Digestion des protéines, Ultrafiltration et chromatographie d’Exclusion afin d’optimiser l’isolement des Exosomes de sérum et de Plasma sanguin humain

Résumé

Nous présentons ici un protocole visant à purifier les exosomes de plasma et de sérum réduit co purification de protéines sanguines non-exosomal. Le protocole optimisé inclut l’ultrafiltration, le traitement de la protéase et chromatographie d’exclusion. Améliorée de purification des exosomes des analyses en aval avantages, y compris la quantification plus précise des vésicules et la caractérisation de la protéomique.

Résumé

Exosomes, un type de nanovesicle libéré de tous les types de cellules, peuvent être isolées de tout fluide corporel. Le contenu des exosomes, y compris les protéines et les ARN, est unique dans les cellules d'où ils proviennent et peuvent être utilisés comme indicateurs de maladie. Plusieurs protocoles communs de l’enrichissement, y compris ultracentrifugation, rendement exosomes chargés de contaminants de protéines solubles. Plus précisément, nous avons constaté que les protéines les plus abondantes dans le sang souvent co purifient avec exosomes et peuvent confondre des études protéomiques en aval, contrecarrer l’identification des candidats de biomarqueurs de faible abondance. Autre sujet de préoccupation est reproducibilité de dosage protéique exosome en raison de la représentation incompatible des concentrations de protéines non-exosomal. Le protocole détaillé ici a été développé pour éliminer les protéines non-exosomal qui purifient conjointement avec les exosomes, ajout de rigueur pour le processus de purification exosome. Cinq méthodes ont été comparées à l’aide de paires de plasma sanguin et le sérum de cinq donateurs. L’analyse en utilisant des nanoparticules, suivi, analyse et dosage de la protéine acide bicinchoninic micro a révélé qu’un protocole combiné utilisant la chromatographie d’exclusion de l’ultrafiltration et la taille ont donné l’enrichissement vésicule optimale et l’enlèvement de protéines solubles. Western Blot a été utilisée pour vérifier que les protéines de sang abondantes attendues, notamment l’albumine et apolipoprotéines, étaient épuisés.

Introduction

Exosomes sont nanovesicles (allant de 30 nm à 150 nm) publié par presque toutes les cellules dans le corps humain pour faciliter la communication de cellule-cellule traite^1,2. Fait intéressant, la composition des exosomes change suivant les cellules d’origine ainsi que l’état de santé de l’individuel^3,4,5. En outre, les exosomes peuvent être extraites de plusieurs fluides biologiques tels que : salive, l’urine et de sang². Grâce à ces caractéristiques, exosomes sont considérés comme une bonne source de biomarqueurs de la maladie. Malheureusement, il n’y a aucune méthode standard pour l’isolement des exosomes. Certains laboratoires considèrent centrifugation plusieurs étapes, avec une dernière étape à grande vitesse à 100 000 x g utilisant des gradients de densité comme la méthode de l’étalon-or pour l’isolement de l’exosome. Toutefois, des études récentes ont montré qu’ultracentrifugation induit agrégation des exosomes avec protéines solubles et autres exosomes, en plus d’affecter l’intégrité de l’exosome, qui risquent d’entraver les applications en aval^6,7 . Autres méthodes courantes d’isolement de l’exosome comprennent, mais ne se limitent pas à : précipitation par commercial polyéthylène glycol (PEG) base réactifs, ultrafiltration centrifuge et chromatographie d’exclusion stérique (SEC). Les réactifs commerciaux utilisant des polymères de polyéthylène glycol (PEG) enrichissent les exosomes en obligeant à précipiter et former une boulette. Limites à l’aide de ce polymère sont contamination résiduelle PEG polymère et une abondance de protéines solubles non-exosomal dans le produit final. Ultrafiltration utilise centrifugation pour purifier et concentrer les vésicules à l’aide d’une membrane de cellulose ; exosomes sont conservés au-dessus du filtre, tandis que les plus petites impuretés et autres protéines traversent la membrane^7,8. Tout comme les autres méthodes, ultrafiltration centrifuge a une capacité limitée pour purifier les exosomes en raison du maintien de niveaux élevés de protéines non-exosomal, y compris les agrégats et les complexes protéiques. Enfin, purification SEC utilise une résine poreuse pour séparer les molécules selon la taille. SEC a montré des résultats prometteurs, surmontant la plupart des problèmes expérimentés avec d’autres méthodes en capturant la majorité des protéines contaminant et en préservant l’intégrité exosomal, étant donné que l’isolement est fondé sur la gravité ou de systèmes dépressionnaires^{7, 9}. Toutefois, l’isolement Co de protéines plus gros agrégats et les lipoprotéines¹⁰ pendant SEC affecte la pureté de la préparation de l’exosome final. Alors que certaines méthodes ont été testées pour la purification de l’exosome de surnageants de culture de cellules et plasma⁷ou seulement plasma^9,11, il n’y a aucune information sur la performance des méthodes comparant directement le sang plasma et sérum de la même personne.

