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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Formalin fixierten Paraffin-eingebetteten Proben stellen eine wertvolle Quelle der molekularen Biomarker der menschlichen Krankheiten. Hier präsentieren wir ein Labor-basierte cDNA Bibliothek Vorbereitung Protokoll, zunächst mit frisch gefrorene RNA entworfen und optimiert für die Analyse von archivierten Mikrornas aus Geweben bis zu 35 Jahre gespeichert.

Zusammenfassung

– Archiviert, klinisch klassifiziert Formalin fixierten bieten Paraffin-eingebetteten (FFPE) Gewebe Nukleinsäuren Retrospektive Molekulare Studien der Krebsentstehung. Durch die Verwendung nicht-invasive oder Pre-maligner Läsionen von Patienten, die später invasive Erkrankungen entwickeln, helfe Genexpressionsanalysen frühe molekulare Veränderungen zu identifizieren, die für Krebsrisiko prädisponieren. Es wurde gut beschrieben, dass Nukleinsäuren FFPE Gewebe erholt unterzogen haben, schwere körperliche Schäden und chemischen Veränderungen, die ihre Analyse schwierig und erfordert in der Regel angepasst Assays. Micro-RNAs (MiRNAs), jedoch die repräsentieren eine kleine Klasse von RNA-Molekülen überspannt nur bis zu ~ 18 – 24 Nukleotide, haben gezeigt, dass langfristigen Lagerung standhalten und wurden erfolgreich in FFPE-Proben analysiert. Hier präsentieren wir Ihnen ein 3' Barcode komplementäre DNA (cDNA) Bibliothek Vorbereitung Protokoll speziell optimiert für die Analyse von kleinen RNAs extrahiert aus den archivierten Geweben, die kürzlich unter Beweis gestellt wurde, robust und hoch reproduzierbare wenn mit archiviert klinische Proben bis zu 35 Jahre lang aufbewahrt. Diese Bibliothek Vorbereitung ist gut geeignet für die Multiplex-Analyse von Material beeinträchtigt/beeinträchtigt, wo RNA-Proben (bis 18) mit einzelnen 3' Barcode Adapter ligiert und dann gebündelt für nachfolgende enzymatische und biochemischen Vorbereitungen vor der Analyse. Alle Reinigungen erfolgen durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE), die Größe-spezifische Auswahl und Bereicherungen des Barcodes kleine RNA-Spezies ermöglicht. Diese cDNA-Bibliothek-Vorbereitung ist gut angepasst an winzige RNA-Eingänge, wie eine pilot Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Bestimmung eines bestimmten Verstärkung-Zyklus zur optimale Mengen an Material für Next Generation Sequencing (NGS) produzieren erlaubt. Dieser Ansatz wurde optimiert für den Einsatz von degradierten FFPE-RNA aus Proben, die bis zu 35 Jahre archiviert und hoch reproduzierbare NGS-Daten bietet.

Einleitung

MiRNAs sind bemerkenswert gut in Formalin fixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE) Exemplare1,2,3konserviert. Bisherigen Arbeit hat gezeigt, dass der Ausdruck dieser kurzen regulatorischen nichtcodierende einzelne gestrandeten RNA-Moleküle können erfolgreich mit Gesamt-RNS aus FFPE-Proben ausgewertet werden und liefern relevante Genexpressionsdaten im Vergleich zu den ursprünglichen frisch Gewebe4,5,6,7,8. Im Vergleich zu Großformat-Messenger-RNAs, die erwiesenermaßen FFPE Gewebe Verarbeitung (Formaldehyd, Hitze, Austrocknung, etc.), endogene RNases und das Alter der Proben, die geringe Größe der MiRNAs (~ 18 – 24 kritisch betroffen sein Nukleotide) wird angezeigt, damit sie resistent gegen Abbau und anfällig für langfristige Lagerung, auch durch MiRNA Ausdruck Studien, die Hochdurchsatz-mRNA Studien in archivierte Exemplare9übertreffen demonstriert. MiRNA Ausdruck Studien mit archivierten klinischen Proben, die vor allem in kleinen Analysen durchgeführt wurden, haben gezeigt, dass einzelne oder Multiplex quantitative PCR-Assays, können verschiedene Arten von Microarray Technologien und zuletzt NGS verwendet werden, um den Ausdruck der erhaltenen MiRNAs nach der Optimierung von diesen Tests10,11,12,13,14bewerten.

