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摘要

福尔马林固定石蜡镶嵌标本是人类疾病分子生物标志物的宝贵来源。在这里, 我们提出了一个基于实验室的 cDNA 文库准备协议, 最初是用新鲜的冷冻 RNA 设计的, 并对35年内储存的 microRNAs 进行了优化分析。

摘要

–Archived, 临床分类的福尔马林固定石蜡 (FFPE) 组织可以提供核酸的回顾性分子研究癌症的发展。通过使用晚期侵袭性疾病患者的非侵袭性或前恶性病变, 基因表达分析可以帮助识别易患癌症风险的早期分子改变。已经很好的描述, 从 FFPE 组织恢复的核酸发生了严重的物理损伤和化学修饰, 这使得他们的分析困难, 一般需要适应的化验。MicroRNAs (miRNAs), 但是, 它代表了一个小类 RNA 分子跨越只有18–24核苷酸, 已被证明经得起长期储存, 并已成功地分析了 FFPE 样品。在这里, 我们提出了一个 3 ' 条形码互补 DNA (cDNA) 库准备协议, 专门为分析从存档组织提取的小 rna, 最近证明是健壮的和高度重复使用存档临床标本贮存35年。此库准备很好地适应了被破坏/退化材料的多重分析, 其中 RNA 样品 (最多 18) 被结扎与单独 3 ' 条形码适配器, 然后汇集在一起为随后酵素和生化准备在分析之前。所有纯化都是由聚丙烯酰胺凝胶电泳 (页), 它允许大小特定的选择和充实的条形码小 RNA 品种。这种 cDNA 文库的制备很好地适应了微小的 RNA 输入, 作为一个先导聚合酶链反应 (PCR) 允许确定一个特定的放大周期, 以产生最佳数量的材料, 为下一代测序 ()。这一方法的优化, 以使用退化的 FFPE RNA 的标本归档了长达35年, 并提供了高度重现性的数据。

引言

miRNAs 在福尔马林固定石蜡嵌入 (FFPE) 标本中保存得非常好,1,2,3。以往的研究表明, 这些短的监管非编码单链 rna 分子的表达可以成功地评估使用总 RNA 从 FFPE 样本, 并提供相关的基因表达数据时, 与原始新鲜组织4,5,6,7,8。当与大尺寸信使 rna 相比, 这已被证明是严重影响的 FFPE 组织处理 (甲醛, 热, 脱水,等), 内源性 RNases, 和年龄的标本, 小规模的 miRNAs (~ 18–24核苷酸) 似乎使它们耐降解和弹性的长期储存, 也证明通过 miRNA 表达研究, 优于高通量 mRNA 研究的存档标本9。miRNA 表达研究使用已存档的临床标本, 主要是在小规模分析中进行的, 证明了单一或多路定量 PCR 检测, 不同类型的微阵列技术, 最近的用于评估保存的 miRNAs 在这些化验的优化后的表达式10,11,12,13,14。

鉴于 miRNA 表达的失调与各种人类恶性肿瘤的发展有关, 而且有可能大量提供临床上标注的存档标本, 这已经变得明显, 这些小 RNA分子代表了潜在的癌症标志物的一个有希望的来源15,16,17,18。使用高通量基因表达技术 (如 miRNA) 的优点是, 当与 PCR 和/或微阵列19的目标技术相比较时, 可以对所有的转录记录进行全局评估。由于这个原因, 一个优化的, 负担得起的和易于适用的基因 cDNA 文库的协议, 从较旧的存档标本中制备小 rna 的方法进行了优化, 以实现大规模的回顾性研究20。

我们以前建立了一个同时 rna/dna 提取协议, 以分离恢复的 rna 和 dna 从旧的存档标本, 我们发现优于当代商业套件21。利用该提取协议, 从存档的 FFPE 组织中获取总 RNA, 对临床标本中保存的 miRNAs 的基因文库进行了35年的优化制备。此外, 在最近发表的一项研究中, 我们从临床分类导管癌原位(DCIS) 标本中制备了 cDNA 文库, 我们确定了定量 PCR 验证的差异表达 miRNAs, 表明这种特定的 miRNA 表达的变化可能是可检测到 DCIS 病变的患者谁发展乳腺癌时相比, DCIS 病变的病人谁不发展乳腺癌。