Ici, nous nous concentrons sur la purification du sang exosomes en comparant une variété de flux de travail pour déterminer si les techniques d’enrichissement de vésicules sont traduisibles entre le sérum et le plasma. Nanoparticules, suivi, analyse et tache occidentale ont été utilisées pour quantifier les différences dans la composition de concentration, la pureté et protéine exosome dans les produits finaux. La dernière méthode, détaillée dans le présent protocole, augmente le nombre de vésicules et réduit les niveaux de protéines non-exosomal. Ce qui est important, une réduction drastique des protéines co précipitants communes dont l’albumine et apolipoprotéines est démontrée. La grande abondance de ces deux protéines dans le sang et la fréquence à laquelle ils purifient conjointement avec exosomes causes des incohérences entre les échantillons « purifiés », les analyses en aval de l’inclinaison. Ce protocole comprend l’utilisation d’une résine SEC disponible dans le commerce ; la résine est composée de perles poreux dans lequel protéines inférieures à 700 kDa peuvent entrer dans les perles. Une fois à l’intérieur, les protéines sont retenus par un ligand octylamine. L’éluat est composé de molécules supérieure à 700 kDa¹²et les exosomes. En outre, afin de réduire les agrégats de protéines et apolipoprotéines qui se soustraire de piégeage de la perle, nous incluons une étape de digestion de protéase dans le workflow. Actuellement, il n’y a aucune technique unique capable de maximiser l’exosome rendement tout en réduisant les co purification de protéines non-exosomal. Cette étude montre qu’un protocole de purification qui combine un prétraitement de digestion de protéase avec plusieurs méthodes de récupération et la purification peut être utilisé pour augmenter le rendement exosome et la pureté du sérum de sang et de plasma.

Protocole

Ce travail a été déterminé à ne pas être recherche sujet humain lors de l’examen initial de Colorado State University Institutional Review Board (IRB), comme tous les échantillons humains ont été obtenus sous forme d’échantillons anonymes de la Banque de tissus biologiques Bioreclamation IVT et ont été recueillis en vertu de protocoles approuvée de la CISR.

1. préparation de l’échantillon brut (Plasma ou sérum) par granulation plus grandes vésicules et débris cellulaires

Remarque : Mesures de sécurité : plasma, le sérum et autres liquides biologiques sont des matières biologiques dangereuses et doivent être manipulés avec soin, tout en portant la base équipement de protection individuelle, y compris les gants et blouse de laboratoire. Il est fortement recommandé que les échantillons biologiques sont traités dans une biosécurité armoire ; Si ce n’est pas disponible, l’utilisation de lunettes de protection est recommandée.

1. Equilibrer un sérum ou un échantillon de plasma en plaçant le tube dans des conditions non-secouant dans un réfrigérateur à 4 ° C durant la nuit (de soit -20 ou l’entreposage de-80 ° C).
2. Aliquote 250 µL de l’échantillon dans un tube à microcentrifugation à l’aide d’une pipette 1 000 µL.
3. Centrifuger l’échantillon à 18 000 x g pendant 30 min à 4 ° C.
4. À l’aide d’une pipette de 200 µL, retirer 200 µL du liquide surnageant défriché et ajoutez-le à un nouveau tube de microcentrifuge. Évitez toute matière granulé tout en transférant le liquide surnageant. Jeter les matériaux granulé.
5. Quantifier la teneur en protéines de l’échantillon par dosage de l’acide (BCA) bicinchoninic, à l’aide du protocole par le fabricant. Pour effectuer le test, diluer l’échantillon 01:50 dans 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Analyser chaque échantillon en double exemplaire.
   Remarque : Utiliser 1 x PBS dans tout le protocole, sauf indication contraire. En moyenne, 200 µL de sérum clarifié ou plasma (après 18 000 x g) rapportera 15 mg de protéines totales. Autres types d’échantillons, avec une teneur en protéines inférieure ou supérieure, peuvent exiger des dilutions de BCA supplémentaires.
6. Aliquote 10 mg de l’échantillon dans un nouveau tube de microcentrifuge. La concentration obtenue à l’étape 1.5 permet de calculer le volume correspondant d’échantillon. Portion de l’échantillon à l’aide d’une pipette de 200 µL.
   Remarque : Il est recommandé de stocker l’échantillon restant à-80 ° C. Utilisation de l’échantillon dans différents tubes à 10 mg par tube d’éviter les gel-dégel plusieurs cycles à l’avenir aliquote.

