JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Формалин Исправлена парафин врезанных образцы представляют собой ценный источник молекулярных биомаркеров заболеваний человека. Здесь мы представляем на базе лаборатории cDNA библиотека подготовки протокола, первоначально разработанный с свежий замороженные РНК и оптимизирован для анализа архивных микроРНК из тканей хранится до 35 лет.

Аннотация

-Архив, клинически классифицированы формалин Исправлена парафин врезанных тканей (FFPE) может обеспечить нуклеиновые кислоты для ретроспективных молекулярных исследований развития рака. С помощью неинвазивных или предварительно злокачественных поражений от пациентов, которые позже развивать инвазивное заболевание, анализ выражения гена может помочь определить ранние молекулярных изменений, которые предрасполагают к риск рака. Хорошо описал, что нуклеиновые кислоты, оправился от FFPE тканей претерпели серьезный физический ущерб и химические изменения, которые затрудняют их анализ и обычно требует адаптации анализов. МикроРНК (интерферирующим), однако, которые представляют собой небольшой класс молекул РНК, охватывающих только до ~ 18 – 24 нуклеотидов, было показано, чтобы выдерживать длительного хранения и успешно проанализирован в FFPE образцах. Здесь мы представляем 3' перепутываются взаимодополняющих ДНК — (cDNA кДНК) библиотеки подготовка протокола специально оптимизирована для анализа малых РНК, извлеченные из архивных тканей, который был недавно продемонстрирован быть надежной и высокую воспроизводимость при использовании Архив Клинические образцы хранятся до 35 лет. Эта библиотека подготовка хорошо приспособлены к мультиплекс анализ под угрозой деградации материала где лигируют с отдельными 3' перепутываются адаптеры и затем объединить вместе для последующего ферментативные и биохимических препаратов образцов РНК (до 18) Перед анализом. Электрофорез геля полиакриламида (страница), которая позволяет размер конкретным критериям и обогащения перепутываются малых РНК видов выполняются все очищения. Эта подготовка кДНК библиотеки хорошо приспособлены к минута РНК входы, как экспериментальный полимеразной цепной реакции (ПЦР) позволяет определять конкретные усилители цикла производить оптимальное количество материала для следующего поколения последовательности (НГС). Этот подход был оптимизирован для использования деградированных FFPE РНК от образцов архивирован до 35 лет и обеспечивает высокую воспроизводимость данных NGS.

Введение

интерферирующим удивительно хорошо сохраняются в формалин Исправлена парафин врезанных (FFPE) образцов1,2,3. Предыдущая работа продемонстрировала, что выражение этих коротких регулирования-кодирования одного мель молекул РНК может быть успешно оцениваются с помощью всего РНК из образцов FFPE и предоставить соответствующий ген выражение данных по сравнению с оригинальной свежие ткани4,5,6,,78. По сравнению с большого размера messenger РНК, которые показали критически пострадать от FFPE обработки тканей (формальдегид, тепла, сушки и т.д.), эндогенных полиадениновый и возраст образцов, небольшой размер интерферирующим (~ 18 – 24 нуклеотидов) появляется, чтобы сделать их устойчивыми к деградации и устойчивыми для длительного хранения, также продемонстрировал через Мирна выражение исследований, которые превосходят высок объём мРНК исследования в архивных образцов9. Мирна выражение исследования с использованием архивных клинических образцов, которые выполнялись главным образом в небольших анализов, показал что сингл или мультиплексированных количественные анализы ПЦР, различные виды технологии microarray дна и совсем недавно NGS можно использоваться для оценки выражение сохранились интерферирующим после оптимизации этих анализов10,11,12,,1314.

Учитывая, что регуляции экспрессии Мирна был связан с разработкой целого ряда злокачественных опухолей человека и что потенциально существует огромное количество клинически аннотированной архивных образцов, очевидно, что эти малые РНК молекулы представляют собой перспективный источник потенциального рака Биомаркеры15,16,17,18. Использование технологий выражение гена высокой пропускной способности, таких как NGS имеет преимущество обеспечения глобальной оценки всех Мирна стенограмм, по сравнению с целевые технологии, такие как ПЦР или microarrays19. По этой причине оптимизированная, доступным и легко применимым протокол кДНК библиотеки подготовке малых РНК от старых архивных образцов для NGS был оптимизирован для включения крупных ретроспективных исследований20.

Ранее мы создали одновременно протокол извлечения РНК/ДНК для отдельных восстановления ДНК и РНК из старых архивных образцов, которые мы нашли, чтобы превзойти современные коммерческие наборы21. Используя этот протокол извлечения для получения всего РНК из FFPE тканей в Архив для длительного периода времени, мы оптимизировали подготовку кДНК библиотек для NGS адаптивной, сохранились в клинических образцах до 35 лет. Кроме того в недавно опубликованном исследовании, где мы подготовили кДНК библиотек от клинически секретной протоковой карциномы в situ (DCIS) образцов, мы определили дифференциально выраженной адаптивной, которые были подтверждены количественного PCR, который указал что конкретные Мирна выражения изменения могут быть обнаруживаемыми в DCIS поражения от пациентов, которые развитие рака молочной железы по сравнению с DCIS поражения от пациентов, которые не развиваться рак молочной железы.

