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Resumen

Muestras de parafina-encajado formalina-fijos representan una valiosa fuente de biomarcadores moleculares de las enfermedades humanas. Aquí presentamos un protocolo de preparación Biblioteca de cDNA en laboratorio, inicialmente diseñado con ARN congelado fresco y optimizado para el análisis de los microRNAs de tejidos almacenan hasta 35 años.

Resumen

– Archivar, clasificar clínicamente formalina-fijo tejidos parafina-encajados de (FFPE) pueden prever ácidos nucleicos estudios moleculares del desarrollo del cáncer. Mediante el uso de no-invasiva lesiones malignas o premalignas en pacientes que posteriormente desarrollan enfermedad invasiva, análisis de expresión génica podrán ayudar a identificar alteraciones moleculares tempranas que predisponen al riesgo de cáncer. Se ha descrito también que los ácidos nucleicos de los tejidos FFPE han sufrido graves daños y modificaciones químicas, que dificultan su análisis y generalmente requiere ensayos adaptados. MicroRNAs (miRNAs), sin embargo, que representan una pequeña clase de moléculas de ARN que abarca sólo a ~ 18-24 nucleótidos, se han demostrado para soportar el almacenamiento a largo plazo y se han analizado con éxito en muestras FFPE. Aquí presentamos un 3' con código de barras ADN (cDNA) Biblioteca preparación Protocolo complementario específicamente optimizado para el análisis de small RNAs extraído de tejidos archivados, que recientemente fue demostrado para ser robusto y altamente reproducible cuando uso de archivada especímenes clínicos almacenados hasta por 35 años. Esta preparación de biblioteca se adapta bien al análisis multiplex de material comprometido/degradados donde las muestras de RNA (hasta 18) ligadas con los adaptadores de código de barras individual de 3' y entonces agruparon para posteriores preparaciones enzimáticas y bioquímicas antes del análisis. Se realizan purificaciones todos por electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE), que permite selecciones específicas de tamaño y riquezas de especies pequeñas de RNA con código de barras. Esta preparación de la biblioteca de cDNA se adapta bien a minuto entradas de RNA, como una reacción en cadena de piloto de la polimerasa (PCR) permite la determinación de un ciclo de amplificación específica para producir cantidades óptimas de material para la secuenciación de próxima generación (NGS). Este enfoque se ha optimizado para el uso de degradados de FFPE de ARN de muestras archivadas de hasta 35 años y proporciona datos NGS altamente reproducibles.

Introducción

miRNAs son notablemente bien conservadas en formalina-fijo parafina-encajado (FFPE) muestras1,2,3. Trabajo previo ha demostrado que la expresión de estos cortos no codificantes solo trenzado RNA moléculas reguladoras puede ser evaluado con éxito utilizando ARN total de las muestras FFPE y proporcionar datos de expresión de genes relevantes en comparación con el fresco original los tejidos4,5,6,7,8. En comparación con el tamaño grande mensajero RNAs, que han demostrado ser afectados críticamente por FFPE procesamiento de tejido (formaldehído, calor, desecación, etc.), RNasas endógenas y la edad de las muestras, el tamaño pequeño de miRNAs (~ 18-24 nucleótidos) parece hacerlos resistentes al almacenamiento a largo plazo, también se demostró mediante estudios de expresión de miRNA que superan los estudios de mRNA de alto rendimiento en especímenes archivados9y resistente a la degradación. estudios de expresión de miRNA utilizando muestras clínicas archivadas, que en su mayoría se han realizado análisis en pequeña escala, han demostrado que solo o multiplexado ensayos PCR cuantitativos, diferentes tipos de tecnologías microarrays y más recientemente NGS puede utilizarse para evaluar la expresión de miRNAs conservada después de la optimización de estos ensayos10,11,12,13,14.

Dado que la desregulación de la expresión del miRNA se ha asociado con el desarrollo de una variedad de malignidades humanas y que es potencialmente una fuente enorme de clínico anotado muestras archivadas, se ha puesto de manifiesto que estos ARN pequeño las moléculas representan una fuente prometedora de potenciales biomarcadores de cáncer15,16,de17,18. El uso de una tecnología de expresión de gen de alto rendimiento como NGS tiene la ventaja de proporcionar una evaluación global de todas las transcripciones de miRNA en comparación con tecnologías específicas tales como PCR y microarrays de19. Por esta razón, se ha optimizado un protocolo optimizado, asequible y fácilmente aplicable para la preparación de la biblioteca del cDNA de ARNs pequeños de más viejos especímenes archivados para NGS para estudios a gran escala20.

