de 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x oranında seyreltin. Her örnek içinde yinelenen sınayın.
   Not: 1 x PBS protokol boyunca aksi belirtilmedikçe kullanın. Ortalama olarak, 200 µL açıklık serum veya plazma (sonra 18.000 x g) toplam protein 15 mg ortaya çıkarır. Diğer örnek türleri, daha düşük veya daha yüksek protein içerikli ek BCA dilutions gerektirebilir.
6. Yeni bir microcentrifuge tüp içine örnek aliquot 10 mg. 1.5. adımda elde toplama örnek karşılık gelen hacmi hesaplamak için kullanın. Aliquot 200 µL pipet kullanarak örnek.
   Not: Bu-80 ° C'de kalan örnek depolamak için önerilir Aliquot 10 mg başına birden çok donma-çözülme çevrimleri gelecekte önlemek için tüp farklı tüpler örnekte kullanın.

2. exosomal kan proteinlerin sindirim

Not: Sindirim adım exosomes ile birlikte arındırmak sigara exosomal proteinler azaltmak için tasarlanmıştır. Ya yüzey proteinleri korunması aşağı akım analizleri için gerekli ise, bu adım bu analizi ile müdahale potansiyeline sahiptir dikkate alınmalıdır. Exosomal CD63, bir yüzey maruz tetraspanin protein tespiti değil önemli ölçüde olumsuz etkiledi bu işlemi tarafından.

1. PBS 500 µg/mL bir konsantrasyon İndinavir K çözüm hazırlamak. İndinavir K karşılık gelen miktarda bir konik tüp içinde ekleyin. Sonra arabellek ve 30 için girdap ekleyin s, 3 x, oda sıcaklığında.
2. Aliquot 10 mg örnek 50 µL İndinavir K çözüm ekleyin ve karışımı yavaşça 200 µL pipet kullanarak yukarı ve aşağı pipetting tarafından.
3. Bir kayan nokta tüp raf tüpe örnek 30 dk. yer için bir su banyosunda 37 ° C'de kuluçkaya ve tüp olası sızıntıyı önlemek için su banyosunda Komple daldırma kaçının.
4. Örnek ve yüzen tüp raf 10 dakika, 60 ° C su banyosu İndinavir K. devre dışı bırakabilirsiniz için transfer

3. küçük proteinler ve peptidler santrifüj Ultrafiltrasyon tarafından kaldırılması

1. PBS kullanmadan önce olan 100 kDa molekül ağırlığı kesme (MWCO) filtre içeren bir Ultrafiltrasyon aygıtı durulama. Bu 1.000 µL pipet kullanarak filtre için PBS 500 µL ekleyerek yaparsınız. 3.700 x g cihaz 5 dk. atma için kalan herhangi bir retentate yanı sıra eluate spin.
   Not: Örnek birim kapasitesi Ultrafiltrasyon cihazın 0.5 mL - 4 50 µL son indirimli örnek hacmi ulaşılabilir olması için mL olmalıdır.
2. 2.4. adımdaki örnek alın ve 500 µL birime PBS ekleyerek artırmak. Örnek önceden durulanır Ultrafiltrasyon cihazın içine pipette.
   Not: Ortalama olarak, örnek adım 2.4 185 µL (120-150 µL örneği ve İndinavir K çözüm 50 µL) birimdir.
3. Örnek vardır azaltmak kadar 50 µL bir birime Ultrafiltrasyon aygıt 3.700 x g 4 ° c de sabit açılı benchtop santrifüj yerleştirin.
   Uyarı: Ultrafiltrasyon aygıtlar ile ölü durdurmak kullanıldığında cilt, bakım alınmalıdır Santrifüjü adımları uyguladığınızda filtre membran tam kuruluk önlemek için.
4. PBS 500 µL doğrudan içine belgili tanımlık süzgeç membran ve pipet yukarı ve aşağı 5 kez ekleyin. 3.3 adım olduğu gibi santrifüj kapasitesi. Bu yıkama adım toplam 3 kez uygulayın.
5. Son 50 µL retentate yeni bir microcentrifuge tüp aktarın.
6. Filtre membran 10 kat yukarı ve aşağı pipetting 200 µL PBS ile durulayın ve yıkama tüp 3.5 adımından aktarın.
7. Filtre tutucu yeni bir tüp ters pozisyonda yerleştirin. Membran kalan örnek almak için 2.000 x g de 5 min için bir ters spin kurtarma çalıştırın. Havuzu ile 3.5. adımdaki örnek örnek.