Учитывая стоимость коммерческих комплекты для подготовки малых РНК кДНК библиотек, потенциал для их прекращения, а также использование защищенных авторским правом/патент реагентов, которые не могут быть оптимизированы мы решили адаптировать ранее опубликованные на базе лаборатории и бесплатный комплект 3' перепутываются cDNA библиотека подготовки протокола для NGS малых РНК, архивируются в FFPE образцах, позволяя одновременный анализ 18 образцов22. Этот протокол обеспечивает идеальное и надежные пошаговую процедуру с визуальной и технической оценки контрольно-пропускные пункты, имеющие важное значение для адаптации к FFPE РНК образцов, и имеет большой потенциал для применения к другим источникам нарушенной или трудно чтобы использовать материал РНК. Оригинального протокола применимость была улучшена, заменив радиоактивно помечены размер маркеров флуоресцентные (например, SYBR золото) обнаружить РНК размер маркеров во время отбора перевязаны библиотек на больших полиакриламидных гелей. Этот оптимизированный протокол основывается на перевязку 3' перепутываются адаптеры для 18 отдельных образцов FFPE РНК, которые затем объединить вместе, чтобы пройти 5' адаптер перевязки, реверс транскрипции и экспериментальный анализ ПЦР для специально амплификация cDNA окончательный Библиотека до крупномасштабных амплификации PCR, очистки и NGS на секвенсор высокой пропускной способности.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. подготовка всех реагентов и праймеры

  1. Заказывайте все грунты и адаптеры, как описано в рисунке 1.
  2. Подготовьте калибратора коктейль складе, который будет шипами в каждой индивидуальной перевязки.
    1. Ресуспензируйте перевозчик олигонуклеотида (рис. 1) до 0,5 мкм с РНКазы свободной воды. Ресуспензируйте 10 калибратор олигонуклеотиды (рис. 1) до 100 мкм с помощью решения олигонуклеотида перевозчик 0,5 мкм.
    2. Комбинат 10 мкл каждого из 10 калибраторов в силицированного microcentrifuge получить 100 мкм коктейль калибратор запас и подготовить 0,026 Нм решение для хранения при температуре-20 ° C.
  3. Разбавьте 20 уникальных, лиофилизированные, adenylated 3' адаптеры РНКазы свободной водой до конечной концентрации 50 мкм (рис. 1).
    Примечание: Рекомендуется подготовить 2,5 мкл аликвоты от каждого адаптера в отдельных силицированного трубы и хранить их при температуре-80 ° C на срок до 2 лет.
  4. Ресуспензируйте обессоленной 19 nt-3' адаптер и 24 nt-3' адаптер размер маркера олигонуклеотиды 250 нг/мл (рис. 1).
  5. Ресуспензируйте ВЭЖХ очищенная 5' адаптер до 100 мкм с РНКазы свободной воды. Ресуспензируйте 5' и 3' праймеры PCR до 100 мкм с помощью РНКазы свободной воды (рис. 1).
    Примечание: Алиготе все олигонуклеотиды в количествах, необходимых для 1 – 2 экспериментов и хранить при температуре-80 ° C.
  6. Подготовка полиакриламида Денатурирующий гель (ПАА) Загрузка краситель, объединяя формамид 98,8%, 1% (v/v) 0,5 М Na2H2 ЭДТА, pH 8.0 и 0,2% бромфеноловый синий и отложите 1 мл аликвоты-80 ° c.
    1. Подготовьте решение ЭДТА 0,5 М Na2H2 , добавив 18.6 g порошка Na2H2 ЭДТА в 50 мл воды, свободной от нуклеиназы. Добавление NaOH гранулы для достижения рН 8,0. Отрегулируйте громкость до 100 мл для получения 0,5 М Na2H2 ЭДТА, рН 8,0 Стоковый раствор.
    2. Вес 15 мг бромфеноловый синий в отдельном 15 мл. 600 мкл воды, свободной от нуклеиназы. Добавьте деионизированной формамид 14.25 мл. 150 мкл 0,5 М Na2H2 ЭДТА, рН 8.0 решение.
    3. Алиготе ПАА окончательное решение по 15 мл в 1 мл аликвоты-80 ° c.
  7. Подготовить 5 x геля агарозы загрузки краситель, объединяя 0,2% бромфеноловый синий, 0,2% ксилола cyanol FF, 50 мм Na2H2 ЭДТА, рН 8,0 и 20% Ficoll тип-400.
    1. Ресуспензируйте 1,86 г Na2H2-ЭДТА в 50 мл воды, свободной от нуклеиназы в 400 мл стакан на магнитной мешалкой при комнатной температуре (RT). Добавление NaOH гранулы для достижения рН 8.0. Добавьте нуклеиназы свободной воды до 100 мл для получения 50 мм Na2H2 ЭДТА решения.
    2. Вес 20 мг порошка бромфеноловый синий, 20 мг ксилол cyanol FF порошка и 2 г порошка типа Ficoll-400 и Ресуспензируйте в 5 мл 50 мм Na2H2 ЭДТА.
    3. Вихревой трубка, содержащая три краски и добавьте 5 мл 50 мм Na2H2 ЭДТА. Mix красителя 5 Загрузка гель x agarose, готовить 1 мл аликвоты и хранить при температуре-80 ° C.