考虑到制作小 RNA cDNA 文库的商业套件的成本, 其终止的可能性, 以及使用版权/专利保护的试剂, 无法优化, 我们决定调整以前出版的基于实验室和无试剂盒的 3 ' 条形码 cDNA 文库在 FFPE 标本中存档的小 rna 的制备方案, 允许同时分析18个样本22。该议定书提供了一个理想和稳健的分步程序, 具有视觉和技术评估检查点, 这对于适应 FFPE RNA 标本是至关重要的, 并且具有很强的应用潜力, 可用于其他来源的损害或困难使用 RNA 材料。通过使用荧光 (例如、SYBR 金) 可检测到大型聚丙烯酰胺凝胶上结扎库的放射性标记尺寸标记, 改进了原始协议的适用性。这一优化的协议依赖于 3 ' 条形码适配器结扎18个单独的 FFPE RNA 标本, 然后汇集在一起进行 5 ' 适配器结扎, 反向转录, 和一个先导 PCR 分析, 以量身定制放大最终 cDNA图书馆在大规模的 PCR 放大, 纯化, 并在高通量排序器。

研究方案

1. 所有试剂和底漆的制备

  1. 按照图 1中的说明, 订购所有底漆和适配器。
  2. 准备校准鸡尾酒的股票, 这将是在每个单独结扎的尖刺。
    1. 将载波寡核苷酸 (图 1) 并用重悬为0.5 µM, RNase 无水。使用0.5 µM 载波寡核苷酸解决方案, 将10校验和寡核苷酸 (图 1) 并用重悬为100µM。
    2. 将渗离心中的每个校准器的10µL 组合在一起, 获得100µM 鸡尾酒校验仪库存, 并准备 0.026 nM 溶液以存放在-20 摄氏度。
  3. 稀释20独特的, 冻干, adenylated 3 ' 适配器与 RNase 的水, 最终集中50µM (图 1)。
    注: 建议在单个渗管中准备2.5 µL 整除数, 并将其存储在-80 摄氏度, 最多2年。
  4. 并用重悬淡化 19 nt-3 适配器和 24 nt-3 适配器大小标记寡核苷酸为 250 ng/毫升(图 1)。
  5. 并用重悬高效液相色谱纯化 5 ' 适配器至100µM, RNAse 无水。并用重悬 5 ' 和 3 ' PCR 引物到100µM 使用无 RNase 水(图 1)。
    注: 整除所有寡核苷酸的数量为-80 摄氏度的实验和贮存所需的金额。
  6. 将98.8% 甲酰胺、1% (v/v) 0.5 米 Na2H2 EDTA、pH 值8.0 和0.2% 溴酚蓝组合成聚丙烯酰胺变性 (临机) 凝胶负载染料, 并设置1毫升整除数-80 摄氏度。
    1. 在0.5 米 na2H2 edta 溶液中加入18.6 克的 na2H2 edta 粉到50毫升的无核酸酶水。加入氢氧化钠丸, 达到 pH 值8.0。调整音量为100毫升, 以获得0.5 米 Na2H2 EDTA, pH 8.0 库存解决方案。
    2. 在一个单独的15毫升管中重15毫克的溴酚蓝色。添加600µL 的无核酸酶水。加入14.25 毫升的脱电离甲酰胺。添加150µL 0.5 米 Na2H2 EDTA, pH 8.0 溶液。
    3. 整除在1毫升整除数-80 摄氏度的15毫升的临机局最终解决方案。
  7. 用0.2% 溴酚蓝、0.2% 二甲苯蓝 FF、50毫米 Na 2 H 2 EDTA、pH 8.0 和 20% Ficoll Type-400 的组合制备5x 琼脂糖凝胶负载染料.
    1. 并用重悬1.86 克的Na2H2-在室温 (RT) 的磁性搅拌器上, 在400毫升的烧杯中, 核酸酶50毫升的无水的 EDTA。加入氢氧化钠丸, 达到 pH 值8.0。添加无核酸酶水达到100毫升, 以获得50毫米 Na 2 H 2 EDTA 溶液.
    2. 重20毫克溴酚蓝粉, 20 毫克二甲苯蓝 FF 粉, 2 克 Ficoll Type-400 粉, 并用重悬5毫升 50毫米Na 2 H 2 EDTA.
    3. 涡流管含有三染料, 并添加5毫升50毫米 Na2H2 EDTA。混合5x 琼脂糖凝胶加载染料, 准备1毫升整除数, 并存储在-80 摄氏度。