4. arıtma veziküller boyutu dışlama Kromatografi (sn) tarafından

1. SN bulamaç, 850 µL 1.000 µL pipet kullanarak bir boş, çok Millî olan yerçekimi akışı sütun 700 kDa bir MWCO sahip boncuk ekleyin. Sütunları uygun raf bir damlama tepsisi ile donatılmış bir boyutu yerleştirin.
2. Sütunun alt kapağını ve 5 min için sıvı drenaj sağlar. Süzülmüş bir kez reçine yıkamak için PBS 10 mL ekleyin. 20 dk sütundan boşaltmak yıkama için izin.
3. Konsantre koyun, İndinavir K 15 mL konik tüp içine 3.5. adımdaki örnek tedavi ve PBS serolojik pipet ile ekleme 5 ml numune hacmi artırın. Tüp karışımı yavaşça için 1 dk rock yaparak ve daha sonra yavaş yavaş adım 4.2 serolojik pipet ile hazırlanan sütun örneği geçerli.
   Not: Sütun kapağı kaldırılır bir kez örnek reçine ile yerçekimi tarafından akışı; 5-mL örnek tamamen 10 dk sütununda akışı.
4. Yeni bir 15 mL konik tüp aracılığıyla akış toplamak.
5. Serolojik pipet kullanarak, toplanan malzeme tekrar 700 kDa aşağıda kalan herhangi bir malzeme çıkarmak için reçine uygulayın.
6. Yeni bir 15 mL konik tüp aracılığıyla akış toplamak. İki kez PBS 1 mL ekleme reçine yıkayın. Tüp yoluyla akışında 4.5 adımından toplamak; Toplam son hacim kabaca 7 mL olacak.
   Not: 4.6 adımdan sonra örnek orijinal numune hacmi yaklaşık 35 kez seyreltilmiş; Aşağıdaki adımlar sesi azaltmak ve arıtılmış eksozom örnek konsantre.

5. saf Exosomes ve toplam Protein miktar konsantrasyon

1. 3 kDa MWCO filtre Ultrafiltrasyon cihazla kullanmadan, PBS önce ile 3.1 adımda anlatıldığı gibi yıkayın.
2. Örnek Ultrafiltrasyon aygıt ve santrifüj 3.700 x g 4 ° C'de, sallanan-kova Open End 4,6 adımından ekleyin Arabellek filtre üzerinden geçecek ve iptal edilecek. Konsantre exosomes filtre korunur. Filtre (retentate) yukarıda birim için 200 µL azalır kadar örnek santrifüj kapasitesi.
3. Retentate yeni bir microcentrifuge tüp aktarın.
4. Membran üzerinde 10 kat pipetting tarafından filtre membran 200 µL PBS ile durulayın ve yıkama tüp 5.3 adımından aktarın. Bu herhangi bir kalıntı eksozom örnek koleksiyonu için izin verir.
5. Numune hacmi 500 µL kadar PBS ekleyerek getir. Yavaş yavaş aşağı yukarı 10 kez pipetting tarafından karıştırın.
   Not: Protokol burada duraklatılmış. Örnekleri gecede 4 ° C'de veya uzun süreli depolama için-20 /-80 ° C de saklanmalıdır.
6. Örnek protein içeriği üreticinin iletişim kuralını kullanarak BCA tahlil tarafından ölçmek. Örnek 1:10 ve 1:50 de PBS oranında seyreltin. Her örnek içinde yinelenen çalıştırın.
   Not: Serum veya plazma toplam protein ile 10 mg, toplam protein verim--dan adım 5.6 arıtılmış exosomes içinde ortalama olarak 150 µg. ek dilutions örnekleri serum veya plazma dışında kullandıysanız gerekli olabilir ulaşıyor; verim örnek türü ile farklılık gösterebilir.

6. miktar ve boyutlandırma nanopartikül izleme çözümlemesi (NTA) tarafından Exosomes

1. PBS ve girdap 15 1 mL (5.6 içinde sayısal olarak) saf exosomes 5 µg ekleyin s düşük-orta hız.
   1. 1 mL tek kullanımlık şırınga örnekte bir yer. Varsa, şırınga 30 µL/dk hızında seyreltilmiş eksozom örnek enjekte etmek için ayarla bir otomatik şırınga pompa ayarlayın.
   2. Video yakalama ayarlarını kullanarak NTA ölçüleri gerçekleştirmek: ekran 12-13 3-4 ve kamera düzeyini ve kazanç.
   3. 30 en az üç teknik çoğaltır çalıştırmak analiz için komut dosyasında her çoğaltma için sürekli bir akış kullanarak s. Analiz için saat 5'te yakalama eşik ayarlayın.
      Not: Video yakalama otomatik şırınga ve ayarları kullanıma ilişkin ayrıntılar başvuru¹³' te verilir. NTA yakalama ve çözümleme ayarlarını farklı örnekleri arasında karşılaştırılabilir sağlamak için tutarlı olmalıdır.