2. Установите перешнуровок перепутываются адаптер 3' с 18 отдельных РНК образцов

  1. Определить 18 отдельных образцов РНК (pre-aliquoted 100 нг в 9,5 мкл нуклеиназы свободной воды в 1,5 мл силиконизированный microcentrifuge трубы) и установить трубы на льду для размораживания за 10 мин.
  2. Подготовка 10 x буфер лигаза РНК (без АТФ) свежие.
    1. В 1,5 мл силиконизированный microcentrifuge трубку объединить 343 мкл РНКазы свободной воды, 500 мкл трис 1 М рН 7,5, 100 мкл MgCl 1 М2, 50 мкл альбумина bovine сыворотки 20 мг/мл и 7 мкл 14 M 2-меркаптоэтанол. Микс, стряхивая трубки, центрифуги для 2 s 2000 x g и RT и установить на льду.
      Примечание: Все шаги в настоящем Протоколе, которые указывают «центрифуга для 2 s» выполняются в benchtop microcentrifuge RT и максимальная скорость 2000 x g собирать решения в нижней части трубы.
  3. Подготовить 50% Водный ДМСО фондовой, добавив 1 мл РНКазы свободной воды по 1 мл ДМСО в пробки microcentrifuge 2 мл силиконизированный, обернуть трубу в алюминиевой фольги и хранить на RT.
  4. Размораживание 0,026 Нм калибратор коктейль на льду на 10 мин подготовить лигирование Мастер микс путем объединения в следующем порядке в пробки microcentrifuge 1,5 мл силиконизированный: 40 мкл 10 x буфер лигаза РНК и 120 мкл 50% водного раствора с помощью пипетки 200 мл ДМСО , и 10 мкл 0,026 Нм калибратора коктейль с помощью пипетки 10 мкл. Флик 1,5 мл трубки mix, центрифуги для 2 s и набор его на льду.
  5. 8.5 мкл лигирование Мастер микс для каждого из 18 индивидуально aliquoted образцов FFPE РНК, мягко проведите трубок, центрифуги для 2 s и магазин на льду.
  6. Размораживание 2,5 мкл аликвоты каждого из 18, 3' перепутываются адаптеров и разместить их на льду для размораживания 20 мин.
    1. Использование 3-мкл пипетки для передачи 1 мкл каждого адаптера соответствующие образцы FFPE РНК, содержащие РНК и перевязка Мастер микс (то есть, 9,5 мкл + 8,5 мкл).
    2. Не Пипетка вверх и вниз, просто обойтись в жидкость и вытащить кончик. Убедитесь в том изменить советы между образцами FFPE РНК. Закрыть каждую пробирку, Флик смешивать, центрифуги для 2 s и установить на льду.
  7. Денатурируйте реакции, поместив 18 трубок на тепла блок на 90 ° C за 1 мин и затем немедленно разместить на льду.
  8. Приготовляют раствор фермента лигирование путем разбавления 10 мкл усеченного T4 K227Q РНК лигаза 2 с 10 мкл РНКазы свободной воды в пробки microcentrifuge свежие 1,5 мл силиконизированный.
  9. Используйте 3 мкл пипетки для передачи 1 мкл разбавленного лигирование фермента в каждый из 18 проб РНК (не Пипетка вверх и вниз и изменить советы между каждой трубы). Установите 18 перешнуровок на льду и место в холодной комнате 4 ° C для ночи инкубации 18 h.

3. Очистка перевязаны малых РНК

  1. Деактивировать реакции перешнуровки, поместив 18 трубок для 1 мин на тепла блок на 90 ° C, а затем вернуться на лед для по крайней мере 2 минут остыть.
  2. Подготовьте осадков Мастер микс, добавив 1 мкл синего красителя, ковалентно связан с гликогена в 26 мкл 5 M РНКазы свободный NaCl в свежий силицированного microcentrifuge трубку.
    1. Перевод 1.2 мкл осадков Мастер микс на каждый из 18 трубок. Мкл 63 100% этанола в каждую из 18 трубок. Закрыть каждую пробирку, жестом пролистывания mix, центрифуги для 2 s и место трубы на льду. Объединяйте содержимое всех 18 трубок в одном 1,5 мл силиконизированный трубку.
    2. Закрыть трубку, инвертировать три раза, чтобы смесь, центрифуги для 2 s и место на льду на 60 минут, чтобы осадок.
  3. Подготовьте крупных геля полиакриламида 15% (16 x 20 см2) для страницы.
    1. Литой две силиконизированный стеклянные пластины (лечение с безопасной альтернативой силана покрытия) с прокладками 0,1 см.
    2. Объединить 9 мл разбавителя системы, 18 мл концентрата системы, 3 мл буферной системы, 240 мкл APS (9%), и 12 мкл TEMED в 50 мл трубки.
    3. Передача решения гелем страницы между стеклянные пластины с помощью пипетки 30 мл, вставить гребень 14-а (толщиной 0,1 см) и пусть гель затвердеть на RT 30 мин.
  4. Центрифуга для 1.5 мл трубки с пуле перешнуровок на 16000 x g и 4 ° C на 60 мин.
  5. Снимите насадку. Очистите колодцы совершенно бесплатно РНКазы водой, используя шприц бутылку с 200 мкл Совет на своем конце достичь внутри скважины и силы ООН полимеризованной акриламида выше раковина (один хорошо в то время). Набор 15% страницы на аппарат гель, заполните водохранилища с 0.5 x трис-Борат ЭДТА (КЭ) решение и предварительно запустить гель для 30 мин в 450 V.
  6. Восстановить трубу с пуле перешнуровок из центрифуги и тщательно высушить гранулы РНК.
    1. Удалить супернатант с кончиком пипетки 1 мл, но оставить некоторые жидкости в нижней. Наклона трубки и использовать пипетку 20 мл для удаления оставшихся супернатант без касатьться гранулы. Вакуумного всасывания трубку с помощью пипетки Пастера с наконечником 10-мкл на ее конце, не касаясь гранулы.
    2. Ресуспензируйте Пелле РНК в 20 мкл РНКазы свободной воды, стряхивая трубки. 20 мкл ПАА гель загрузки решения Ресуспензируйте РНК, Флик смешивать, центрифуги для 2 СБ RT и установите трубку на 90 ºC за 1 мин и затем немедленно разместить на льду.
  7. X TBE заменить 0,5 лари аппарата с свежими 0.5 x TBE и нагрузки по лестнице, размер маркеров и перевязаны интерферирующим в центре геля, оставляя 2-пустой скважин с обеих сторон (рис. 2).
  8. Побегите гель на 450 V (35 мА) для 60 мин, приостановить запуск 10 минут остыть, и снова запустить в 520 V (25 мА) для другой 60 мин Uncast 15% страницы путем удаления одной из стеклянных пластин.
  9. Слегка спрей гель, сидя на стеклянной пластине с раствором (10 мкл) Люминесцентная краска в 25 мл 0,5 х кэ и пусть это сидеть квартира для 5 мин в темноте.
  10. Положите стекло с гелем на синий свет transilluminator и выровнять оба 19 nt и 24 nt размер маркеров с правителем направлять иссечение перевязаны малых РНК (рис. 2). Акцизный геля.
  11. Место подакцизным гель в 0,5 мл трубку, призванных фрагмент гель ломтиками, надежно закреплена в 1,5 мл силицированного microcentrifuge трубку. Центрифуга на 16000 x g 3 мин на RT. Ресуспензируйте фрагментированных гель с 300 мкл 400 мм раствор NaCl, закройте трубку и запечатать его с фильм парафина.
  12. Установите трубку на агитацию на thermomixer на 1100 об/мин в холодной комнате 4 ° C для ночи инкубации (16-17 h).