Anteriormente establecimos un protocolo de extracción de ARN/ADN simultánea para recuperación separada de ARN y ADN de ejemplares archivados más viejos, que hemos encontrado para superar a kits comerciales contemporáneo21. Utilizando este protocolo de extracción, para obtener el ARN total de tejidos FFPE archivados durante un período prolongado de tiempo, hemos optimizado la preparación de las bibliotecas de cDNA para NGS de miRNAs conservado en las muestras clínicas de hasta 35 años. Además, en un estudio recientemente publicado donde preparamos las bibliotecas de cDNA de clasificados clínicamente carcinoma ductal en situ muestras (CDIS), identificamos diferencialmente expresado miRNAs que fueron validados por PCR cuantitativa, que indica que cambios de expresión de miRNA específico pueden ser detectables en las lesiones de CDIS de los pacientes que desarrollan cáncer de mama en comparación con las lesiones de CDIS de los pacientes que desarrollan cáncer de mama.

Teniendo en cuenta el costo de los kits comerciales para la preparación de pequeñas bibliotecas de cDNA RNA, el potencial de su interrupción, así como el uso de reactivos protegidas por derechos de autor/patentes que no se pueden optimizar, decidimos adaptar previamente publicados en laboratorio y sin kit de 3' barras cDNA biblioteca preparación protocolo para NGS de small RNAs en especímenes FFPE, lo que permite el análisis simultáneo de 18 muestras de22. Este protocolo proporciona un procedimiento paso a paso ideal y robusto con puestos de control de evaluación visual y técnico, que eran críticos para la adaptación a las muestras de RNA FFPE, y tiene un gran potencial para su aplicación a otras fuentes de peligro o dificultad utilizar material de RNA. Aplicabilidad del protocolo original fue mejorada mediante la sustitución de marcadores de tamaño radiactivo marcado con fluorescente (p. ej., oro de SYBR) detectable RNA tamaño los marcadores usados durante la selección de bibliotecas ligadas en geles de poliacrilamida grandes. Este protocolo optimizado se basa en la ligación de código de barras adaptadores de 3' a 18 muestras individuales de FFPE ARN, que son luego agruparon para someterse a la ligadura de 5' adaptador, reverso-transcripción y un piloto análisis PCR para amplificación del cDNA final adaptado biblioteca antes de la amplificación, purificación y NGS a gran escala de PCR en un secuenciador de alto rendimiento.

Protocolo

1. preparación de los reactivos e imprimaciones

  1. Ordenar todos los cebadores y adaptadores como se describe en la figura 1.
  2. Preparar el calibrador stock cóctel, que se enriquecieron en la ligadura de cada individuo.
    1. Resuspender el oligonucleótido portador (figura 1) a 0,5 μm con agua libre de ARNasa. Resuspender los oligonucleótidos calibrador 10 (figura 1) a 100 μm usando la solución de oligonucleótidos 0,5 μm portador.
    2. Combinar 10 μl de cada uno de los 10 calibradores en una microcentrífuga siliconado para obtener un stock de calibrador cóctel 100 μm y preparar una solución de nM 0.026 para almacenar a-20 ° C.
  3. Diluir los adenylated única, liofilizada, 20 3' adaptadores con agua libre de ARNasa a una concentración final de 50 μm (figura 1).
    Nota: Se recomienda preparar alícuotas μl 2,5 de cada adaptador de tubos de siliconado individuales y almacenarlas a-80 ° C hasta por 2 años.
  4. Resuspender el nt-19 3 desalado ' adaptador y 24 nt-3' oligonucleótidos de marcador de tamaño de adaptador a 250 ng/mL (figura 1).
  5. Resuspender el HPLC purificada 5' adaptador de 100 μm con agua libre de ARNasa. Resuspender los cebadores PCR de 5' y 3' a 100 μm con agua libre de ARNasa (figura 1).
    Nota: Alícuota oligonucleótidos todos en cantidades necesarias para los experimentos 1 y 2 y tienda a-80 ° C.
  6. Preparar la poliacrilamida desnaturalizantes (PAA) gel colorante de carga combinando 98.8% formamida, 1% (v/v) 0.5 M de Na2H2 EDTA, pH 8.0 y azul de bromofenol 0,2% y establecer alícuotas de 1 mL a-80 ° C.
    1. Preparar la solución de EDTA de 0,5 M Na2H2 agregando 18,6 g de Na2H2 EDTA polvo para 50 mL de agua libre de nucleasa. Añadir NaOH pellets para llegar a pH 8.0. Ajustar el volumen a 100 mL para obtener 0,5 M Na2H2 EDTA, solución pH 8.0.
    2. Pesan 15 mg de bromofenol azul en un tubo separado 15 mL. Añadir 600 μl de agua libre de nucleasa. Añadir 14,25 mL de formamida desionizada. Añadir 150 μL de 0,5 M Na2H2 EDTA, solución pH 8.0.
    3. Alícuota de la solución final de la PAA de 15 mL en alícuotas de 1 mL a-80 ° C.
  7. Preparar el 5 x tinte de carga mediante la combinación de azul de bromofenol 0,2% 0,2% xileno cyanol FF, EDTA 50 mM Na2H2 , pH 8.0 y 20% de gel de agarosa tipo Ficoll-400.
    1. Resuspender 1,86 g de Na2H2-EDTA en 50 mL de agua libre de nucleasas en un vaso de precipitados de 400 mL en un agitador magnético a temperatura ambiente (RT). Agregar pastillas de NaOH para alcanzar un pH de 8.0. Añadir agua libre de nucleasa para llegar a 100 mL para obtener una solución de EDTA Na2H2 de 50 mM.
    2. Pesar 2 g de polvo de tipo Ficoll-400, 20 mg de azul de bromofenol en polvo y 20 mg de xileno cyanol FF polvo y resuspender en 5 mL de 50 mM de Na2H2 EDTA.
    3. Mezclar el tubo que contiene tres tintes y añadir 5 mL de 50 mM Na2H2 EDTA. Mezclar el tinte 5 carga de gel de x agarose, preparar alícuotas de 1 mL y guardar a-80 ° C.