Da die Dysregulation des MiRNA Ausdruck mit der Entwicklung einer Vielzahl von menschlichen Tumoren verbunden wurde und gibt es möglicherweise ein enormer Vorrat an klinisch Archivierte Exemplare kommentiert, klar geworden, dass diese kleine RNA Moleküle sind eine vielversprechende Quelle potentiellen Krebs Biomarker15,16,17,18. Die Verwendung einer Hochdurchsatz-Gen-Ausdruck-Technologie wie NGS hat den Vorteil, dass eine Gesamtbewertung aller MiRNA Transkripte im Vergleich zu gezielten Technologien wie PCR und/oder Microarrays19. Aus diesem Grund wurde eine optimierte, kostengünstige und leicht anwendbaren Protokoll für cDNA Bibliothek Vorbereitung der kleinen RNAs aus älteren Archivierte Exemplare auf NGS optimiert, um groß angelegte Retrospektive Studien20ermöglichen.

Wir zuvor etabliert eine gleichzeitige RNA/DNA Extraktion Protokoll für separate Wiederherstellung von RNA und DNA aus älteren Archivierte Exemplare, die wir gefunden, um zeitgenössischen kommerziellen Kits21übertreffen. Verwenden dieses Protokoll Extraktion, um total RNA aus FFPE Gewebe archiviert für längere Zeiten zu erhalten, haben wir optimiert die Vorbereitung der cDNA-Bibliotheken für NGS MiRNAs in klinischen Proben bis zu 35 Jahre lang aufzubewahren. Darüber hinaus in einer kürzlich veröffentlichten Studie, wo wir cDNA-Bibliotheken von klinisch klassifizierte duktalen Carcinoma in Situ (DCIS) Proben vorbereitet, identifizierten wir differentiell exprimierten MiRNAs, die durch quantitative PCR validiert wurden gekennzeichnet werden Veränderungen der spezifischen MiRNA nachweisbar bei DCIS Läsionen von Patienten, die an Brustkrebs im Vergleich zu DCIS Läsionen von Patienten, die nicht an Brustkrebs erkranken.

Betrachtet man die Kosten der kommerziellen Kits für die Zubereitung von kleinen RNA-cDNA-Bibliotheken, das Potenzial für ihre Einstellung, sowie die Verwendung von Copyright/patentrechtlich geschützte Reagenzien, die optimiert werden kann nicht, haben wir uns entschlossen ein zuvor veröffentlichten anpassen Labor-basierte und Kit-freie 3' Barcode cDNA Bibliothek Vorbereitung Protokoll für NGS der kleinen RNAs archiviert in FFPE-Proben, Proben ermöglicht simultane Analyse von 1822. Dieses Protokoll bietet eine ideale und robuste schrittweise Prozedur mit optischen und technischen Bewertung Checkpoints, die entscheidend für die Anpassung an FFPE RNA-Proben waren, und hat ein starkes Potenzial für die Anwendung auf andere Quellen von gefährdeten oder schwer RNA-Material verwenden. Das ursprüngliche Protokoll Anwendbarkeit wurde verbessert, indem radioaktiv markierte Größe Marker mit Leuchtstofflampen (z. B.SYBR Gold) nachweisbar RNA-Größe-Markierungen, die bei der Auswahl der aufgespaltenen Bibliotheken auf große Polyacrylamid-Gel verwendet. Dieses optimierte Protokoll stützt sich auf die Unterbindung der Barcode Adapter 3' 18 einzelnen FFPE RNA-Exemplare, die sind dann gebündelt um 5' Adapter Ligatur zu unterziehen, Reverse Transkription und ein pilot PCR-Analyse für Verstärkung der endgültigen cDNA zugeschnitten Bibliothek vor großen PCR-Amplifikation, Reinigung und NGS auf einen hohen Durchsatz-Sequenzer.