4. Перевязка адаптера 5'

  1. Передача решения и фрагментированных гель 5 мкм фильтром трубки, сидя в 1,5 мл силиконизированный трубки, печать с парафином фильм и центрифуги для 5 мин при 2300 x g и RT.
  2. 950 мкл 100% этанола в отфильтрованных решение, закрыть трубку, инвертировать смешанных, центрифуги для 2 s, печать трубку с парафином фильм и установить на льду за 1 час.
  3. Подготовка 12% геля страницы, как описано в шаге 3.3, но объединить 12.6 мл разбавителя, 14,4 мл концентрата, 3 мл буфера, 240 мкл APS и TEMED 12 мкл в 50 мл трубки. Предварительно запустить 12% гель страницы для 30 мин при 450 V (~ 35 мА) в 0,5 x TBE.
  4. Центрифуга очищенный малых РНК решение на 16000 x g 60 мин при 4 ° C.
  5. Тщательно Пипетка, супернатанта, с помощью пипетки 1 мл удалить основную часть решения и использовать пипетку 200 мл для удаления оставшихся решения, не касаясь гранулы.
  6. С помощью пипетки Пастера с 10 мл кончиком в его конце, подключенных к Склянка вакуума, тщательно высушите гранулы не касаясь его.
  7. Ресуспензируйте гранулы в 9 мкл РНКазы свободной воды без закупорить вверх и вниз, но в слегка стряхивая трубки, центрифуги для 2 s и набор трубку на льду.
  8. Подготовка 10 x свежие РНК лигаза буфера (АТФ), объединив 500 мкл 1 М трис рН 7,5, 100 мкл 1 M MgCl2, 50 мкл 20 мг/мл ацетилированные BSA, 200 мкл 10 мм АТФ, 7 мкл 2-меркаптоэтанол 14 M и 143 мкл РНКазы свободной воды.
  9. Смешать 10 x РНК лигаза буфера (АТФ), стряхивая трубки и центрифуги для 2 s для сбора раствора в нижней части трубки.
  10. Настройка лигирование адаптер 5', добавив 2 мкл 10 x РНК лигаза буфера (АТФ), 1 мкл 100 µM 5' адаптер, и 6 мкл 50% Водный ДМСО на 9 мкл, 3' перепутываются малых РНК решения.
  11. Флик трубки слегка перемешайте, центрифуги для 2 s для сбора раствора, поместите трубку на тепла блок на 90 ° C в течение 1 мин и обратно на льду для по крайней мере 2 мин.
  12. 2 мкл T4 РНК лигаза 1 в раствор (не Пипетка вверх и вниз), проведите трубки, центрифуги для 2 s и сидеть, трубку в плавающей стойку в ванну воды 37 ° C 60 мин.
  13. Одновременно, созданы два перешнуровок между 19 nt-3' адаптера и адаптера 5' и два перешнуровок между 24 nt-3' адаптера и адаптера 5'.
    1. Объединить 2 мкл 19nt-3 ' адаптер (250 нг/мкл) или 24 nt-3' адаптер (250 нг/мкл): 2 мкл 5' адаптера (100 мкм), 2 мкл 10 x РНК лигаза буфера (АТФ), 6 мкл 50% Водный ДМСО, 6 мкл РНКазы свободной воды и 2 мкл в пробки microcentrifuge 1,5 мл силиконизированный T4 РНК лигаза 1.
    2. Флик трубы для mix, центрифуги для 2 s и набор трубок при 37 ° C 60 мин.
  14. 20 мкл буфера денатурации ПАА для всех перешнуровок (очищенная малых РНК, 2 перешнуровок с 19nt-3' адаптер и 2 перешнуровок с 24nt-3' адаптер).
    1. Микс, стряхивая трубы, центрифуги для 2 s и инкубировать трубы на тепла блок на 90 ° C в течение 1 мин передачи все трубы в лед и подготовить лестницы (3 мл лестницы с 20 мкл ПАА).
  15. Пустой верхнего водохранилища гель аппарата с предварительного запуска 12% страница гель и добавить свежий раствор 0,5 x TBE ниже уровня скважин (с длинные, тонкие наконечник пипетки опорожняются скважин).
    1. Загрузите образцы с тонкой пипеткой кончиком, как описано в рисунке 3.
    2. Использовать свежие 0,5 x TBE для заполнения отдельных скважин в верхнюю часть геля.
    3. Добавить свежие 0,5 x TBE в резервуар выше скважин и начать электрофорез 12% страницы для 60 мин в 450 V (~ 35 мА).
    4. Приостановите запуск путем отключения генератора 10 минут для охлаждения геля. Перезагрузите генератор и Побегите гель для 60 мин на 520 V (~ 25 мА).
  16. Остановить генератор, пустые резервуары, инвертирование аппарат выше раковина и uncast 12% страницы путем удаления одной из стеклянных пластин.
  17. Сидят стекло с плоской гель, спрей гель с 10 мкл Люминесцентную краску в 25 мл 0,5 x TBE и инкубировать в темноте за 5 мин заложить стекло с гелем на синий свет transilluminator и привести в соответствие оба 19 nt и оба 24 nt размер маркеров с правитель направлять иссечение перевязаны малых РНК (рис. 3).
    1. Акцизный гель и передачи подакцизным гель кусок в трубку выключатель гель 0,5 мл. Закройте крышку геля выключатель трубки, установить в 1,5 мл силиконизированный microcentrifuge трубку и безопасной пленкой парафина. Снять трубку выключатель гель, добавьте 300 мкл 300 мм NaCl и 1 мкл 100 мкм 3' PCR праймер части измельченных гель в 1,5 мл.
    2. Уплотнение трубки с парафином фильм на агитацию на thermomixer на 1100 об/мин при 4 ° C, на ночь (17 – 18 ч) в холодной комнате.