2. establecer 3' barras adaptador trompas con 18 muestras individuales de ARN

  1. Identificar 18 muestras individuales de RNA (pre-aliquoted en 100 ng en 9,5 μl de agua libre de nucleasas en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL siliconado) y coloque los tubos en hielo para descongelar durante 10 minutos.
  2. Prepare los 10 x fresco ARN ligasa Buffer (sin ATP).
    1. En un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL siliconado, combinan 343 μl de agua libre de ARNasa, 500 μl de Tris 1 M pH 7,5, 100 μl de 1 M de MgCl2, 50 μl de 20 mg/mL de seroalbúmina bovina y 7 μl de 14 M 2-Mercaptoetanol. Mix de sacudiendo el tubo, centrifugar durante 2 s a 2.000 x g y RT y el hielo.
      Nota: Todos los pasos de este protocolo que indican "centrífuga de 2 s" se realizan en una microcentrífuga de sobremesa en RT y una velocidad máxima de 2.000 x g para recoger soluciones en la parte inferior de los tubos.
  3. Preparar 50% stock acuosa de DMSO añadiendo 1 mL de libre de Rnasa agua a 1 mL de DMSO en un tubo de microcentrífuga de 2 mL siliconado, envuelva el tubo en papel aluminio y almacenar a TA.
  4. Descongelar el 0,026 nM calibrador cóctel en hielo durante 10 minutos Prepare la mezcla maestra de ligadura combinando en el siguiente orden en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL siliconado: 40 μl de 10 x Buffer de ARN ligasa y 120 μl de DMSO acuosa 50% con una pipeta de 200 mL , y añadir 10 μl de calibrador de nM 0.026 coctel utilizando una pipeta de 10 μl. Quitar el tubo de 1,5 mL para mezclar, centrifugar durante 2 s y establecer que en el hielo.
  5. Añadir 8,5 μl de ligadura Master Mix a cada una de las 18 muestras de ARN FFPE individualmente alícuotas, chasquear suavemente los tubos, centrifugar durante 2 s y el almacén en el hielo.
  6. Descongelación 2,5 alícuotas de μl de cada uno de los adaptadores de código de barras 3' 18 y coloque en hielo para descongelar durante 20 minutos.
    1. Utilice una pipeta de 3 μl a 1 μl de cada adaptador de transferencia a las muestras de RNA FFPE correspondientes que contiene RNA y ligadura de Master Mix (es decir, 9,5 μl + 8,5 μl).
    2. No pipetee hacia arriba y hacia abajo, simplemente dispensar en el líquido y tire de la punta. Asegúrese de cambiar consejos entre las muestras de RNA FFPE. Cierre cada tubo, flick para mezclar, centrifugar durante 2 s y el hielo.
  7. Desnaturalizar las reacciones mediante la colocación de los tubos de 18 en un bloque de calor a 90 ° C por 1 min y luego colocar inmediatamente en hielo.
  8. Preparar la ligadura enzima solución diluyendo 10 μl de truncado K227Q T4 RNA ligasa 2 con 10 μl de ARNasa-sin agua en un tubo de microcentrífuga 1.5ml fresco siliconado.
  9. Usar una pipeta de 3 μL para transferir 1 μl de la enzima diluida la ligadura a cada una de las 18 muestras de RNA (no pipetear arriba y abajo y cambiar consejos entre cada tubo). El 18 trompas en hielo y colocar en una habitación fría de 4 ° C para una incubación durante la noche de 18 h.