2. 设置 3 ' 条形码适配器结扎18个单独的 RNA 样本

  1. 在1.5 毫升渗离心管中, 确定18个单独的 RNA 标本 (前 aliquoted 在 100 ng, 9.5 µL 核酸酶无水), 并设置冰上的管以解冻10分钟。
  2. 准备 10x RNA 连接酶缓冲 (没有 ATP) 新鲜。
    1. 在1.5 毫升渗离心管, 结合343µL RNase 水, 500 µL 1 M pH 7.5, 100 µL 1 m 氯化镁2, 50 毫克/毫升牛血清白蛋白, 20 µL 7 米14µL。混合通过弹管, 离心机为 2 s 在 2000 x g 和 RT, 并设置在冰上。
      注: 本协议中指示 "2 s 离心机" 的所有步骤均在 RT 台式离心中执行, 最高速度为 2000 x g, 以收集管道底部的解决方案。
  3. 在2毫升渗离心管中加入1毫升的 RNase 水到1毫升的亚砜, 用铝箔包裹管, 并贮存在 RT 中, 制备50% 水基亚砜。
  4. 在冰上解冻 0.026 nM 校准剂鸡尾酒10分钟. 在1.5 毫升渗离心管中结合以下顺序, 准备结扎大师组合:40 µL 10x RNA 连接酶缓冲器和120µL 50% 水中亚砜使用200毫升吸管, 并添加10µL 0.026 nM 校准鸡尾酒使用10µL 吸管。轻拍1.5 毫升管混合, 离心机为2秒, 并设置在冰上。
  5. 添加8.5 µL 结扎主混合到每18个单独 aliquoted FFPE RNA 样品, 轻轻地轻拍管, 离心机 2, 并储存在冰上。
  6. 除霜2.5 µL 整除数从每一个 18, 3 ' 条形码适配器和放在冰上解冻20分钟。
    1. 使用3µL 吸管将每个适配器的1µL 转移到相应的 FFPE rna 样本中, 其中包含 rna 和结扎主混合 (即、9.5 µL + 8.5 µL)。
    2. 不要把吸管向上和向下, 简单地放进液体中, 拉出尖端。请务必改变 FFPE RNA 样品之间的提示。关闭每管, 轻拍混合, 离心机 2 s, 并设置在冰上。
  7. 变性反应通过放置18管在一个热块90°c 1 分钟, 然后立即放置在冰上。
  8. 通过稀释10µL 截 K227Q T4 RNA 连接酶2与10µL 无 RNase 的水成新鲜1.5 毫升渗离心管, 准备结扎酶溶液。
  9. 使用3µL 吸管将稀释结扎酶的1µL 转移到18个 RNA 样本中 (不要上下吸液, 并在每管之间改变提示)。设置18结扎冰和地方在4°c 冷室过夜孵化18小时。