5. Обратная транскрипция 5' лигируют и 3' перепутываются очищенного малых РНК

  1. Извлеките трубку из thermomixer и фильтр очистки раствора с трубки фильтр 5 мкм.
    1. Использование пипетки для передачи раствор на 5 мкм фильтр трубки вставляется в 1,5 мл 1 мл силиконизированный РНКазы бесплатная коллекция трубки. Центрифуга для трубки для 3 мин при 2300 x g и RT.
    2. Отменить фильтр трубки и добавить 950 µL 100% этанола в 1,5 мл microcentrifuge коллекции пробирку, содержащую отфильтрованный раствор. Инвертируйте трубки микс, центрифуги для 2 s и место на льду на 60 мин преципитат РНК Пелле центрифугированием трубки на 16000 x g и 4 ° C на 1 час.
  2. Сухие гранулы РНК.
    1. Откройте крышку и осторожно удалить супернатант с 1 мл пипетки, оставляя некоторые жидкости в нижней.
    2. Для удаления всех оставшихся супернатант без касатьться гранулы используйте 20 мкл пипетки. Наклона трубки разрешить любое решение сесть на противоположной стороне таблетки.
    3. Использование пипетки Пастера с наконечником нефильтрованное пипетки 10 мл аспирационная супернатант и высушить гранулы с помощью вакуума.
  3. Ресуспензируйте Пелле РНК в 5,6 мкл РНКазы свободной воды.
    1. Размораживание обратной транскрипции реагентов на льду на 15 мин набор вверх реакция обратной транскрипции, добавив 3 мкл 5 x буфер, 4.2 мкл 10 x deoxynucleotide аденозинтрифосфат (дНТФ) (каждый 2 мм) и 1,5 мкл Дитиотреитол (DTT) до 5,6 мкл РНКазы-Free ресуспензированы гранул.
    2. Осторожно проведите трубки для микширования реакции и центрифуги для 2 s собрать решение. Настройка реакции на тепла блок на 90 ° C для ровно 30 s и затем передачи прямо на thermomixer на 50 ° C.
    3. Оставьте трубки на thermomixer за 2 мин, чтобы выравнивает температуру. Мкл 0,75 фермента обратной транскрипции непосредственно в раствор, Флик осторожно, чтобы смешивать и набор трубку обратно на thermomixer при 50 ° C за 30 мин немедленно.
  4. После 30 мин передать трубку блока тепла на 95 ° C в течение 1 мин остановить обратной транскрипции. 95 мкл РНКазы свободной воды непосредственно к обратной транскрипции, Флик трубки смешивать и установить его прямо на льду на 2 мин.
  5. Этикетке трубки с идентификатором cDNA фондовой библиотека и библиотека.