3. purificación de los RNAs pequeños ligados

  1. Desactivar las reacciones de ligadura colocando los 18 tubos para 1 minuto en un bloque de calor a 90 ° C y luego volver a hielo por al menos 2 min enfriar.
  2. Preparar la mezcla maestra de precipitación mediante la adición de 1 μl de colorante azul covalente a glucógeno a 26 μl de NaCl 5 M libre de ARNasas en un tubo de microcentrífuga siliconado fresco.
    1. Transferencia de 1,2 μl de la mezcla maestra de precipitación en cada uno de los tubos de 18. Añadir 63 μl de etanol al 100% a cada uno de los tubos de 18. Cierre cada tubo, flick para mezclar, centrifugar durante 2 s y el lugar de los tubos en hielo. Combinar el contenido de todos los tubos de 18 en un tubo de 1.5ml solo siliconado.
    2. Cerrar el tubo, invertir tres veces para mezclar, centrifugar por 2 s y el lugar en el hielo durante 60 min precipitar.
  3. Preparar un gel de poliacrilamida al 15% (16 x 20 cm2) gran página.
    1. Dos molde siliconado placas de vidrio (tratadas con una alternativa segura a las capas de silano) con espaciadores de 0,1 cm.
    2. Se combinan 9 mL de diluyente de sistema, 18 mL de concentrado de sistema, 3 mL de tampón del sistema, 240 μl de APS (9%) y 12 μl de TEMED en un tubo de 50 mL.
    3. La página gel solución entre placas de cristal utilizando una pipeta de 30 mL, coloque un peine bien 14 (0,1 cm de grosor) y que el gel solidifique a temperatura ambiente durante 30 minutos.
  4. Centrifugar el tubo de 1,5 mL con las trompas agrupados en 16.000 x g y 4 ° C durante 60 minutos.
  5. Retire el peine. Limpie los pozos abundantemente con agua libre de ARNasa usando un frasco rociador con una punta de 200 μL al final para acceder al interior de los pozos y fuerza de acrilamida no polimerizada (un bien a la vez) sobre un fregadero. Establece el 15% página sobre un aparato de gel, los embalses se llenan de 0,5 x solución de Tris borato EDTA (TBE) y funcionamiento previo el gel por 30 min a 450 V.
  6. Recuperar el tubo con trompas combinados de la centrifugadora y seque cuidadosamente el pellet de RNA.
    1. Quite el sobrenadante con una pipeta de 1 mL sino dejar un poco de líquido en la parte inferior. Incline el tubo y utilice una pipeta de 20 mL para retirar el sobrenadante restante sin tocar el sedimento. Vacío de succión del tubo utilizando una pipeta Pasteur con una punta de 10 μL en su extremo, sin tocar el sedimento.
    2. Resuspender el precipitado de RNA en 20 μl de agua libre de ARNasa por agitando el tubo. Añadir 20 μl del gel PAA cargar solución para Resuspender el ARN, flick para mezclar, centrifugar durante 2 RT, sentó y fija el tubo a 90 º c por 1 min y luego coloca inmediatamente en hielo.
  7. X TBE reemplazar el 0.5 del aparato del gel fresco 0,5 x TBE y carga la escalera, de marcadores de tamaño y miRNAs ligados en el centro del gel, dejando pozos 2-vacío en ambos lados (figura 2).
  8. Correr el gel a 450 V (35 mA) de 60 minutos, hacer una pausa en el plazo de 10 minutos se enfríe y vuelva a ejecutar a 520 V (25 mA) para otro 60 min Uncast 15% página quitando una de las placas de vidrio.
  9. Rocíe ligeramente el gel en la placa de vidrio con la solución colorante fluorescente (10 μl) en 25 mL de 0,5 x TBE y deje sentarse plano por 5 min en la oscuridad.
  10. Ponga el vaso con el gel en un transiluminador de luz azul y alinear ambos 19 nt y marcadores de tamaño nt 24 con una regla para dirigir la supresión de los RNAs pequeños ligados (figura 2). Suprimir el gel.
  11. Coloque el gel suprimido en un tubo de 0,5 mL, diseñado a rodajas de gel, colocados de manera segura en un tubo de microcentrífuga siliconado de 1,5 mL. Centrifugar a 16.000 x g durante 3 min a RT. Resuspender el gel fragmentado con 300 μL de solución de NaCl de 400 mM, cierre el tubo y sellar con la película de parafina.
  12. Coloque el tubo en agitación en un Termomezcladores a 1.100 rpm en cuarto frío de 4 ° C para una incubación durante la noche (16-17 h).

4. ligadura del adaptador 5'