3. 结扎小 rna 的纯化

  1. 在90摄氏度的热量块上放置18管1分钟, 然后恢复到冰至少2分钟, 以降温, 使结扎反应停用。
  2. 通过添加1µL 的蓝色染料共价键链接到糖原到26µL 5 米 RNase 无盐的氯化钠成一个新鲜的渗离心管, 准备沉淀大师混合。
    1. 转移1.2 µL 的沉淀大师混合到每一个18管。在18管中添加63µL 100% 乙醇。关闭每管, 轻拍混合, 离心机2秒, 并把管子放在冰上。将所有18管的内容合并为一个1.5 毫升的渗管。
    2. 关闭管, 反转三次混合, 离心机为2秒, 并放置在冰上60分钟沉淀。
  3. 准备一大 (16 x 20 厘米2) 15% 聚丙烯酰胺凝胶页。
    1. 铸造两个渗玻璃板 (处理与一个安全的替代硅烷涂层) 与0.1 厘米垫片。
    2. 结合9毫升的系统稀释剂, 18 毫升的系统浓缩, 3 毫升的系统缓冲器, 240 µL 的 APS (9%), 12 µL 的 TEMED 在50毫升管。
    3. 用30毫升的吸管在玻璃板之间转移页面凝胶溶液, 插入 14-井梳 (0.1 厘米厚), 让凝胶在 RT 上凝固30分钟。
  4. 离心1.5 毫升管与汇集结扎在 1.6万 x g 和4°c 为60分钟。
  5. 取下梳子。用带有200µL 尖端的喷瓶在井内 RNase, 并在水槽上方用力将不聚合的丙烯酰胺挤出 (一次井), 用无水的清水清洁水井。在凝胶装置上设置15% 页, 用0.5x 三硼酸 EDTA 溶液填充储层, 并在 450 v 前运行凝胶30分钟。
  6. 从离心机中回收结扎的管, 并仔细干燥 RNA 颗粒。
    1. 用1毫升的吸管尖去掉上清, 但在底部留一些液体。倾斜的管和使用20毫升吸管去除剩余的上清, 不接触颗粒。真空吸入管使用一个巴斯德吸管与10µL 尖端在它的末端, 不接触颗粒。
    2. 并用重悬在20µL 的 RNase 水中通过弹管将 RNA 颗粒释放出来。添加20µL 凝胶加载溶液并用重悬 RNA, 轻拍混合, 离心机 2 sat, 并设置在90ºC 1 分钟, 然后立即放置在冰上的管。
  7. 更换0.5x 的凝胶装置与新鲜 0.5x, 并加载梯子, 大小标志, 并结扎 miRNAs 在中心的凝胶, 留下 2-空井两侧 (图 2)。
  8. 在 450 v (35 mA) 上运行凝胶60分钟, 暂停运行10分钟降温, 并再次运行在 520 V (25 mA) 为另一个60分钟 Uncast 15% 页通过删除其中一个玻璃板材。
  9. 用荧光染料溶液 (10 µL) 在25毫升0.5x 的玻璃板上轻轻喷洒凝胶, 让它在黑暗中坐平5分钟。
  10. 将玻璃与凝胶放在蓝光 transilluminator 上, 并将 19 nt 和 24 nt 大小标记与标尺对齐, 以指示结扎的小 rna (图 2) 的切除。把凝胶。
  11. 将切除后的凝胶放在0.5 毫升管中, 设计成碎片凝胶切片, 安全地放置在1.5 毫升渗离心管中。离心机以 1.6万 x g 为3分钟在 RT. 并用重悬用300µL 400 毫米 NaCl 溶液的碎片凝胶, 关闭管, 并用石蜡膜密封。
  12. 在4摄氏度寒冷的房间里, 用 1100 rpm 的 thermomixer 在一夜间孵化 (16-17 小时) 上设置管。