2. la digestion des protéines sanguines Non-exosomal

Remarque : L’étape de digestion est conçue pour réduire les protéines non-exosomal qui peuvent purifier conjointement avec les exosomes. Si conservation des protéines de surface exosome est requise pour les analyses en aval, il devrait être tenu compte du fait que cette étape est susceptible d’interférer avec cette analyse. La détection de l’exosomal CD63, une protéine de surface-exposé tétraspanines, n’était pas significativement négativement touchée par ce processus.

1. Préparer la solution de protéinase K à une concentration de 500 µg/mL dans du PBS. Ajouter la quantité correspondante de protéinase K dans un tube à fond conique. Puis ajouter de la mémoire tampon et vortexer pendant 30 s, 3 fois à température ambiante.
2. Ajouter 50 µL de solution de protéinase K à l’aliquote d’échantillon de 10 mg et mélanger doucement en pipettant également, et descendre à l’aide d’une pipette µL 200.
3. Incuber les échantillons à 37 ° C au bain-marie pendant 30 min. Place le tube dans un portoir de flotteur et éviter une immersion complète du tube dans le bain d’eau pour éviter les éventuelles "fuites".
4. Transférer l’échantillon et portoir flottant à un bain-marie à 60 ° C pendant 10 min, pour inactiver la protéinase K.

3. retrait de petites protéines et des Peptides par Ultrafiltration centrifugeuse

1. Rincer un dispositif d’ultrafiltration contenant 100 kDa poids moléculaire limite (MWCO) filtre avec préalable de PBS à utiliser. Ce faire ajouter 500 µL de PBS au filtre, à l’aide d’une pipette 1 000 µL. Faites tourner l’appareil à 3 700 x g pendant 5 min. Jetez toute rétentat restant ainsi que l’éluat.
   Remarque : La capacité du volume de l’appareil d’ultrafiltration échantillon doit être de 0,5 et 4 mL pour s’assurer que le volume de l’échantillon réduit final de 50 µL est réalisable.
2. Prenez l’exemple de l’étape 2.4 et augmenter le volume de 500 µL en ajoutant des PBS. Déposer l’échantillon dans le dispositif d’ultrafiltration rincés au préalable.
   Remarque : En moyenne, le volume de l’échantillon de l’étape 2.4 est 185 µL (120 à 150 µL de l’échantillon et 50 µL de solution de protéinase K).
3. Placer le dispositif d’ultrafiltration dans une centrifugeuse de paillasse angle fixe à 3 700 x g à 4 ° C jusqu'à ce que l’échantillon a réduire à un volume de 50 µL.
   Mise en garde : Lors de l’utilisation de dispositifs d’ultrafiltration avec l’arrêt de mort volume, il faut pour éviter la dessiccation complète, de la membrane filtrante durant les étapes de centrifugation.
4. Ajouter 500 µL de PBS directement dans la membrane filtrante et la pipette de monter et descendre 5 fois. Centrifuger comme à l’étape 3.3. Effectuez cette étape de lavage 3 fois au total.
5. Transférer le rétentat final 50 µL dans un nouveau tube de microcentrifuge.
6. Rincer le filtre membrane avec 200 µL PBS, pipetage de haut en bas 10 fois et transférer le lavage dans le tube de l’étape 3.5.
7. Placez le porte-filtre dans la position inverse dans un nouveau tube. Exécuter une rotation inverse la récupération pendant 5 min à 2 000 x g pour récupérer l’échantillon restant de la membrane. Piscine l’échantillon avec l’exemple de l’étape 3.5.