6. пилот ПЦР и крупномасштабных ПЦР-амплификации

  1. Подготовьте свежие 10 x PCR буфера путем добавления 304 мкл РНКазы свободной воды, 125 мкл 2 м KCl, 50 мкл 1 М трис рН 8,0, 10 мкл MgCl 1 M2, 5 мкл 1% тритон X-100 и 6 мкл 1 M 2-меркаптоэтанол в силицированного microcentrifuge трубки и держать на RT.
  2. Соберите реакции PCR пилота, объединяя 67 мкл РНКазы свободной воды, 10 мкл 10 x буфер ПЦР, 10 мкл 10 x dNTPs, 0.5 мкл 100 µM 5' PCR праймер, 0.5 мкл 100 мкм 3' PCR праймер, 10 мкл cDNA фондовой библиотека и 2 мкл 50 x Taq полимеразы.
    1. Созданы два ПЦР циклов на Термоциклер следующим: файла 1: 94 ° C для 45 s, 50 ° C для 85 s и 72 ° C для 60 s для 10 циклов, удерживайте при температуре 4 ° C; Файл 2: 94 ° C для 45 s, 50 ° C для 85 s и 72 ° C для 60 s 2 циклов, удерживайте при 4 ° C. Настройка реакции PCR пилота в Термоциклер и запуск файлов 1.
    2. В конце файла 1 Откройте ПЦР-пробирку, и с помощью пипетки 20 мкл, передачи 12 мкл от реакции PCR пилота в пробки microcentrifuge 1,5 мл, содержащие 3 мкл 5 x гель загрузки краситель, смешивать, закупорить вверх и вниз, закрыть трубку и назвать его «10 циклов».
    3. Закройте экспериментального ПЦР-пробирку и запустите файл 2 на Термоциклер. В конце файла 2 открыть ПЦР-пробирку и использовать пипетку 20 мл для передачи 12 мкл раствора в microcentrifuge 1,5 мл пробирку с 3 мкл 5 x краситель гель загрузки и назвать его «12 циклов».
    4. Повторите шаги, описанные в шагах 6.2.2 и 6.2.3 собирать 12 продукты PCR мкл от реакции PCR пилот циклов PCR, 14, 16, 18 и 20. 3 мкл 5 x краситель гель загрузки для каждого из 12 аликвоты ПЦР мкл и 20 лестнице nt содержащие 3 мкл лестницы и 9 мкл РНКазы свободной воды.
  3. Подготовить 2,5% агарозном геле с 0,5 x TBE.
    1. Весят 2,5 g агарозы в чистый стакан и добавить 100 мл 0,5 x TBE. Нагревают раствор в микроволновую печь до тех пор, пока она кипит. Удаление решения из микроволновой печи, вихрем бутылки смесь агарозы, добавить 4 мкл бромид ethidium (10 мг/мл), и решение передать электрофореза лоток2 7 x 10 см, закрыт на обоих концах с лентой.
    2. Установите гребень 8-Ну и пусть геля агарозы затвердеть на RT. передачи затвердевших агарозы гель в аппарат электрофореза, заполнены с 0,5 x TBE.
  4. Загрузить по лестнице и ПЦР пробы на геле агарозы и запустить его на 30 мин в 120 V.
  5. Оцените гель УФ поле для определения оптимального цикла PCR (рис. 4A).
    Примечание: Размер Ожидаемые диапазоны PCR показано в рисунке 4В.
    1. Соблюдать два диапазоны PCR в каждом из разных скважин (Верхняя полоса: библиотеки ДНК, Нижняя полоса: Димеры праймера).
    2. Определить адекватные цикл PCR амплификация cDNA, выбрав цикла где cDNA библиотека является видимым, но димеры праймера едва наблюдаемый объект.
      Примечание: Как правило, адекватные цикл PCR выбирается между 12-16 циклов. На рисунке 4Aадекватные цикл PCR для этой библиотеки-14.
  6. Настройка крупномасштабных ПЦР-реакции (6 x 100 мкл) для очистки библиотека геля агарозы.
    1. Подготовьте свежие тюбик 10 x буфер ПЦР, следующий шаг 6.1.
    2. Подготовьте крупномасштабные ПЦР Мастер микс в 1,5 мл, объединяя 435.5 мкл РНКазы свободной воды, 65 мкл 10 x PCR буфера, 65 мкл 10 x dNTPs, 3.25 мкл 5' PCR праймер, 3.25 мкл 3' PCR праймер и закупорить вверх и вниз, чтобы смешать.
    3. Перевод 88 мкл ПЦР Мастер микс на шесть 0.5 мл ПЦР пробирок. Передача 10 мкл cDNA фондовой библиотека (хранится на льду), 2 мкл 50 x Taq полимеразы в каждой из 6 трубок ПЦР и Пипетка смешивать.
    4. Подготовьте негативные реакции ПЦР-пробирку, объединяя 77 мкл РНКазы свободной воды, 10 мкл 10 x PCR буфера, 10 мкл 10 x dNTPs, 0.5 мкл 5' PCR праймер, 0.5 мкл 3' PCR праймер и 2 мкл 50 x Taq полимеразы и пипетки смешивать.
    5. Место описано в шаге 6.2.1 и установить оптимальное количество амплификации PCR труб в Термоциклер, используя цикл PCR циклов. Подготовить 2,5% агарозном геле с помощью 0.5 x TBE, как описано в пункте 6.3.
  7. После амплификации PCR передача 9 мкл от каждую ПЦР-пробирку в шесть 1,5 мл microcentrifuge пробирки, содержащие 3 мкл 5 x краситель гель загрузки.
    1. Подготовка 20 nt лестница, объединив 3 мл лестницы в 9 мкл РНКазы свободной воды и добавление 3 мкл гель загрузки красителя в 1,5 мл трубку.
    2. Загрузить по лестнице, отрицательный контроль ПЦР и 6 продуктов ПЦР на геле агарозы и Побегите гель для 30 мин на 120 V.
    3. Проверка однородности амплификаций PCR между полос на коробке УФ (принять изображение).
    4. Комбинат 3 ПЦР-реакции в две 1,5 мл силиконизированный microcentrifuge трубу (3 x 91 мкл), добавить 27 мкл 5 М NaCl и 950 µL 100% этанола. Инвертируйте трубы смешать и установить их при-20 ° C на ночь для продуктов PCR.