4. 结扎 5 ' 适配器

  1. 将溶液和零碎的凝胶转移到一个5µm 过滤管, 坐在1.5 毫升渗管, 密封与石蜡膜, 和离心机为5分钟在 2300 x g 和 RT。
  2. 将950µL 100% 乙醇添加到过滤溶液中, 关闭管, 倒置搅拌, 离心机为2秒, 用石蜡膜封管, 并在冰上设置 1 h。
  3. 准备12% 页凝胶如步骤3.3 所述, 但结合12.6 毫升稀释剂, 14.4 毫升精矿, 3 毫升的缓冲, 240 µL APS, 12 µL 的 TEMED 成50毫升管。预运行12% 页凝胶30分钟 450 V (35 mA) 在0.5x。
  4. 离心纯化的小 RNA 溶液在 1.6万 x g 60 分钟在4°c。
  5. 小心地用1毫升吸管取出上清液, 去除溶液的大部分, 使用200毫升的吸管除去剩余的溶液, 而不接触颗粒。
  6. 使用一个巴斯德吸管与一个10毫升尖端连接到一个真空瓶, 仔细干燥的颗粒, 而不接触它。
  7. 并用重悬在9µL 无吹打的 RNase 水中的颗粒, 但通过轻轻地弹管, 离心机为2秒, 并设置在冰上的管。
  8. 将 10x RNA 连接酶缓冲器 (用 ATP) 新鲜地结合500µL 1 米三 pH 7.5, 100 µL 1 米 MgCl2, 50 µL 20 毫克/毫升乙酰 BSA, 200 µL 10 毫米 ATP, 7 µL 2-巯基乙醇 m和143µL 的 RNase 水。
  9. 通过弹管将 10x RNA 连接酶缓冲器 (与 ATP) 混合, 并将 2 s 离心机收集到管子底部的溶液。
  10. 设置 5 ' 适配器结扎通过增加2µL 10x RNA 连接酶缓冲 (与 ATP), 1 µL 100 µM 5 ' 适配器和6µL 50% 水中亚砜到9µL, 3 ' 条形码小 RNA 解答。
  11. 轻弹管混合, 2 s 离心机收集解决方案, 将管放在90摄氏度的散热块上1分钟, 再放在冰上至少2分钟。
  12. 添加2µL 的 T4 RNA 连接酶1入溶液 (不向上和向下), 轻拍管子, 离心机为 2 s, 并且坐管子在漂浮架在37°c 水浴为60分钟。
  13. 同时, 在 19 nt-3 适配器和 5 ' 适配器之间设置两个结扎, 24 nt-3 适配器和 5 ' 适配器之间有两个结扎。
    1. 将2µL 19 nt 3 ' 适配器 (250 ng/µL) 或 24 nt-3 ' 适配器 (250 ng/µL) 合并为: 2 µL 5 ' 适配器 (100 µM), 2 µL 10x RNA 连接酶缓冲器 (与 ATP), 6 µL 50% 水中亚砜, 6 µL 无 RNase 水和2µL 的 T4 RNA 连接酶1在1.5 毫升渗离心管。
    2. 轻拍管子混合, 离心机为 2 s, 并且设置管子在37°c 为60分钟。
  14. 在所有结扎 (纯化的小 rna, 2 结扎与 19 nt 3 ' 适配器, 2 结扎与 24 nt-3 ' 适配器) 中添加20µL 的临时变性缓冲器。
    1. 混合通过弹管, 离心机为 2, 并孵化管在一个热块90°c 1 分钟. 将所有管子转移到冰上, 并准备一个梯子 (3 毫升的梯子与20µL 的临时机场)。
  15. 用预运行的12% 页凝胶清空凝胶装置的上部储层, 并在井的水平以下添加新鲜的0.5x 溶液 (水井用长而薄的针尖吸管倒空)。
    1. 如图 3所述, 用细吸管尖加载示例。
    2. 使用新鲜的 0.5x, 以填补个人水井的顶部的凝胶。
    3. 将新鲜的0.5x 到水井上的水库, 并开始12% 页电泳60分钟 450 V (35 mA)。
    4. 通过关掉发电机10分钟来暂停运行, 使凝胶降温。重新启动发电机, 并运行凝胶60分钟在 520 V (~ 25 mA)。
  16. 停止发电机, 通过反转水槽上方的设备, 清空水库, 并 uncast 12% 页, 删除其中一个玻璃板。
  17. 坐在玻璃与凝胶平, 喷雾凝胶与10µL 的荧光染料在25毫升 0.5x, 并在黑暗中孵化5分钟. 将玻璃与凝胶放在蓝光 transilluminator 上, 并将 19 nt 和 24 nt 大小标记同时对齐。指示结扎小 rna (图 3) 切除的标尺。
    1. 将凝胶和将切除后的凝胶片转移到0.5 毫升的凝胶断路器管中。关闭凝胶断路器管帽, 设置为1.5 毫升渗离心管, 并确保与石蜡膜。除去凝胶断路器管, 加入300µL 300 毫米氯化钠, 1 µL 100 µM 3 ' PCR 底漆的粉碎凝胶件在1.5 毫升管。
    2. 在一个寒冷的房间里, 在 1100 rpm 4 摄氏度的 thermomixer 上, 用石蜡膜封住管子, 在一夜 (17–18 h) 处进行搅拌。