7. çözünür Protein azaltma tespiti

1. 1-10 µg SDS örnek arabellek için saf exosomes, eklemek ve polyacrylamide Jel Elektroforez (sayfa) 4-%12 Bis-Tris jel kullanarak gerçekleştirmek 1 x MES SDS 200 35 dk için tampon çalıştıran içinde bir gerilim o uygulayarak nitroselüloz 0.2 µm membran protein V. Transfer çözüldü f 50 V 1-1.5 h. albümin, trigliseritlerin A ve B ve ya işaret CD 63 varlığı değerlendirmek için gerçekleştir western blot analizi için standart metodolojileri takip.
   Not: Tam iletişim kuralları 7.1 yöntemleri için başvuru¹⁴' te bulunabilir; Özellikle, SP007: polyacrylamide jelleri ve SP011 çalışan: Western blot protokolü.
2. Saf exosomes adım 7.1 olduğu gibi sayfa kullanarak 10 µg ayrı ve coomassie boya, kullanarak protein bantları protein varyasyon ve azaltma örnekleri arasında görselleştirmek için aşağıdaki standart önerileri leke.
   Not: Daha fazla bilgi için Batı lekesi CD63 için belirli iletişim kuralı ile ilgili Diaz ve arktarafından açıklanmıştır. ¹⁵

Sonuçlar

Aşağıda gösterilen veri beş sağlıklı kan bağış eşleştirilmiş plazma ve serum numuneleri kullanılarak elde edilmiştir. Her işlem adımını etkilerini belirlemek için sunulan Protokolü beş varyasyonları gerçekleştirilen ve eksozom kurtarma ve sigara eksozom protein kaldırma göre. Yargılandın dahil yöntemleri: 1) sn 700 kDa + Ultrafiltrasyon 3 kDa; 2) Ultrafiltrasyon 100 kDa; 3) İndinavir K + Ultrafiltrasyon 100 kDa; 4) sn 700 kDa + Ultrafiltrasyon 100 kDa ve 5)...

Tartışmalar

Saflık ve exosomes kandan verimini artırmak için en iyi duruma getirilmiş bir yöntem doğru bir şekilde biyolojik çeşitli hastalıklar için bir kaynak olarak ekstrasellüler veziküller benim yeteneği artacaktır. Şu anda exosomes, özellikle, izole etmek için kullanılan standart yöntemler ultrasantrifüj ve yağış yöntemleri, çözünür proteinler⁷/^{,17, peletleme ve eksozom toplama dahil olmak üzere çeşitli dezavantajları var}

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nanosight	Malvern	NS300
Benchtop microcentrifuge	Thermo	Legend Mico21
Benchtop centrifuge	Beckman Coulter	Allegra 6R
Waterbath	Benchmark	B2000-4
Microplate reader	BIOTEK	Epoch
Pierce BCA Protein Assay Kit	THERMO	23227
Micro BCA Protein Assay Kit	THERMO	23235
Phosphate buffered saline	Corning	21-040-CV
96 well plate	Corning	15705-066
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane	EMD-Millipore	UFC510096
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units	EMD-Millipore	UFC800324
Capto Core 700	GE Healthcare	17548103
Poly-Prep Chromatography Columns	BIORAD	7311550
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels	THERMO	NP0323BOX
Nitrocellulose Membrane, Roll, 0.2 µm	BIORAD	1620112
Proteinase K, Tritirachium album	EMD-Millipore	539480
SimplyBlue SafeStain	THERMO	LC6065
SIGMAFAST BCIP/NBT	Millipore-SIGMA	B5655
4-Chloro-1-naphthol	Millipore-SIGMA	C6788
Anti-CD63 Antibody (rabbit anti-human) with goat anti-rabbit HRP secondary antibody	SYSTEM BIOSCIENCES	EXOAB-CD63A-1	Primary and secondary antibodies
ALB Antibody (F-10)	SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.	sc-271605	Primary antibody
apoB Antibody (C1.4)	SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.	sc-13538	Primary antibody
apoA-I Antibody (B-10)	SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.	sc-376818	Primary antibody