7. кДНК библиотеки очистки и оценки

  1. Центрифуга для обеих трубок с ПЦР-реакции на 16000 x g 60 мин при 4 ° C.
  2. Удалить супернатант с 1 мл пипетки, затем наклоните трубу с Пелле на верхней стороне и жидкости на нижней стороне и использовать пипетки Пастера подключен к термос с ванной и аспирационная жидкие с кончиком 10 мл в конце пипетка Пастера.
  3. Настройка дайджест PmeI.
    1. Ресуспензируйте один ПЦР окатышей с 17,5 мкл нуклеиназы свободной воды и передачи ресуспензированы Пелле второй ПЦР Пелле. Добавьте 2 мкл 10 x буфер и 0,5 мкл PmeI фермента и задайте дайджест на водяной бане в течение 2 ч при 37 ° C.
    2. Подготовить 2,5% агарозном геле с помощью 0.5 x TBE (шаг 6.3). Мкл 6 5 x загрузки геля краситель к дайджест. Перевести 13 мкл каждого дайджеста на два соседних скважин геля агарозы, загрузить 20 nt размер лестницы на конце скважины и Побегите гель для 90 минут при 150 V (рис. 4 d).
    3. Акцизный верхние диапазоны PCR от геля на поле УФ, передача части гель в пробки microcentrifuge свежезаваренным весят 1,5 мл, и весят гель штук в масштабе.
  4. Очищайте подакцизным ПЦР усиливается кДНК библиотеки с помощью набор извлечения геля следуя инструкциям производителя. Количественно кДНК библиотеки с помощью ДНК квантификация assay и инструмент, следуя инструкциям производителя.
  5. Оцените размер и чистоты кДНК библиотеки с высок чувствительности ДНК чипа на Bioanalyzer (рис. 5). Последовательность кДНК библиотеки с использованием высокой пропускной способности системы. Передача файла данных FASTQ на RNAworld трубопровод для адаптера обрезки и выравнивание для генома человека для определения последовательности Мирна.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Как описано в методе здесь, в общей сложности 18 отдельных образцов FFPE РНК (100 нг каждый) настраиваются в отдельных труб пройти 3' adenylated перепутываются олигонуклеотида T4 маточных ночёвка. На следующий день, ферментативных реакций являются тепло деактивирован, комбиниров...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Высокую воспроизводимость и надежные cDNA библиотека подготовки протокола для NGS малых РНК, архивируются в FFPE РНК образцы представлены в этот протокол, который является изменение и оптимизированные версии процедуры, описанной Хафнер и др. 22

Все этапы это?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы хотели бы раскрывать, что публикация, содержащая некоторые из данных, представленных в этой рукописи был опубликован в Международный журнал молекулярных наук Loudig и др. 21.

Благодарности

Мы благодарим д-р Томас Tuschl, заведующий лабораторией молекулярной биологии РНК, а также членов его лаборатории для их поддержки и обмена технология, разработанная в его лаборатории и обеспечение доступа к RNAworld трубопроводу. Мы также благодарим д-р Маркус Hafner его протокол обмена и предоставления подробных описаний на всех биохимических и ферментативные шаги, используемые в его первоначальной процедуры.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1% Triton x-100InvitrogenHFH10
10mM ATPAmbionAM8110G
10X dNTPsAmbionAM8110G
10x TBEThermofisher Scientific15581044
14M MercaptoethanolSigmaO3445I-100
20 nt ladderJena BioscienceM-232S
20mg/ml Bovine Serum AlbumineSigmaB8894-5ML
50X Titanium TaqClontech Laboratories639208
Ammonium PersulfateFisher Scientific7727-54-0
BRL Vertical Gel Electrophoresis System with glass plates and combsGIBCOV16
Dimethyl sulfoxide (DMSO)SigmaD9170-5VL
Eppendorf microcentrifuge 5424RUSA scientific4054-4537Q
Eppndorf ThermomixerUSA scientific4053-8223Q
Fisherbrand™ Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5mlFisher Scientific02-681-320
Gel Breaker Tube 0.5 mlIST Engineering Inc,3388-100
Gel electrophoresis apparatus 7cm x10cm- Mini-sub Cell GT with gel trays and combsBiorad1704446
GlycoblueAmbionAM9516
Jersey-CoteLabScientific, Inc1188
KcL 2MAmbionAM9640G
MgCl2 1MAmbionAM9530G
Minifuge dual rotor personal centrifugeUSA scientific2641-0016
Model V16 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus, glasses, combs, and spacersCiore Life Science21070010
OligonucleotidesIDTDefined during order
Owl EasyCast B2 mini electrophoresis system- with gel trays and combsThermofisher ScientificB2
Qiaquick Gel Extraction kitQiagen28704
Restriction enzyme PmeINEBR0560S
RNase-free waterAmbionAM9932
Safe Imager 2.0Life TechnologiesG6600
Safe Imager 2.0 blue light transilluminatorThermofisherG6600
SeaKem LE agaroseLonza50002
Superscript III reverse transcription kitInvitrogen18080-044
SybrGoldLife TechnologiesS11494
T4 RNA Ligase 1NEBM0204S
T4 RNA Ligase 2 Truncated K227QNEB0351L
TEMEDFisher ScientificO3446I-100
Themocycler with heated lidApplied Biosystem4359659
Tris 1M pH 7.5Invitrogen15567027
Tris 1M pH8.0AmbionAM9855G
UltraPure Sequagel system concentrate, diluent, and bufferNational DiagnosticsEC-833