5. 5 ' 结扎和 3 ' 条形码纯化小 rna 的反向转录

  1. 从 thermomixer 中回收管, 过滤器用5µM 滤管净化溶液。
    1. 使用1毫升吸管将溶液转移到5µM 过滤管插入到1.5 毫升渗 RNase 免费收集管。离心管3分钟, 在 2300 x g 和 RT。
    2. 丢弃过滤管并将950µL 100% 乙醇添加到含有过滤溶液的1.5 毫升离心收集管中。倒置管混合, 离心机为2秒, 并放置在冰上60分钟. 通过离心管在 1.6万 x g 和4°c 为 1 h 沉淀 RNA 颗粒。
  2. 把 RNA 颗粒干干。
    1. 打开瓶盖, 用1毫升的吸管小心地取出上清, 留下一些液体在底部。
    2. 使用20µL 吸管去除所有剩余的上清, 不接触颗粒。倾斜管, 使任何解决方案坐在对面的颗粒。
    3. 使用一个巴斯德吸管与10毫升未过滤的吸管尖端吸入上清和干燥颗粒使用真空。
  3. 并用重悬在5.6 µL 的 RNase 水中 RNA 颗粒。
    1. 在冰上解冻反向转录试剂15分钟. 通过添加3µL 5x 缓冲器, 4.2 µL 10x 核苷酸三磷酸 (dNTPs) (每2毫米), 1.5 µL dithiothreitol (德勤) 到5.6 µL 无 RNase, 设置反向转录反应。悬浮丸。
    2. 轻轻地拍打管子, 混合反应, 2 s 离心机收集溶液。在90摄氏度的热块上设置反应, 然后直接转移到 thermomixer 50 摄氏度。
    3. 把管子放在 thermomixer 上2分钟, 使温度均衡。将0.75 µL 的反向转录酶直接加入溶液中, 轻轻地搅拌, 然后将管子 thermomixer 在50摄氏度, 立即将其设置为30分钟。
  4. 30分钟后, 将管子转到95摄氏度的散热块上, 以停止反向转录。将95µL 的无 RNase 水直接添加到反向转录, 轻轻地将管混合, 并将其直接放在冰上2分钟。
  5. 用 cDNA 存储库和库 ID 标记管。