4. la purification des vésicules par chromatographie d’Exclusion (s)

1. Ajouter 850 µL de solution aqueuse de SEC, avec des perles ayant un MWCO de 700 kDa, dans une colonne de flux de gravité vide, plafonnés à l’aide d’une pipette 1 000 µL. Placer les colonnes dans un format rack approprié muni d’un plateau d’égouttement.
2. Déboucher le bas de la colonne et laisser le drain liquide pendant 5 min. Une fois égouttées, ajouter 10 mL de PBS pour laver la résine. Laisser 20 min pour le lavage s’écouler de la colonne.
3. Placer le concentré, protéinase K traitées échantillon de l’étape 3.5 dans un tube conique de 15 mL et augmenter le volume de l’échantillon de 5 mL ajouter PBS avec une pipette sérologique. Mélanger le tube doucement en balançant pendant 1 min et ensuite appliquer lentement l’échantillon à la colonne préparée à l’étape 4.2 avec une pipette sérologique.
   Remarque : Une fois le cap de la colonne est supprimée, l’échantillon va s’écouler par le biais de la résine par gravité ; l’échantillon de 5 mL transitera complètement la colonne en 10 min.
4. Recueillir le débit à travers dans un nouveau tube conique de 15 mL.
5. À l’aide d’une pipette sérologique, appliquer le matériel collecté à la résine de nouveau pour enlever tout matériel restant inférieure à 700 kDa.
6. Recueillir le débit à travers dans un nouveau tube conique de 15 mL. Laver la résine deux fois ajoutant 1 mL de PBS. Recueillir le débit à travers dans le tube de l’étape 4.5 ; le volume final total sera d’environ 7 mL.
   Remarque : Après l’étape 4.6, l’échantillon sera dilué environ 35 fois depuis le volume de l’échantillon original ; les étapes suivantes vont réduire le volume et concentrer l’échantillon de l’exosome purifiée.

5. la concentration des Exosomes purifiée et Quantification des protéines totales

1. Rincer un dispositif d’ultrafiltration avec un filtre MWCO 3 kDa avant de PBS d’utiliser, comme indiqué au point 3.1.
2. Ajouter l’exemple de l’étape 4.6 dans le dispositif d’ultrafiltration et centrifuger dans un rotor oscillant-seau à 3 700 x g à 4 ° C. Mémoire tampon va passer à travers le filtre et peut être mis au rebut. Conservera les exosomes concentré au-dessus du filtre. Centrifuger l’échantillon jusqu'à ce que le volume au-dessus du filtre (rétentat) est réduit à 200 µL.
3. Transférer le rétentat dans un nouveau tube de microcentrifuge.
4. Rincer le filtre membrane avec 200 µL PBS en pipettant également sur la membrane de 10 fois et transférer le lavage dans le tube de l’étape 5.3. Ceci permettra la collecte d’un échantillon de l’exosome résiduelle.
5. Apportez volume jusqu'à 500 µL de l’échantillon en ajoutant des PBS. La composition de pipetage lentement monter et descendre de 10 fois.
   Remarque : Le protocole peut être suspendu ici. Échantillons doivent être conservés à 4 ° C durant la nuit ou à-20 /-80 ° C pour l’entreposage à long terme.
6. Quantifier la teneur en protéines de l’échantillon par dosage de la BCA, en utilisant le protocole par le fabricant. Diluer l’échantillon 01:10 et 01:50 dans du PBS. Exécuter chaque échantillon en double exemplaire.
   Remarque : À partir de 10 mg de protéines de sérum ou de plasma, le rendement de protéine totale dans les exosomes purifiées de point 5.6 est, en moyenne, 150 µg. dilutions supplémentaires peuvent être nécessaires si les échantillons autres que le sérum ou le plasma sont utilisés ; rendement peut varier avec le type d’échantillon.