  1. La solución y gel fragmentada a un filtro de 5 μm tubo sentado en un tubo de 1,5 mL siliconado, sellar con la película de parafina y centrifugar durante 5 min a 2.300 x g y RT.
  2. Añadir a 950 μl de etanol al 100% a la solución filtrada, cerrar el tubo, invierta para mezclar, centrifugar durante 2 s, sellar el tubo con la película de parafina y en hielo durante 1 hora.
  3. Preparar una página de gel como se describe en el paso 3.3 el 12%, pero combinar 12,6 mL de diluyente, 14,4 mL de concentrado, 3 mL de tampón, 240 μl APS y 12 μl de TEMED en un tubo de 50 mL. Funcionamiento previo el 12% gel página durante 30 min a 450 V (~ 35 mA) en 0.5 x TBE.
  4. Centrifugue la solución purificada de RNA pequeño a 16.000 x g durante 60 min a 4 ° C.
  5. Pipetee cuidadosamente hacia fuera el sobrenadante con una pipeta de 1 mL para eliminar la mayor parte de la solución y utilice una pipeta de 200 mL para eliminar la solución restante, sin tocar el sedimento.
  6. Utilizando una pipeta Pasteur con una punta de 10 mL en su extremo conectado a un frasco de vacío, seque cuidadosamente el sedimento sin tocarlo.
  7. Resuspender el precipitado en 9 μl de agua libre de ARNasa sin pipeteo arriba y abajo, pero por sacudiendo ligeramente el tubo, centrifugar durante 2 s y establecer el tubo en hielo.
  8. Preparar 10 x fresco ARN ligasa Buffer (con ATP) mediante la combinación de 500 μl de 1 M Tris pH 7,5, acetilado de 100 μl de 1 M de MgCl2, 50 μl de 20 mg/mL BSA, 200 μL de 10 mM ATP, 7 μl de 2-Mercaptoetanol 14 M y 143 μl de agua libre de ARNasa.
  9. Mezcle 10 x Buffer de RNA ligasa (con ATP) sacudiendo el tubo y centrifugar durante 2 s para recoger la solución en la parte inferior del tubo.
  10. Establecer la ligadura 5' adaptador por añadir 2 μl de 10 x Buffer de RNA ligasa (con ATP), 1 μl de 100 μm 5' adaptador y 6 μl 50% DMSO acuosas a la 9 μl, 3' con código de barras pequeño RNA solución.
  11. Película el tubo suavemente para mezclar, centrifugar durante 2 s para recoger la solución, coloque el tubo en un bloque de calor a 90 ° C por 1 min y en hielo durante al menos 2 minutos.
  12. Añadir 2 μl de T4 RNA ligasa 1 en la solución (no pipetear arriba y abajo), mueva el tubo, centrifugar durante 2 s y sientan el tubo flotante estante en un baño de agua de 37 ° C durante 60 minutos.
  13. Al mismo tiempo, establecer dos trompas entre el nt-19 3' adaptador y el adaptador de 5' y dos trompas entre el nt-24 3' adaptador y el adaptador de 5'.
    1. Combinar 2 μl de la 19nt-3' adaptador (250 ng/μL) o nt-24 3' adaptador (250 ng/μL) con: 2 μl del 5' adaptador (100 μm), 2 μl de 10 x Buffer de RNA ligasa (con ATP), 6 μl de DMSO acuosas de 50%, 6 μl de agua libre de ARNasa y 2 μl de T4 RNA ligasa 1 en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL siliconado.
    2. Los tubos para mezclar, centrifugar durante 2 s y el conjunto de la película los tubos a 37 ° C durante 60 minutos.
  14. Añadir 20 μl de tampón de desnaturalización del PAA a los trompas (purificada small RNAs, 2 trompas con 19nt-3' adaptador y 2 trompas con 24nt-3' adaptador).
    1. Mix de chasquear los tubos, centrifugar durante 2 s, incubar los tubos en un bloque de calor a 90 ° C durante 1 minuto transferencia todos los tubos de hielo y preparar una escalera (3 mL de escalera con 20 μl de PAA).
  15. Vaciar el depósito superior del aparato del gel con el funcionamiento previo 12% PAGE gel y fresca solución x TBE 0.5 por debajo del nivel de los pozos (los pozos se vacían con una pipeta de punta larga y fina).
    1. Cargar las muestras con una pipeta fina, como se describe en la figura 3.
    2. Uso fresco 0.5 x TBE para llenar los pozos en la parte superior del gel.
    3. Añadir fresco 0.5 x TBE al embalse por encima de los pozos y comenzar la electroforesis del 12% Página durante 60 min a 450 V (~ 35 mA).
    4. Detener el funcionamiento apagando el generador durante 10 minutos enfriar el gel. Reiniciar el generador y el gel durante 60 min en 520 V (~ 25 mA).
  16. Pare el generador, vaciar los embalses invirtiendo el aparato encima de un fregadero y uncast 12% Página quitando una de las placas de vidrio.
  17. Sentarse el vidrio con el plano de gel, spray gel con 10 μl de colorante fluorescente en 25 mL 0.5 x TBE, incubar en la oscuridad para 5 minutos poner el vidrio con el gel en un transiluminador de luz azul y alinear ambos 19 nt y ambos los 24 nt tamaño marcadores con una regla para dirigir la supresión de los RNAs pequeños ligados (figura 3).
    1. Suprimir el gel y transferencia de la pieza extirpada gel en un tubo de 0,5 mL gel interruptor. Cierre la tapa del tubo del interruptor gel, set en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL siliconado y seguro con la película de parafina. Retire el tubo del gel de interruptor, añada 300 μL de 300 mM de NaCl y 1 μl de 100 μm 3' PCR primer a las piezas de gel machacado en un tubo de 1,5 mL.
    2. Sellar el tubo con la película de parafina en agitación en un Termomezcladores a 1.100 rpm a 4 ° C, durante la noche (17 a 18 h) en una cámara fría.

5. reversa de la transcripción del 5' ligada y 3' con código de barras pequeño RNAs purificados

  1. Recuperar el tubo del filtro y Termomezcladores purificar la solución con un tubo de filtro de 5 μm.
    1. Uso una pipeta de 1 mL para transferir la solución a un tubo de filtro de 5 μm insertado en un 1.5 mL silicona tubo de la colección libre de Rnasa. Centrifugar el tubo durante 3 min a 2.300 x g y RT.
    2. Desechar el tubo del filtro y agregar 950 μl de etanol al 100% para el tubo de colección de microcentrífuga de 1,5 mL que contiene la solución filtrada. Invertir el tubo para mezclar, centrifugar durante 2 s y el lugar en el hielo para precipitado de RNA de pellets por centrifugación del tubo a 16.000 x g y 4 ° C por 1 h de 60 min.
  2. Secar el pellet de RNA.
    1. Abra la tapa y retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta de 1 mL, dejando un poco de líquido en la parte inferior.
    2. Use una pipeta de 20 μl para quitar todo el sobrenadante restante sin tocar el sedimento. Inclinar el tubo para dejar cualquier solución en el lado opuesto de la pelotilla.
    3. Utilice una pipeta Pasteur con una pipeta sin filtrar 10 mL para aspirar el sobrenadante y secar el pellet con un vacío.
  3. Resuspender el precipitado de RNA en 5.6 μl de agua libre de ARNasa.
    1. Descongelar los reactivos de transcripción inversa en el hielo durante 15 min conjunto hasta una reacción reversa de la transcripción mediante la adición de 3 μl de 5 x Buffer, μl 4,2 de 10 x deoxynucleotide trifosfato (dNTPs) (cada 2 mM) y 1,5 μl de Ditiotreitol (DTT) a la 5.6 μl de ARNasa-libre resuspendido.
    2. Mueva suavemente el tubo para mezclar la reacción y centrifugar durante 2 s para recoger la solución. Establecer la reacción en un bloque de calor a 90 ° C exactamente 30 s y luego transfiera directamente a Termomezcladores a 50 ° C.
    3. Dejar el tubo en el Termomezcladores de 2 minutos para que la temperatura iguala. Añadir 0,75 μl de la enzima de la transcripción inversa directamente en la solución, flick suavemente para mezclar y el tubo de nuevo Termomezcladores a 50 ° C por 30 min inmediatamente.
  4. Después de 30 min, transferir el tubo a un bloque térmico a 95 ° C durante 1 minuto detener la transcripción inversa. Agregue 95 μl de agua libre de ARNasa directamente a la transcripción inversa, quitar el tubo para mezclar y directamente en hielo durante 2 minutos.
  5. Etiquetar el tubo con el cDNA biblioteca Stock y biblioteca ID.