6. pcr 和大尺度 pcr 扩增

  1. 通过添加304µL 的 RNase 水, 制备新鲜的 10x PCR 缓冲液, 125 µL 2 米氯化钾, 50 µL 1 米三 pH 8.0, 10 m 氯化镁1, 2 µL 5 海卫 X-100, 1% 米6µL 在巯基乙醇渗管中的1米µL, 并保持在 RT。
  2. 结合67µL 的无 RNase 水, 组装先导 PCR 反应, 10 µL 10x PCR 缓冲液, 10 µL 10x dNTPs, 0.5 µL 100 µM 5 ' pcr 底漆, 0.5 µL 100 3 ' pcr 底漆, 10 µM 的 cDNA 库, 2 µL 的50x µL 聚合酶。
    1. 在 thermocycler 上设置两个 PCR 循环, 如下所示: 文件 1:94 °c 为四十五年代, 50 °c 八十五年代和72°c 为六十年代为10个周期, 举行在4°c;文件 2:94 °c 为四十五年代, 50 °c 八十五年代和72°c 为六十年代为2个周期, 举行在4°c。建立 thermocycler 的 PCR 反应并启动文件1。
    2. 在文件1末尾, 打开 pcr 管, 并使用20µL 吸管, 将12µL 从先导 pcr 反应转化为1.5 毫升离心管, 含3µL 5x 凝胶加载染料, 混合吹打上下, 关闭管, 并将其标记为 "10 循环"。
    3. 关闭先导 PCR 管, 并在 thermocycler 上启动文件2。在文件2的末尾, 打开 PCR 管, 并使用20毫升吸管将12µL 溶液转移到1.5 毫升离心管与3µL 的5x 凝胶加载染料, 并将其标记为 "12 循环"。
    4. 重复步骤6.2.2 和6.2.3 中描述的步骤, 从 pcr 周期14、16、18和20中的 pcr 反应中收集12µL pcr 产品。添加3µL 的5x 凝胶加载染料的每一个12µL PCR 整除数, 并到 20 nt 梯子包含3µL 的梯子和9µL 无 RNase 水。
  3. 准备2.5% 琼脂糖凝胶与0.5x。
    1. 在干净的烧杯中重2.5 克琼脂糖, 加入100毫升的0.5x。用微波炉加热溶液, 直到沸腾。从微波炉中取出溶液, 旋转瓶子混合琼脂糖, 加入 4 ul 的溴溴 (10 毫克/毫升), 并将溶液转移到 7 x 10 厘米2电泳托盘, 两端都用胶带闭合。
    2. 设置一个8井梳, 让琼脂糖凝胶固化在 RT. 将凝固的琼脂糖凝胶转化为填充0.5x 的电泳装置。
  4. 在琼脂糖凝胶上装载梯子和 PCR 样品, 并在 120 v 上运行30分钟。
  5. 评估 UV 盒上的凝胶以确定最佳 PCR 周期 (图 4A)。
    注意: 预期的 PCR 波段的大小显示在图 4B中。
    1. 观察两个不同井的 PCR 波段 (上部带: DNA 文库, 下带: 底漆脂肪酸)。
    2. 通过选择 cdna 文库可见的周期来确定 cdna 放大的适当 PCR 周期, 但底漆脂肪酸几乎看不到。
      注意: 一般情况下, 在12–16周期之间选择适当的 PCR 循环。在图 4A上, 此库的适当 PCR 周期为14。
  6. 建立了大尺度 PCR 反应 (6x 100 µL), 用于琼脂糖凝胶库的纯化。
    1. 在步骤6.1 之后, 准备一个新的 10x PCR 缓冲管。
    2. 结合435.5 µL RNase 水, 65 µL 10x pcr 缓冲器, 65 µL 10x dNTPs, 3.25 µL 5 ' pcr 底漆, 3.25 µL 3 ' pcr 底漆, 并吹打上下混合, 制备出1.5 毫升管中的大型 PCR 主组合。
    3. 将 pcr 大师组合的88µL 转移到六0.5 毫升 pcr 管中。转移10µL 的 cDNA 储存库 (储存在冰上), 添加2µL 50x Taq 聚合酶到每一个 6 PCR 管, 和吸管混合。
    4. 用77µL RNase 水、10µL pcr 缓冲器、10µL 10x dNTPs、0.5 µL 5 ' pcr 底漆、0.5 µL 3 ' pcr 底漆、2µL 的 50x Taq 聚合酶和吸管混合, 制备阴性 pcr 反应管。
    5. 使用步骤6.2.1 中描述的 pcr 循环将 pcr 管放入 thermocycler 中, 并设置最佳放大周期数。按照步骤6.3 中的描述, 用0.5x 的方法制备2.5% 琼脂糖凝胶。
  7. pcr 扩增后, 将9µL 从每一个 pcr 管转化为六1.5 毫升离心管, 含有3µL 的5x 凝胶负载染料。
    1. 通过将3毫升的梯子组合成9µL 的 RNase 水, 并将3µL 凝胶负载染料添加到1.5 毫升管中, 准备 20 nt 梯子。
    2. 将梯子、阴性 pcr 控制和 6 pcr 产品加到琼脂糖凝胶上, 在 120 v 上运行凝胶30分钟。
    3. 验证在 UV 盒上的车道上的 PCR 放大的均匀性 (取一个图像)。
    4. 将 3 PCR 反应组合成两个1.5 毫升的渗离心管 (3x 91 µL), 添加27µL 5 米氯化钠和950µL 100% 乙醇。反转管混合, 并设置在-20 °c 过夜, 以沉淀 PCR 产品。

7. cDNA 文库的纯化和评价

  1. 离心两管与 PCR 反应在 1.6万 x g 60 分钟在4°c。
  2. 用1毫升的吸管取出上清液, 然后将试管与上侧的小球和下部的液体倾斜, 然后使用一个巴斯德吸管连接到带有浴缸的真空瓶, 并在巴斯德吸管的末端吸出10毫升尖端的液体。
  3. 建立 PmeI 文摘。
    1. 并用重悬17.5 µL 的 pcr 球团之一, 核酸酶游离水, 并将悬浮颗粒转移到第二 pcr 球团。添加2µL 10x 缓冲和0.5 µL 的 PmeI 酶, 并设置在水浴中的消化2小时37°c。
    2. 用 0.5x (步骤 6.3) 制备2.5% 琼脂糖凝胶。添加6µL 的5x 凝胶加载染料到文摘。将每个摘要的13µL 转移到琼脂糖凝胶的两个相邻井中, 在末端井上装载 20 nt 大小的梯子, 并在 150 V (图 4D) 上运行90分钟的凝胶。
    3. 在 UV 盒上从凝胶上将上面的 PCR 带上, 将凝胶件转移到刚重1.5 毫升的离心管中, 并在鳞片上称量凝胶片。
  4. 在制造商的指导下, 使用凝胶萃取试剂盒纯化已切除的 PCR 扩增 cDNA 文库。按照制造商的指示, 使用 DNA 定量分析和仪器量化 cDNA 文库。
  5. 使用 Bioanalyzer 上的高灵敏度 DNA 芯片评估 cDNA 文库的大小和纯度 (图 5)。使用高通量系统对 cDNA 库进行序列处理。将 FASTQ 数据文件传输到 RNAworld 管道以进行适配器修整, 并将其与人类基因组对齐, 以确定 miRNA 序列。