6. quantification et dimensionnement des Exosomes de nanoparticules suivi d’analyse (NTA)

1. Ajouter 5 µg d’exosomes purifiée (tel que quantifié dans 5.6) à 1 mL de PBS et vortexer pendant 15 s sur vitesse moyenne-basse.
   1. Placer l’échantillon dans une seringue de 1 mL. Le cas échéant, définir la seringue dans une pompe à seringue automatique définie à injecter l’échantillon de l’exosome dilué à raison de 30 µL/min.
   2. Effectuer des mesures de NTA en utilisant les paramètres de capture vidéo : écran gain de niveau 3-4 et appareil photo de 12-13.
   3. Définir le script d’analyse à exécuter trois répétitions techniques pendant au moins 30 s en utilisant un débit constant pour chaque répétition. Pour l’analyse, définissez le seuil de capture à 5.
      Remarque : Informations sur l’utilisation de la seringue automatique et paramètres de capture vidéo sont disponibles dans la référence¹³. Paramètres de capture et d’analyse pour le NTA doivent être respectées dans les trois différents échantillons pour assurer la comparabilité.

7. détermination de la réduction de la protéine Soluble

1. Ajouter 1 à 10 µg d’exosomes purifiée au tampon échantillon SDS et effectuer sur gel de polyacrylamide (PAGE) en utilisant un Gel de Bis-Tris de 4 à 12 % dans 1 SDD x MES tampon pendant 35 min à 200 V. transfert résolu des protéines à une membrane de nitrocellulose 0,2 µm en appliquant une tension o f 50 V pour 1 à 1,5 h. analyse par western blot Perform pour évaluer la présence d’albumine, apolipoprotéines A et B et le marqueur de l’exosome CD 63 suivant des méthodologies standard.
   Remarque : Protocoles complets pour les méthodes 7.1 se trouvent dans la référence¹⁴; plus précisément, SP007 : exécutant des gels de polyacrylamide et SP011 : Protocole de transfert de Western.
2. Séparer les 10 µg d’exosomes purifiée à l’aide de PAGE comme au point 7.1 et tacher les bandes de protéines à l’aide de colorant bleu de coomassie, suivant les recommandations standards, pour visualiser les variations protéiques et réduction entre les échantillons.
   Remarque : Plus de détails concernant le protocole de transfert western spécifiques aux CD63 sont décrits par Diaz et al. ¹⁵

Résultats

Les données présentées ci-dessous ont été obtenues en utilisant des échantillons de sérum et le plasma de cinq donneurs de sang en bonne santé. Pour déterminer les effets de chaque étape du traitement, cinq variantes du protocole présenté ont été réalisés, et suppression de protéine récupération et non-exosome exosome ont été comparés. Les méthodes d’essai inclus : 1) SEC 700 kDa + Ultrafiltration 3 kDa ; 2) ultrafiltration 100 kDa ; 3) protéinase K + Ultrafil...

Discussion

Une méthode optimisée pour augmenter la pureté et le rendement des exosomes de sang augmentera la capacité à la mienne avec précision les vésicules extracellulaires comme source de biomarqueurs pour plusieurs maladies. Les méthodes standard actuellement utilisés pour isoler les exosomes, plus précisément, ultracentrifugation et les méthodes de précipitation, ont plusieurs inconvénients dont exosome agrégation et enrobage de protéines solubles^7,17<...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nanosight	Malvern	NS300
Benchtop microcentrifuge	Thermo	Legend Mico21
Benchtop centrifuge	Beckman Coulter	Allegra 6R
Waterbath	Benchmark	B2000-4
Microplate reader	BIOTEK	Epoch
Pierce BCA Protein Assay Kit	THERMO	23227
Micro BCA Protein Assay Kit	THERMO	23235
Phosphate buffered saline	Corning	21-040-CV
96 well plate	Corning	15705-066
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane	EMD-Millipore	UFC510096
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units	EMD-Millipore	UFC800324
Capto Core 700	GE Healthcare	17548103
Poly-Prep Chromatography Columns	BIORAD	7311550
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels	THERMO	NP0323BOX
Nitrocellulose Membrane, Roll, 0.2 µm	BIORAD	1620112
Proteinase K, Tritirachium album	EMD-Millipore	539480
SimplyBlue SafeStain	THERMO	LC6065
SIGMAFAST BCIP/NBT	Millipore-SIGMA	B5655
4-Chloro-1-naphthol	Millipore-SIGMA	C6788
Anti-CD63 Antibody (rabbit anti-human) with goat anti-rabbit HRP secondary antibody	SYSTEM BIOSCIENCES	EXOAB-CD63A-1	Primary and secondary antibodies
ALB Antibody (F-10)	SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.	sc-271605	Primary antibody
apoB Antibody (C1.4)	SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.	sc-13538	Primary antibody
apoA-I Antibody (B-10)	SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.	sc-376818	Primary antibody