Protokoll

1. Vorbereitung aller Reagenzien und Grundierungen

  1. Bestellen Sie alle Grundierungen und Adapter, wie in Abbildung 1beschrieben.
  2. Vorbereiten des Kalibrators cocktail bestand, die in jeder einzelnen Ligatur versetzt wird.
    1. Die Träger Oligonukleotid (Abbildung 1) bis 0,5 µM mit RNase-freies Wasser aufschwemmen. Aufschwemmen Sie 10 Kalibrator Oligonukleotide (Abbildung 1) bis 100 µM mit der 0,5 µM Träger Oligonukleotid-Lösung.
    2. Kombinieren Sie 10 µL der einzelnen 10 Kalibratoren in eine silikonisierte Microcentrifuge einen 100 µM cocktail Kalibrator bestand zu erhalten, und bereiten Sie eine 0,026 nM-Lösung zum Speichern von bei-20 ° C.
  3. Verdünnen Sie die 20 einzigartige, lyophilisiert, Adenylated 3' Adapter mit RNase-freies Wasser, eine Endkonzentration von 50 µM (Abbildung 1).
    Hinweis: Es wird empfohlen, zur Vorbereitung 2,5 µL-Aliquots von jedem Adapter in silikonisierte Einzelrohre und bei-80 ° C bis zu 2 Jahre lang aufbewahren.
  4. Aufschwemmen des entsalzten 19 nt-3 "Adapter und 24 nt-3" Adapter Größe Marker Oligonukleotide bis 250 ng/mL (Abbildung 1).
  5. Aufschwemmen des HPLC gereinigt 5' Adapters bis 100 µM mit RNAse-freies Wasser. Aufschwemmen der 5' und 3' PCR-Primer bis 100 µM mit RNase-freies Wasser (Abbildung 1).
    Hinweis: Aliquoten alle Oligonukleotide in Mengen notwendig für 1 – 2 Experimente und Speicher bei-80 ° C.
  6. Bereiten Sie die Denaturierung (PAA) Gel laden Farbstoff durch die Kombination von 98,8 % Formamid, 1 % (V/V) 0,5 M Na2H2 EDTA, pH 8.0 und 0,2 % Bromophenol Blue Polyacrylamid, und legen Sie 1 mL Aliquote bei-80 ° C.
    1. Bereiten Sie 0,5 M Na2H2 EDTA Lösung durch Zugabe von 18,6 g Na2H2 EDTA Pulver, 50 mL Nuklease-freies Wasser zu. Fügen Sie NaOH Pellets um pH 8.0 zu erreichen. Stellen Sie die Lautstärke auf 100 mL um 0,5 M Na2H2 EDTA, pH 8,0-Stammlösung zu erhalten.
    2. Wiegen Sie 15 mg Bromophenol blue in einer separaten 15 mL Tube. Fügen Sie 600 µL Nuklease-freies Wasser. 14,25 mL deionisiertes Formamid hinzugeben. 150 µL 0,5 M Na2H2 EDTA, pH 8,0-Lösung hinzufügen.
    3. Aliquoten die PAA endgültige Lösung 15 ml in 1 mL Aliquote bei-80 ° C.
  7. Bereiten Sie die 5 x Agarosegel beladen Farbstoff durch die Kombination von 0,2 % Bromophenol blau, 0,2 % Xylol Cyanol FF Na2H2 50 mM EDTA, pH 8.0 und 20 % Ficoll Typ-400.
    1. Aufschwemmen 1,86 g Na2H2-EDTA in 50 mL Nuklease-freies Wasser in ein 400-mL-Becherglas auf einen Magnetrührer bei Raumtemperatur (RT). Fügen Sie NaOH Pellets um einen pH 8.0 zu erreichen. Fügen Sie Nuklease-freie Wasser auf 100 mL zu einem 50 mM EDTA Lösung Na2H2 zu erreichen.
    2. Bromophenol blue Pulver 20 mg, 20 mg Xylol Cyanol FF Pulver und 2 g Ficoll Typ 400 Pulver wiegen, und in 5 mL 50 mM Na2H2 EDTA Aufschwemmen.
    3. Wirbel die Röhrchen mit den drei Farbstoffe und 5 mL 50 mM Na2H2 EDTA. 5 X agarose Gel laden Farbstoff mischen, 1 mL Aliquote vorzubereiten und bei-80 ° c Lagern