6. piloto de PCR y amplificación de la polimerización en cadena a gran escala

  1. Se prepara fresca 10 x PCR buffer por adición 304 μl de agua libre de ARNasa, 125 μl de 2 M de KCl, 50 μl de 1 M Tris pH 8.0, 10 μl de 1 M de MgCl2, 5 μl de 1% Tritón X-100 y 6 μl de 2-Mercaptoetanol de 1 M en un tubo de microcentrífuga siliconado y mantener a TA.
  2. Montar la reacción de PCR piloto combinando 67 μl de agua libre de ARNasa, 10 μl de 10 x PCR Buffer, 10 μl de 10 x dNTPs, 0.5 μl de 100 μm 5' PCR primer, 0.5 μl de 100 μm 3' PCR primer, 10 μl de cDNA biblioteca Stock y 2 μl de 50 x Taq polimerasa.
    1. Configurar dos PCR ciclos en un termociclador como sigue: archivo 1: 94 ° C por 45 s, 50 ° C 85 s y 72 ° C durante 60 s para 10 ciclos, mantener a 4 ° C; Archivo 2: 94 ° C por 45 s, 50 ° C para la 85 s y 72 ° C durante 60 s durante 2 ciclos, mantener a 4 ° C. Configurar la reacción de PCR de piloto en el termociclador y empezar a 1 archivo.
    2. En el final del archivo 1, abra el tubo PCR, y usando una pipeta de 20 μl, transferir 12 μl de la reacción de PCR de piloto en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL que contiene 3 μl de 5 x gel carga colorante, mezclar mediante pipeteo arriba y abajo, cierre el tubo y asígnele la etiqueta "10 ciclos".
    3. Cierre el tubo de PCR de piloto y empezar el archivo 2 en un termociclador. En el final del archivo 2, abrir el tubo PCR y utilizar una pipeta de 20 mL para transferir 12 μl de la solución en el tubo de microcentrífuga de 1,5 mL con 3 μl de 5 x gel colorante de carga y etiquételo "12 ciclos".
    4. Repita los pasos descritos en los pasos 6.2.2 y 6.2.3 para recoger los productos PCR 12 μl de la reacción de PCR de piloto en ciclos PCR 14, 16, 18 y 20. Agregar 3 μl de 5 x carga de gel colorante a cada una de las alícuotas PCR 12 μl y a la escalera 20 de nt que contiene 3 μl de escalera y 9 μl de agua libre de ARNasa.
  3. Preparar un gel de agarosa al 2,5% con 0.5 x TBE.
    1. Pesar 2,5 g de agarosa en un vaso limpio y añadir 100 mL de 0.5 x TBE. Calentar la solución en el microondas hasta que hierva. Retirar la solución del microondas, agitar la botella para mezclar la agarosa, añadir 4 μL de bromuro de etidio (10 mg/mL) y transferir la solución a una bandeja de electroforesis2 7 x 10 cm, cerrada en ambos extremos con cinta.
    2. Establecer un peine de 8 pozos y permitir que el gel de agarosa a solidificar en la transferencia de RT. gel de la agarosa solidificada en un aparato de electroforesis llenado de 0.5 x TBE.
  4. Cargue la escalera y las muestras PCR en el gel de agarosa y correr durante 30 min a 120 V.
  5. Evaluar el gel en una caja de la UV para identificar el ciclo óptimo de PCR (Figura 4A).
    Nota: El tamaño de las bandas PCR esperados se muestra en la Figura 4B.
    1. Observar las dos bandas PCR en cada uno de los diferentes pozos (banda superior: biblioteca de ADN, banda inferior: dímeros de cartilla).
    2. Identificar el adecuado ciclo PCR para la amplificación de cDNA por seleccionar el ciclo donde la biblioteca de cDNA es visible, pero los dimeros de primer apenas observable.
      Nota: Generalmente, se selecciona el adecuado ciclo PCR entre 12-16 ciclos. En la Figura 4A, el adecuado ciclo PCR para esta biblioteca es 14.
  6. Establecer las reacciones de polimerización en cadena a gran escala (6 x 100 μL) para la purificación de biblioteca del gel de agarosa.
    1. Preparar un fresco tubo de 10 x PCR Buffer siguiente paso 6.1.
    2. Preparar la mezcla de PCR Master a gran escala en un tubo de 1,5 mL combinando 435.5 μl de agua libre de ARNasa, 65 μl de tampón de x PCR 10, 65 μl de 10 x dNTPs, 3.25 μl de 5' cartilla de PCR, 3.25 μl de PCR primer de 3' y pipeteo arriba y abajo para mezclar.
    3. Transferir 88 μl PCR Master Mix en seis tubos PCR de 0,5 mL. Transferir 10 μl de cDNA biblioteca Stock (almacenado en hielo), añadir 2 μl de la polimerasa x Taq 50 en cada uno de los 6 tubos PCR y pipeta para mezclar.
    4. Preparar un tubo de reacción de PCR negativo combinando 77 μl de libre de Rnasa agua, 10 μl de tampón de x PCR 10, 10 μl de 10 x dNTPs, 0.5 μl de 5' primer PCR, 0,5 μl de la cartilla PCR de 3' y 2 μl de 50 x Taq polimerasa y pipeta para mezclar.
    5. Colocar los tubos PCR en el termociclador con el ciclo PCR se describe en el paso 6.2.1 y establecer el número óptimo de ciclos de amplificación. Preparar un gel de agarosa al 2,5% con 0,5 x TBE, como se describe en el paso 6.3.
  7. Después de la amplificación por PCR, transferir 9 μl de cada tubo PCR en seis tubos de microcentrífuga de 1,5 mL que contiene 3 μl de 5 x gel colorante de carga.
    1. Preparar 20 escalera nt combinando 3 mL de escalera en 9 μl de agua libre de ARNasa y agregar gel de 3 μl carga de tinte en un tubo de 1,5 mL.
    2. Carga de la escalera, control negativo de PCR y 6 productos de la PCR en el gel de agarosa y correr el gel por 30 min a 120 V.
    3. Verificar la uniformidad de las amplificaciones de PCR entre los carriles en una caja de UV (tomar una imagen).
    4. Combinar 3 reacciones de PCR en dos tubo de microcentrífuga de 1,5 mL siliconado (μL 3 x 91), agregar 27 μl de 5 M NaCl y 950 μl de etanol al 100%. Invierta los tubos para mezclar y ajustar a-20 ° C durante la noche para precipitar los productos PCR.

7. cDNA biblioteca purificación y evaluación

  1. Centrifugar los tubos con las reacciones de PCR a 16.000 x g durante 60 min a 4 ° C.
  2. Quite el sobrenadante con una pipeta de 1 mL, luego incline el tubo con el diábolo en la parte superior y el líquido en la parte inferior y utilice una pipeta Pasteur conectada a un matraz de vacío con una bañera y aspirar cuidadosamente el líquido con una punta de 10 mL en el extremo de la pipeta de Pasteur.
  3. Configurar el PmeI digest.
    1. Suspender uno de los pellets PCR con 17.5 μl de agua libre de nucleasas y resuspendido de transferencia a la segunda pastilla PCR. Añadir 2 μl de 10 x Buffer y 0,5 μl de enzima PmeI y el resumen en un baño de agua durante 2 h a 37 ° C.
    2. Preparar un gel de agarosa al 2,5% con 0.5 x TBE (paso 6.3). Añadir 6 μl de 5 x tinte gel carga la digestión. Transfiera 13 μl de cada Resumen en dos pozos adyacentes del gel de agarosa, la escalera de tamaño nt 20 en los pozos de la final de la carga y ejecutar el gel durante 90 minutos a 150 V (figura 4).
    3. Suprimir las bandas PCR superiores del gel en la caja de la UV, transferir las piezas de gel en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL recién pesado y pesar las piezas de gel sobre una escala.
  4. Purificar la biblioteca de cDNA amplificado PCR suprimida usando un kit de extracción de gel siguiendo las instrucciones del fabricante. Cuantificar la biblioteca del cDNA usando un análisis de cuantificación de ADN y el instrumento, siguiendo las instrucciones del fabricante.
  5. Evaluar el tamaño y la pureza de la biblioteca de ADNc con un chip de ADN de alta sensibilidad en un equipo Bioanalyzer (figura 5). Secuencia de la biblioteca de cDNA utilizando un sistema de alto rendimiento. Transferir el fichero FASTQ a la tubería de RNAworld para el ajuste del adaptador y alineación para el genoma humano para identificar las secuencias de miRNA.

Resultados

Como se describe en el método, un total de 18 muestras individuales de ARN FFPE (100 ng cada) se colocan en tubos separados a 3' adenylated con código de barras del oligonucleótido T4 la ligadura durante la noche. Al día siguiente, las reacciones enzimáticas son desactivados por calor combinadas y precipitadas en un solo tubo. Se resuspendió el pellet de RNA y las moléculas de ARN ligadas están separadas en un gel de poliacrilamida (PAGE), donde se utilizan marcadores de RNA del o...

Discusión

Un protocolo de preparación de biblioteca de cDNA altamente reproducible y robusto para NGS de small RNAs en muestras de ARN FFPE se presenta en el presente Protocolo, que es una versión modificada y optimizada del procedimiento descrito por Hafner et al. 22

Todos los pasos de este protocolo han sido optimizados para el uso con mayores archivado y comprometido ARN total recuperado de muestras FFPE. El paso fundamental de este protocolo, para el procesamiento ...

Divulgaciones

Los autores desean revelar que una publicación que contiene algunos de los datos presentados en este manuscrito fue publicada en la revista internacional de Ciencias moleculares por Loudig et al. 21.

Agradecimientos

Agradecemos al Dr. Thomas Tuschl, jefe del laboratorio de biología molecular de RNA, así como los miembros de su laboratorio por su apoyo y por compartir la tecnología desarrollada en su laboratorio, proporcionando acceso a la tubería de RNAworld. También agradecemos a Dr. Markus Hafner para compartir su Protocolo y proporcionar descripciones detalladas sobre todos los pasos bioquímicos y enzimáticos utilizados en su procedimiento inicial.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
1% Triton x-100InvitrogenHFH10
10mM ATPAmbionAM8110G
10X dNTPsAmbionAM8110G
10x TBEThermofisher Scientific15581044
14M MercaptoethanolSigmaO3445I-100
20 nt ladderJena BioscienceM-232S
20mg/ml Bovine Serum AlbumineSigmaB8894-5ML
50X Titanium TaqClontech Laboratories639208
Ammonium PersulfateFisher Scientific7727-54-0
BRL Vertical Gel Electrophoresis System with glass plates and combsGIBCOV16
Dimethyl sulfoxide (DMSO)SigmaD9170-5VL
Eppendorf microcentrifuge 5424RUSA scientific4054-4537Q
Eppndorf ThermomixerUSA scientific4053-8223Q
Fisherbrand™ Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5mlFisher Scientific02-681-320
Gel Breaker Tube 0.5 mlIST Engineering Inc,3388-100
Gel electrophoresis apparatus 7cm x10cm- Mini-sub Cell GT with gel trays and combsBiorad1704446
GlycoblueAmbionAM9516
Jersey-CoteLabScientific, Inc1188
KcL 2MAmbionAM9640G
MgCl2 1MAmbionAM9530G
Minifuge dual rotor personal centrifugeUSA scientific2641-0016
Model V16 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus, glasses, combs, and spacersCiore Life Science21070010
OligonucleotidesIDTDefined during order
Owl EasyCast B2 mini electrophoresis system- with gel trays and combsThermofisher ScientificB2
Qiaquick Gel Extraction kitQiagen28704
Restriction enzyme PmeINEBR0560S
RNase-free waterAmbionAM9932
Safe Imager 2.0Life TechnologiesG6600
Safe Imager 2.0 blue light transilluminatorThermofisherG6600
SeaKem LE agaroseLonza50002
Superscript III reverse transcription kitInvitrogen18080-044
SybrGoldLife TechnologiesS11494
T4 RNA Ligase 1NEBM0204S
T4 RNA Ligase 2 Truncated K227QNEB0351L
TEMEDFisher ScientificO3446I-100
Themocycler with heated lidApplied Biosystem4359659
Tris 1M pH 7.5Invitrogen15567027
Tris 1M pH8.0AmbionAM9855G
UltraPure Sequagel system concentrate, diluent, and bufferNational DiagnosticsEC-833

Referencias

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