Ссылки

  1. Peiró-Chova, L., Peña-Chilet, M., López-, J. A., García-Gimenez, J. L., Alonso-Yuste, E., Burgues, O., et al. High stability of microRNAs in tissue samples of compromised quality. Virchows. Arch. 463, 765-774 (2013).
  2. Klopfleisch, R., Weiss, A. T., Gruber, A. D. Excavation of a buried treasure--DNA, mRNA, miRNA and protein analysis in formalin fixed, paraffin embedded tissues. Histol. Histopathol. 26, 797-810 (2011).
  3. Kakimoto, Y., Kamiguchi, H., Ochiai, E., Satoh, F., Osawa, M. MicroRNA Stability in Postmortem FFPE Tissues: Quantitative Analysis Using Autoptic Samples from Acute Myocardial Infarction Patients. PLoS One. 10 (6), e0129338(2015).
  4. Giricz, O., Reynolds, P. A., Ramnauth, A., Liu, C., Wang, T., Stead, L., et al. Hsa-miR-375 is differentially expressed during breast lobular neoplasia and promotes loss of mammary acinar polarity. J. Pathol. 226, 108-119 (2012).
  5. Hui, A. B., Shi, W., Boutros, P. C., Miller, N., Pintilie, M., Fyles, T., et al. Robust global micro-RNA profiling with formalin-fixed paraffin-embedded breast cancer tissues. Lab. Invest. 89, 597-606 (2009).
  6. Zhang, X., Chen, J., Radcliffe, T., Lebrun, D. P., Tron, V. A., Feilotter, H. An array-based analysis of microRNA expression comparing matched frozen and formalin-fixed paraffin-embedded human tissue samples. J. Mol. Diagn. 10, 513-519 (2008).
  7. Kolbert, C. P., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Grill, D. E., Simon, G., et al. Multi-platform analysis of microRNA expression measurements in RNA from fresh frozen and FFPE tissues. PLoS One. 8, e52517(2013).
  8. Meng, W., McElroy, J. P., Volinia, S., Palatini, J., Warner, S., Ayers, L. W., et al. Comparison of microRNA deep sequencing of matched formalin-fixed paraffin-embedded and fresh frozen cancer tissues. PLoS One. 8 (5), e64393(2013).
  9. Liu, A., Tetzlaff, M. T., Vanbelle, P., Elder, D., Feldman, M., Tobias, J. W., et al. MicroRNA expression profiling outperforms mRNA expression profiling in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2, 519-527 (2009).
  10. Dijkstra, J. R., Mekenkamp, L. J., Teerenstra, S., De Krijger, I., Nagtegaal, I. D. MicroRNA expression in formalin-fixed paraffin embedded tissue using real time quantitative PCR: the strengths and pitfalls. J Cell Mol Med. 16, 683-690 (2012).
  11. Siebolts, U., Varnholt, H., Drebber, U., Dienes, H. P., Wickenhauser, C., Odenthal, M. Tissues from routine pathology archives are suitable for microRNA analyses by quantitative PCR. J. Clin. Pathol. 62, 84-88 (2009).
  12. Jang, J. S., Simon, V. A., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Schultz, D. A., Zschunke, M. A., Lingle, W. L., Kolbert, C. P., Jen, J. Quantitative miRNA expression analysis using fluidigm microfluidics dynamic arrays. BMC Genomics. 12, 144(2011).
  13. Andreasen, D., Fog, J. U., Biggs, W., Salomon, J., Dahslveen, I. K., Baker, A., Mouritzen, P. Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples. Methods. 50 (4), S6-S9 (2010).
  14. Kelly, A. D., Hill, K. E., Correll, M., Wang, Y. E., Rubio, R., Duan, S., et al. Next-generation sequencing and microarray-based interrogation of microRNAs from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue: preliminary assessment of cross-platform concordance. Genomics. 102, 8-14 (2013).
  15. Visone, R., Croce, C. M. MiRNAs and cancer. Am. J. Pathol. 174, 1131-1138 (2009).
  16. Lu, J., Getz, G., Miska, E. A., Alvarez-Saavedra, E., Lamb, J., Peck, D., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435, 834-838 (2005).
  17. Cho, W. C. MicroRNAs: potential biomarkers for cancer diagnosis, prognosis and targets for therapy. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 42, 1273-1281 (2010).
  18. Hui, A., How, C., Ito, E., Liu, F. F. Micro-RNAs as diagnostic or prognostic markers in human epithelial malignancies. BMC Cancer. 11, 500(2011).
  19. Tam, S., de Borja, R., Tsao, M. S., McPherson, J. D. Robust global microRNA expression profiling using next-generation sequencing technologies. Lab. Invest. 94, 350-358 (2014).
  20. Loudig, O., Wan, T., Ye, K., Lin, J., Wang, Y., Ramnauth, A., et al. Evaluation and Adaptation of a Laboratory Based cDNA Library Preparation Protocol for Retrospective Sequencing of Archived MicroRNAs from up to 35-Year-Old Clinical FFPE Specimens. Int J Mol Sci. 18, e627(2017).
  21. Kotorashvili, A., Ramnauth, A., Liu, C., Lin, J., Ye, K., Kim, R., et al. Effective DNA/RNA co-extraction for analysis of microRNAs, mRNAs, and genomic DNA from formalin-fixed paraffin-embedded specimens. PLoS One. 7 (4), e34683(2012).
  22. Hafner, M., Renwick, N., Farazi, T. A., Mihailović, A., Pena, J. T., Tuschl, T. Barcoded cDNA library preparation for small RNA profiling by next-generation sequencing. Methods. 58 (2), 164-170 (2012).
  23. Loudig, O., Brandwein-Gensler, M., Kim, R. S., Lin, J., Isayeva, T., Liu, C., et al. Illumina whole-genome complementary DNA-mediated annealing, selection, extension and ligation platform: assessing its performance in formalin-fixed, paraffin-embedded samples and identifying invasion pattern-related genes in oral squamous cell carcinoma. Hum. Pathol. 42 (12), 1911-1922 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

135FFPEPCRT4

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены