Proteinverdauung, Ultrafiltration und Größe Ausgrenzung Chromatographie, die Isolation der Exosomen aus menschlichem Blutplasma und Serum zu optimieren

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll exosomen von Plasma und Serum mit reduzierter CO Reinigung nicht Exosomal Blut zu reinigen. Das optimierte Protokoll beinhaltet Ultrafiltration, Protease Behandlung und Größe Ausgrenzung Chromatographie. Verbesserte Reinigung von exosomen Vorteile nachgeschalteten Analysen, einschließlich genauere Quantifizierung von Vesikeln und Proteomic Charakterisierung.

Zusammenfassung

Exosomen, eine Art von Nanovesicle befreit alle Zelltypen können von jeder Körperflüssigkeit isoliert werden. Den Inhalt des exosomen, einschließlich Proteinen und RNAs, sind einzigartig für die Zellen, aus denen sie stammen und können als Indikatoren für die Krankheit verwendet werden. Mehrere gemeinsame Bereicherung Protokolle, einschließlich Ultrazentrifugation, Ausbeute exosomen beladen mit lösliche Protein Verunreinigungen. Insbesondere haben wir festgestellt, dass die am häufigsten vorkommende Proteine im Blut oft gemeinsam mit exosomen reinigen und können verwirren nachgelagerten Proteomik-Studien, die Identifizierung von niedrigen Fülle Biomarker Kandidaten zu vereiteln. Weitere Anliegen ist Unreproduzierbarkeit exosom Protein Quantifizierung wegen inkonsistenten Darstellung der nicht-Exosomal-Protein-Ebene. Das Protokoll hier besprochen wurde entwickelt, um nicht Exosomal Proteine zu entfernen, die zusammen mit exosomen, die exosom Reinigungsprozess strenge hinzufügen Co zu reinigen. Fünf Methoden wurden verglichen mit gekoppelten Blut-Plasma und Serum von fünf Spendern. Analyse mit Nanopartikel tracking-Analyse und Mikro Bicinchoninic sauren Protein Assay ergab, dass ein kombiniertes Protokoll Ultrafiltration und Größe Ausgrenzung Chromatographie nutzen die optimale Vesikel Bereicherung und lösliche Protein Entfernung ergab. Westliche Beflecken wurde verwendet, um sicherzustellen, dass die erwarteten reichlich Blutproteine, einschließlich Albumin und Apolipoproteins, erschöpft waren.

Einleitung

Exosomen sind Nanovesicles (in der Größe von 30 nm bis 150 nm) veröffentlicht durch fast alle Zellen im menschlichen Körper zur Erleichterung der Kommunikation von Zelle zu Zelle^1,2verarbeitet. Interessanterweise ändert sich die Zusammensetzung des exosome abhängig von den Zellen der Herkunft sowie den Gesundheitszustand des einzelnen^3,4,5. Darüber hinaus können exosomen aus mehreren biologischen Flüssigkeiten wie z. B. abgerufen werden: Speichel, Urin und Blut². Aufgrund dieser Eigenschaften exosomen gelten eine gute Quelle von Krankheit Biomarker. Leider gibt es keine Standardmethode für die Isolierung von exosomen. Einige Labors prüfen, mehrstufige Zentrifugation mit High-Speed-abschließend bei 100.000 x g mit Dichtegradienten als Goldstandard-Methode für die exosom Isolierung. Neuere Studien haben jedoch gezeigt, dass die Ultrazentrifugation induziert Aggregation von exosomen mit löslichen Proteinen und anderen exosomen, neben den Auswirkungen auf exosom Integrität, beide mit downstream-Anwendungen^{6,7 behindern können} . Andere gängige Methoden der exosom Isolation beinhalten, aber beschränken sich nicht auf: Niederschlag von kommerziellen Polyethylenglykol (PEG) basiert, Reagenzien, zentrifugale Ultrafiltration und Größe-Exclusion Chromatography (SEC). Die kommerziellen Reagenzien mit Polyethylenglykol (PEG) Polymere bereichern exosomen veranlaßt, Niederschlag und bilden ein Pellet. Einschränkungen mit diesem Polymer sind Kontaminationen mit residual PEG Polymer und eine Fülle von löslichen nicht Exosomal Proteine im Endprodukt. Ultrafiltration nutzt Zentrifugation zu reinigen und Bläschen mit einer Zellulose-Membran zu konzentrieren; exosomen werden oberhalb des Filters beibehalten, während kleinere Verunreinigungen und andere Proteine die Membran-^7,-^{8 passieren}. Genau wie andere Methoden hat zentrifugale Ultrafiltration eine begrenzte Kapazität, exosomen aufgrund des Eigentumsvorbehalts mit hohem Maß an nicht Exosomal Proteine, einschließlich Proteinkomplexe und Aggregate zu reinigen. Schließlich verwendet SEC Reinigung porösen Harz zum Trennen von Molekülen durch Größe. SEC gezeigt hat viel versprechende Ergebnisse, die meisten Probleme mit anderen Methoden durch die Erfassung der Mehrheit der Verunreinigung Proteine und Exosomal Integrität zu bewahren, da Isolation auf Schwerkraft oder Tiefdruckgebiete^{7zu überwinden, 9}. Die Co Isolation von größeren Protein Aggregate und Lipoproteine¹⁰ während SEC betrifft jedoch die Reinheit der endgültigen exosom Zubereitung. Während einige Methoden für die exosom Reinigung von Zelle Kultur Überstände und Plasma⁷oder nur Plasma^9,11geprüft worden sind, gibt es keine Informationen über die Leistung der Methoden direkt vergleichen Blut Plasma und Serum von der gleichen Person.

Hier konzentrieren wir uns auf die Reinigung von Blut exosomen durch den Vergleich verschiedener Arbeitsabläufe zu bestimmen, ob Vesikel Anreicherung Techniken zwischen Plasma und Serum übersetzbar sind. Nanopartikel, die tracking-Analyse und western-Blot wurden verwendet, um die Unterschiede in exosom Konzentration, Reinheit und Eiweiß-Zusammensetzung in den Endprodukten zu quantifizieren. Die letzte Methode, detailliert in diesem Protokoll erhöht Vesikel Zahlen und nicht-Exosomal-Protein-Niveau reduziert. Wichtig ist, ist eine drastische Reduzierung der gemeinsamen Co auslösenden Proteine wie Albumin und Apolipoproteins gezeigt. Die hohe Fülle dieser beiden Proteine im Blut und die Frequenz, bei der sie mit exosomen Ursachen Inkonsistenzen zwischen "gereinigten" Proben, neigen die nachgeschalteten Analysen Co zu reinigen. Dieses Protokoll beinhaltet die Nutzung eines im Handel erhältlichen SEC-Harzes; das Harz besteht aus porösen Kügelchen, in denen Proteine kleiner als 700 kDa die Perlen eingeben können. Einmal drinnen, die Proteine durch eine Octylamine-Liganden bleibt bestehen. Das Eluat besteht aus exosomen und Moleküle größer als 700 kDa¹². Darüber hinaus umfassen wir um reduzieren die Protein-Aggregate und Apolipoproteins die Wulst Überfüllen zu entziehen, einen Protease Verdauung Schritt im Workflow. Derzeit gibt es keine einzige Technik in der Lage, Ertragssteigerung exosom gleichzeitiger Reduzierung Co reinigende nicht Exosomal Proteine. Diese Studie zeigt, dass eine Reinigung-Protokoll, die eine Protease Verdauung Vorbehandlung mit mehreren Rückgewinnung und Reinigung Methoden kombiniert exosom Ausbeute und Reinheit von Blutserum und Blutplasma zu erhöhen verwendet werden kann.

Protokoll

Diese Arbeit war fest entschlossen, nicht menschlichen Subjekts Forschung nach einer ersten Überprüfung von Kolorado Landesuniversität institutionelle Review Board (IRB), werden wie alle humanen Proben als anonymisierte Proben aus der Bioreclamation IVT-Biorepository erhalten wurden und waren unter IRB genehmigten Protokolle gesammelt.

1. Vorbereitung des rohen Probe (Plasma oder Serum) durch größere Vesikel Pelletierung und Zelltrümmer

Hinweis: Sicherheit berücksichtigen: Plasma, Serum und anderen biologischen Flüssigkeiten sind biogefährliches Material und muss mit besonderer Sorgfalt behandelt werden, während das grundlegende persönlichen Schutzausrüstung einschließlich Handschuhe und Kittel tragen. Es wird dringend empfohlen, dass biologische Proben in ein Kabinett Biosafety verarbeitet werden; Falls nicht verfügbar, ist die Verwendung von Augenschutz empfohlen.

1. Equilibrate ein Serum oder Plasma Muster, indem man das Rohr nicht schütteln Bedingungen im Kühlschrank 4 ° C über Nacht (von beiden-20 oder-80 ° C).
2. Aliquoten 250 µL der Probe zu einem Microcentrifuge Schlauch mit einer 1.000 µL Pipette.
3. Zentrifugieren Sie die Probe bei 18.000 x g für 30 min bei 4 ° C.
4. Mit einer 200 µL Pipette, entfernen Sie 200 µL des Überstands geräumt zu und fügen Sie es zu einem neuen Microcentrifuge Schlauch. Vermeiden Sie jegliches gebeizte Material während der Übertragung des Überstands. Entsorgen Sie das gebeizte Material.
5. Quantifizieren Sie die Proteingehalt der Probe von Bicinchoninic Säure (BCA) Assay, über die Hersteller-Protokoll. Um den Test durchzuführen, verdünnen der Probe 01:50 in 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Testen Sie jede Probe in zweifacher Ausfertigung.
   Hinweis: 1 X PBS im gesamten Protokoll zu verwenden, sofern nicht anders angegeben. Im Durchschnitt ergibt 200 µL geklärte Serum oder Plasma (nach 18.000 x g) 15 mg Gesamt-Protein. Anderen Probenarten mit niedrigeren oder höheren Proteingehalt, erfordern zusätzliche BCA Verdünnungen.
6. Aliquoten 10 mg der Probe in einen neuen Microcentrifuge Schlauch. Verwenden Sie die Konzentration in Schritt 1.5 erhalten, um das entsprechende Volumen der Probe zu berechnen. Aliquot der Probe mit einer 200 µL Pipette.
   Hinweis: Es wird empfohlen, die restlichen Probe bei-80 ° c Lagern Aliquoten Verwenden des Beispiels in verschiedenen Röhren bei 10 mg pro Röhre, mehrere Frost-Tau-Zyklen in Zukunft zu vermeiden.

(2) Verdauung der Blutproteine nicht exosomal

Hinweis: Die Verdauung Schritt soll die nicht-Exosomal-Proteine zu verringern, die mit exosomen Co reinigen kann. Wenn Erhaltung der Oberflächenproteine exosom für nachgelagerte Analysen erforderlich ist, sollten sie berücksichtigt werden, die diesen Schritt das Potenzial hat, diese Analyse beeinträchtigen. Die Erkennung von Exosomal CD63, ein Oberfläche exponierten Tetraspanin Protein, wurde dieser Prozess nicht deutlich negativ beeinflusst.

1. Proteinase K-Lösung mit einer Konzentration von 500 µg/mL mit PBS-Puffer vorzubereiten. Fügen Sie den entsprechenden Betrag von Proteinase K in einem konischen Rohr. Fügen Sie dann den Puffer und Vortex für 30 s, 3 X bei Raumtemperatur.
2. Die 10-mg-Probe aliquoten 50 µL Proteinase K-Lösung hinzu und mischen Sie leicht von oben und unten mit einer 200 µL Pipette pipettieren.
3. Inkubation der Probe bei 37 ° C in einem Wasserbad für 30 min. Platz das Rohr in einem Float Tube Rack und vermeiden Sie vollständiges Eintauchen des Schlauches in das Wasserbad, um mögliche Leckagen zu vermeiden.
4. Transfer der Probe und schwimmenden Rohr Rack zum Wasserbad 60 ° C für 10 min, um die Proteinase K. zu inaktivieren

3. Entfernung von kleinen Proteinen und Peptiden durch Zentrifuge Ultrafiltration

1. Spülen Sie eine Ultrafiltration Gerät mit 100 kDa Molekulargewicht (MWCO) Kantenfilter mit PBS vor dem Gebrauch ab. Tun Sie dies, indem Sie den Filter mit einer 1.000 µL Pipette 500 µL PBS hinzufügen. Drehen Sie dem Gerät bei 3.700 x g für 5 min. verwerfen alle verbleibenden Retentat sowie das Eluat.
   Hinweis: Die Probe Volumenkapazität der Ultrafiltration Gerät darf 0,5 mL - 4 mL um sicherzustellen, dass die endgültige reduzierte Probenvolumen von 50 µL erreichbar ist.
2. Nehmen Sie das Beispiel aus Schritt 2.4 und erhöhen Sie die Lautstärke auf 500 µL PBS hinzufügen. Die Probe in das Gerät vorher gespült Ultrafiltration Pipette.
   Hinweis: Im Durchschnitt ist das Probenvolumen ab Schritt 2.4 185 µL (120 bis 150 µL der Probe und 50 µL Proteinase K-Lösung).
3. Legen Sie die Ultrafiltration Gerät in einem festen Winkel Benchtop Zentrifuge bei 3.700 x g bei 4 ° C, bis die Probe hat ein Volumen von 50 µL reduzieren.
   Vorsicht: Bei Verwendung von Ultrafiltration Geräte mit dead-Stop Volumen, muss darauf geachtet, vollständige Trockenheit der Filtermembran während der Zentrifugation Schritte zu vermeiden.
4. Fügen Sie direkt in die Filtermembran und Pipette rauf und runter 5 mal 500 µL PBS. Zentrifugieren Sie wie in Schritt 3.3. Führen Sie diese Waschschritt insgesamt 3 Mal.
5. Übertragen Sie die letzten 50 µL Retentat in einen neuen Microcentrifuge Schlauch.
6. Die Filtermembran mit 200 µL PBS, pipettieren nach oben und unten 10 mal spülen und Waschen von Schritt 3.5 auf das Rohr übertragen.
7. Legen Sie den Filterhalter in die inverse Position in einen neuen Schlauch. Führen Sie eine umgekehrte Spin Erholung für 5 min bei 2.000 x g abzurufenden verbleibenden Probe aus der Membran. Bündeln Sie die Probe mit der Probe aus Schritt 3.5.

4. Reinigung von Vesikeln durch Größe Ausgrenzung Chromatography (SEC)

1. Fügen Sie 850 µL SEC Gülle mit Perlen mit einem MWCO von 700 kDa, in eine leere, angeschnittene Ärmel Schwerkraft fließen Spalte mit einer 1.000 µL Pipette. Legen Sie die Spalten in einer Größe, die entsprechenden Rack mit einer Tropfschale ausgestattet.
2. Kreditnehmern Sie den unteren Rand der Spalte und lassen Sie die Flüssigkeit Abfluss für 5 min. Sobald abgelassen, fügen Sie 10 mL PBS waschen des Harzes. Lassen Sie 20 min für die Wäsche aus der Spalte abtropfen.
3. Legen Sie die konzentrierte, Proteinase K Probe von 3,5 betreten eine 15 mL konische Rohr behandelt und erhöhen das Probenvolumen bis 5 mL PBS mit einer serologischen Pipette hinzufügen. Mischen Sie das Rohr leicht durch Schaukeln für 1 min und wenden Sie dann langsam die Probe auf die Säule im Schritt 4.2 mit einer serologischen Pipette vorbereitet.
   Hinweis: Sobald die Kappe der Spalte entfernt wird, wird die Probe durch das Harz durch die Schwerkraft fließen; die 5-mL-Probe wird vollständig durch die Säule in 10 min fließen.
4. Der Durchfluss in einem neuen 15 mL konische Röhrchen zu sammeln.
5. Mit einer serologischen Pipette, das gesammelte Material gelten Sie für das Harz wieder, eventuell verbleibende Material unter 700 kDa zu entfernen.
6. Der Durchfluss in einem neuen 15 mL konische Röhrchen zu sammeln. Waschen Sie das Harz zweimal hinzufügen 1 mL PBS. Der Durchfluss im Rohr aus Schritt 4.5 zu sammeln; das gesamte Endvolumen werden etwa 7 mL.
   Hinweis: Nach Schritt 4.6 wird die Probe ca. 35 mal aus dem ursprünglichen Probenvolumen verdünnt; die folgenden Schritte werden verringern Sie die Lautstärke und die gereinigten exosom Probe zu konzentrieren.