结果

如本方法所述, 共有18个单独的 FFPE RNA 样本 (每100个) 被设置在单独的管中, 接受 3 ' adenylated 条形码寡核苷酸 T4 结扎过夜。第二天, 酶反应是热停用, 组合, 并沉淀在一个单一的管。rna 颗粒是悬浮和结扎 rna 分子分离在15% 变性聚丙烯酰胺凝胶 (页), 其中 RNA 寡核苷酸大小标记迁移在相邻的水井的页面凝胶, 用于选择适当大小的 3 ' 条形码小 rna (图 2)。切除...

讨论

本文提出了一种高重现性和健壮性的 cDNA 文库制备方法, 用于在 FFPE RNA 标本中存档的小 rna, 该协议是 Hafner et . 所描述的程序的修改和优化版本。22

本协议的所有步骤都已经过优化, 可用于从 FFPE 标本中恢复的较旧的存档和已损坏的总 RNA。该协议的关键步骤, 用于处理少量的 FFPE rna, 驻留在与18唯一3条形码适配器单独结扎后的所有 rna 样本 (即, 18 ?...

披露声明

作者希望披露一份载有本手稿中的一些数据的出版物是在《国际分子科学杂志》上发表的, Loudig et 。21。

致谢

我们感谢 Tuschl 博士, RNA 分子生物学实验室的主任, 以及他的实验室成员的支持和分享在他的实验室开发的技术, 并提供进入 RNAworld 管道。我们还感谢马库斯. Hafner 博士分享他的协议, 并详细描述了他的最初程序中使用的所有生化和酶步骤。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
1% Triton x-100InvitrogenHFH10
10mM ATPAmbionAM8110G
10X dNTPsAmbionAM8110G
10x TBEThermofisher Scientific15581044
14M MercaptoethanolSigmaO3445I-100
20 nt ladderJena BioscienceM-232S
20mg/ml Bovine Serum AlbumineSigmaB8894-5ML
50X Titanium TaqClontech Laboratories639208
Ammonium PersulfateFisher Scientific7727-54-0
BRL Vertical Gel Electrophoresis System with glass plates and combsGIBCOV16
Dimethyl sulfoxide (DMSO)SigmaD9170-5VL
Eppendorf microcentrifuge 5424RUSA scientific4054-4537Q
Eppndorf ThermomixerUSA scientific4053-8223Q
Fisherbrand™ Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5mlFisher Scientific02-681-320
Gel Breaker Tube 0.5 mlIST Engineering Inc,3388-100
Gel electrophoresis apparatus 7cm x10cm- Mini-sub Cell GT with gel trays and combsBiorad1704446
GlycoblueAmbionAM9516
Jersey-CoteLabScientific, Inc1188
KcL 2MAmbionAM9640G
MgCl2 1MAmbionAM9530G
Minifuge dual rotor personal centrifugeUSA scientific2641-0016
Model V16 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus, glasses, combs, and spacersCiore Life Science21070010
OligonucleotidesIDTDefined during order
Owl EasyCast B2 mini electrophoresis system- with gel trays and combsThermofisher ScientificB2
Qiaquick Gel Extraction kitQiagen28704
Restriction enzyme PmeINEBR0560S
RNase-free waterAmbionAM9932
Safe Imager 2.0Life TechnologiesG6600
Safe Imager 2.0 blue light transilluminatorThermofisherG6600
SeaKem LE agaroseLonza50002
Superscript III reverse transcription kitInvitrogen18080-044
SybrGoldLife TechnologiesS11494
T4 RNA Ligase 1NEBM0204S
T4 RNA Ligase 2 Truncated K227QNEB0351L
TEMEDFisher ScientificO3446I-100
Themocycler with heated lidApplied Biosystem4359659
Tris 1M pH 7.5Invitrogen15567027
Tris 1M pH8.0AmbionAM9855G
UltraPure Sequagel system concentrate, diluent, and bufferNational DiagnosticsEC-833

参考文献

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