5. Konzentration des gereinigten Exosomen und Gesamt-Protein Quantifizierung

1. Spülen Sie eine Ultrafiltration Gerät mit 3 kDa MWCO Filter mit PBS vor dem Gebrauch, wie unter Punkt 3.1 beschrieben.
2. Hinzu kommen die Probe aus Schritt 4.6 die Ultrafiltration Gerät und Zentrifuge in ein schwingen-Eimer-Rotor bei 3.700 x g bei 4 ° c Puffer werden durch den Filter passieren und kann verworfen werden. Oberhalb des Filters werden konzentrierte exosomen einbehalten. Zentrifugieren Sie die Probe, bis das Volumen oberhalb des Filters (Retentat) auf 200 µL reduziert ist.
3. Übertragen Sie das Retentat auf einen neuen Microcentrifuge Schlauch.
4. Die Filtermembran mit 200 µL PBS durch pipettieren über die Membran 10 mal spülen und Waschen von Schritt 5.3 auf das Rohr übertragen. Dies ermöglicht die Sammlung einer verbleibenden exosom Probe.
5. Bringen Sie bis zu 500 µL Probenvolumen durch Zugabe von PBS. Mischen Sie, indem Sie langsam nach oben und unten 10 mal pipettieren.
   Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Proben sollten bei 4 ° C über Nacht oder-20/80 ° C für langfristige Lagerung gespeichert werden.
6. Quantifizieren Sie die Proteingehalt der Probe von BCA-Test, mit dem Hersteller-Protokoll. Verdünnen Sie die Probe 01:10 und 01:50 in PBS. Führen Sie jede Probe in zweifacher Ausfertigung.
   Hinweis: Beginnend mit 10 mg Gesamt-Protein von Serum oder Plasma, ergibt sich eine Gesamt-Protein in gereinigten exosomen aus Schritt 5.6, im Durchschnitt 150 µg. weitere Verdünnungen erforderlich sein, wenn Proben als Serum oder Plasma verwendet werden; Rendite kann mit Probentyp variieren.

(6) Quantifizierung und Dimensionierung der Exosomen durch Nanopartikel Tracking-Analyse (NTA)

1. Hinzugefügt 5 µg des gereinigten exosomen (wie bei 5,6 quantifiziert) 1 mL PBS und Vortex für 15 s auf niedrige mittlere Geschwindigkeit.
   1. Legen Sie die Probe in einer 1 mL-Einwegspritze. Falls verfügbar, inmitten der Spritze eine automatische Spritzenpumpe festgelegt, die verdünnten exosom Probe mit einer Rate von 30 µL/min zu injizieren.
   2. NTA-Messungen mit video-Capture-Einstellungen durchführen: Gewinn von 3-4 und Kamera Ebene von 12-13-Bildschirm.
   3. Definieren Sie das Skript für die Analyse zu laufen drei technische Wiederholungen für ein Minimum von 30 s mit einen konstanten Fluss für jede Wiederholung. Stellen Sie für die Analyse die Capture-Schwelle bei 5 ein
      Hinweis: Einzelheiten über die Verwendung der automatischen Spritze und Einstellungen für die Videoaufnahme gibt es in der Referenz-¹³. Erfassung und Analyse Einstellungen für NTA müssen konsistent sein, über verschiedene Proben um Vergleichbarkeit zu gewährleisten.

7. Ermittlung der lösliche Protein Reduktion

1. 1 – 10 µg des gereinigten exosomen zu SDS-Probenpuffer hinzufügen und führen Sie Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) mit einer 4-12 % Bis-Tris Gel in 1 X MES SDS laufen Puffer für 35 min. bei 200 V. Gefahrenübergang Proteine auf eine Nitrocellulose 0,2 µm Membran durch Anlegen einer Spannung o gelöst f 50 V für 1-1,5 h Perform western-Blot-Analyse auf das Vorhandensein von Albumin, Apolipoproteins A und B und die exosom Marker CD 63 bewerten nach standard Methoden.
   Hinweis: Vollständige Protokolle für die Methoden in 7.1 finden Sie im Referenz-¹⁴; insbesondere SP007: Polyacrylamid-Gele und SP011 laufen: Western-Blot-Protokoll.
2. Trennen Sie 10 µg des gereinigten exosomen mit Seite wie in Schritt 7.1 zu und Färben Sie die Protein-Bands mit Coomassie-Färbung, folgende standard-Empfehlungen, um Protein-Variation und Reduktion zwischen Proben zu visualisieren.
   Hinweis: Weitere Informationen über das Protokoll für western Blots spezifisch für CD63 werden durch Diaz Et al.beschrieben. ¹⁵

Ergebnisse

Die unten dargestellten Daten stammen mit gekoppelten Plasma und Serum-Proben von fünf gesunden Blutspendern. Um die Auswirkungen von jedem Bearbeitungsschritt bestimmen, wurden fünf Varianten des vorliegenden Protokolls durchgeführt und exosom Erholung und nicht exosom Protein Entfernung verglichen. Die Methoden erprobt: 1) SEC 700 kDa + Ultrafiltration 3 kDa; (2) Ultrafiltration 100 kDa; (3) Proteinase K + Ultrafiltration 100 kDa; (4) SEC 700 kDa + Ultrafiltration 100 kDa und 5) Prot...

Diskussion

Eine optimierte Methode zur Erhöhung der Reinheit und Ausbeute von exosomen aus Blut erhöht die Fähigkeit, genau meins extrazelluläre Vesikel als Quelle von Biomarkern für verschiedene Krankheiten. Die Standardmethoden zur derzeit exosomen, speziell, isolieren Ultrazentrifugation und Niederschlag Methoden, haben mehrere Nachteile einschließlich exosom Aggregation und Pelletierung von löslichen Proteinen^{7,17, 18}. Alternat...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nanosight	Malvern	NS300
Benchtop microcentrifuge	Thermo	Legend Mico21
Benchtop centrifuge	Beckman Coulter	Allegra 6R
Waterbath	Benchmark	B2000-4
Microplate reader	BIOTEK	Epoch
Pierce BCA Protein Assay Kit	THERMO	23227
Micro BCA Protein Assay Kit	THERMO	23235
Phosphate buffered saline	Corning	21-040-CV
96 well plate	Corning	15705-066
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane	EMD-Millipore	UFC510096
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units	EMD-Millipore	UFC800324
Capto Core 700	GE Healthcare	17548103
Poly-Prep Chromatography Columns	BIORAD	7311550
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels	THERMO	NP0323BOX
Nitrocellulose Membrane, Roll, 0.2 µm	BIORAD	1620112
Proteinase K, Tritirachium album	EMD-Millipore	539480
SimplyBlue SafeStain	THERMO	LC6065
SIGMAFAST BCIP/NBT	Millipore-SIGMA	B5655
4-Chloro-1-naphthol	Millipore-SIGMA	C6788
Anti-CD63 Antibody (rabbit anti-human) with goat anti-rabbit HRP secondary antibody	SYSTEM BIOSCIENCES	EXOAB-CD63A-1	Primary and secondary antibodies
ALB Antibody (F-10)	SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.	sc-271605	Primary antibody
apoB Antibody (C1.4)	SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.	sc-13538	Primary antibody
apoA-I Antibody (B-10)	SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.	sc-376818	Primary antibody