2. richten Sie die 3' Barcode-Adapter grundsätzlich mit 18 einzelnen RNA-Proben

  1. 18 einzelnen RNA-Proben zu identifizieren (Pre-regelmäñig bei 100 ng in 9,5 µL Nuklease-freies Wasser in Mikrozentrifugenröhrchen 1,5 mL silikonisiert), und legen Sie die Rohre auf Eis für 10 min Auftauen.
  2. 10 x RNA Ligase Puffer (ohne ATP) frisch zubereiten.
    1. Verbinden Sie in einem 1,5 mL silikonisiert Microcentrifuge Schlauch 343 µL RNase-freies Wasser, 500 µL Tris 1 M pH 7.5, 100 µL 1 M MgCl2, 50 µL von 20 mg/mL bovine Serum Albumin und 7 µL 14 M 2-Mercaptoethanol. Mix von flicking die Röhre, Zentrifuge für 2 s bei 2.000 x g und RT und auf Eis.
      Hinweis: Alle Schritte in diesem Protokoll, die angeben, "Zentrifuge für 2 s" erfolgt in einem Benchtop Microcentrifuge RT und eine Höchstgeschwindigkeit von 2.000 x g, um Lösungen zu sammeln, um den Boden der Röhrchen.
  3. Bereiten 50 % wässrige DMSO Lager durch Zugabe von 1 mL der RNase-freies Wasser zu 1 mL DMSO in einem 2 mL silikonisiert Microcentrifuge Schlauch, Rohr in Alufolie wickeln und Lagerung bei RT
  4. Auftauen von 0,026 nM Kalibrator Cocktail auf Eis für 10 min. Vorbereitung der Ligation Master-Mix durch die Kombination in der folgenden Reihenfolge in einem 1,5 mL silikonisiert Microcentrifuge Schlauch: 40 µL 10 x RNA Ligase Puffer und 120 µL von wässrigen DMSO 50 % mit einer 200 mL-Pipette , und fügen Sie 10 µL 0,026 nM Kalibrator cocktail mit einer 10 µL Pipette. Streichen Sie die 1,5 mL-Tube zu mischen, Zentrifugieren für 2 s und es auf dem Eis.
  5. Jeder der 18 individuell regelmäñig FFPE RNA-Proben 8,5 µL Ligation Master Mix hinzufügen, sanft flick die Rohre Zentrifuge für 2 s und Shop auf Eis.
  6. Tauen Sie 2,5 µL-Aliquots aus jedem der 18, Barcode Adapter 3' und legen Sie sie auf dem Eis für 20 min. auftauen.
    1. Verwenden Sie eine 3 µL Pipette 1 µL jeder Adapter auf die entsprechenden FFPE RNA-Proben mit RNA und Ligation Master Mix (d.h., 9,5 µL + 8,5 µL) übertragen.
    2. Pipette rauf und runter, einfach in die Flüssigkeit zu verzichten und nicht die Spitze herausziehen. Achten Sie darauf, zwischen FFPE RNA-Proben Spitzenwechsel. Schließen Sie jedes Rohr, flick zu mischen, Zentrifuge für 2 s und auf Eis.
  7. Denaturieren Sie die Reaktionen, indem Sie die 18 Röhren auf einem Heizblock bei 90 ° C für 1 min und dann sofort auf Eis.
  8. Bereiten Sie die Ligatur Enzymlösung durch Verdünnung 10 µL des abgeschnittenen K227Q T4 RNA Ligase 2 mit 10 µL RNase-freies Wasser zu einem frischen 1,5 mL silikonisiert Microcentrifuge Schlauch.
  9. Verwenden eine 3 µL Pipette 1 µL des verdünnten Ligatur Enzyms in jeder der 18 RNA-Proben zu übertragen (keine pipette rauf und runter und Tipps zwischen jedes Rohr zu ändern). Die 18 grundsätzlich auf Eis stellen und legen in einem 4 ° C kalten Zimmer für eine Übernachtung Inkubation von 18 h.

3. Reinigung der aufgespaltenen kleinen RNAs

  1. Deaktivieren Sie die Ligatur Reaktionen zu, indem Sie die 18 Röhren für 1 min auf einem Heizblock bei 90 ° C, und kehren Sie um zu Eis für mindestens 2 min abkühlen lassen.
  2. Bereiten Sie den Niederschlag Master Mix durch Zugabe von 1 µL des blauen Farbstoff kovalent an Glykogen zu 26 µL 5 M RNase-freie NaCl zu einem frischen silikonisierte Microcentrifuge Schlauch verbunden.
    1. Übertragen Sie 1,2 µL des Niederschlag-Master-Mix in jedes der 18 Rohre. Fügen Sie 63 µL 100 % Ethanol zu jedem der 18 Röhren. Jedes Röhrchen verschließen, wechseln Sie zu mischen, Zentrifugieren für 2 s und Ort der Rohre auf dem Eis. Kombinieren Sie den Inhalt aller 18 Röhren in einer einzigen 1,5 mL silikonisiert Röhre.
    2. Das Röhrchen verschließen, dreimal, Mix, Zentrifuge für 2 s und Platz für 60 min zu überstürzen sich auf Eis zu invertieren.
  3. Seite eine große (16 X 20 cm2) 15 % Polyacrylamid-Gel vorbereiten.
    1. Gegossene zwei silikonisiert Glasplatten (behandelt mit eine sichere Alternative zu Silan-Beschichtungen) mit 0,1 cm Spacer.
    2. Kombinieren Sie 9 mL System Verdünnungsmittel, 18 mL System Konzentrat, 3 mL Systempuffer, 240 µL APS (9 %), und 12 µL TEMED in ein 50 mL-Tube.
    3. Übertragen Sie die Seite Gel Lösung zwischen Glasplatten mit einer 30-mL-Pipette, legen Sie einen 14-Well-Kamm (0,1 cm dick) und lassen Sie das Gel für 30 min bei RT zu festigen.
  4. Zentrifugieren Sie die 1,5-mL-Tube mit der gepoolten grundsätzlich auf 16.000 x g und 4 ° C für 60 min.
  5. Entfernen Sie den Kamm. Reinigen Sie die Brunnen reichlich mit RNase-freies Wasser mit einer Spritzflasche mit 200 µL Spitze an seinem Ende in den Brunnen zu erreichen und erzwingen UN polymerisierten Acrylamid (ein gut zu einem Zeitpunkt) über ein Waschbecken. Legen Sie die 15 % Seite auf einem Gel-Apparat, füllen Sie die Behälter mit 0,5 x Tris-Borat EDTA (TBE) Lösung, und führen Sie vorab das Gel für 30 min bei 450 V.
  6. Erholen Sie das Rohr mit gepoolten grundsätzlich aus der Zentrifuge zu und trocknen Sie sorgfältig die RNA-Pellet.
    1. Entfernen des Überstands mit einer 1-mL-PIPETTENSPITZE aber etwas Flüssigkeit an der Unterseite. Kippen Sie das Rohr und verwenden Sie eine 20-mL-Pipette, um den verbleibenden überstand zu entfernen, ohne das Pellet. Vakuum Saugrohr mit einer Pasteurpipette mit einer 10 µL Spitze hochkant, ohne Sie zu berühren das Pellet.
    2. Aufschwemmen der RNA-Pellets in 20 µL RNase-freies Wasser durch Streichen der Röhre. Fügen Sie 20 µL PAA Gel Laden Lösung Aufschwemmen der RNS, flick um zu mischen, Zentrifuge für 2 SA. RT, und legen Sie die Röhre bei 90 º c für 1 min und dann sofort auf Eis legen.
  7. Ersetzen der 0,5 X TBE des Apparates mit frisch 0,5 X TBE und Belastung der Leiter, Größe Marker und aufgespaltenen MiRNAs in der Mitte des Gels, Gel verlassen 2 leeren Brunnen auf beiden Seiten (Abbildung 2).
  8. Führen Sie das Gel bei 450 V (35 mA) für 60 min, unterbrechen den Lauf für 10 min abkühlen lassen, und führen Sie erneut bei 520 V (25 mA) für eine weitere 60 min. 15 % Uncast Seite durch einen der Glasplatten zu entfernen.
  9. Leicht das sitzen auf der Glasplatte Gel spray mit fluoreszierenden Farbstofflösung (10 µL) in 25 mL 0,5 x TBE, und lassen Sie es flach für 5 min im Dunkeln sitzen.
  10. Legen Sie das Glas mit dem Gel auf eine blaue Licht Transilluminator und richten Sie beide 19 nt und 24 nt Größe Marker mit einem Lineal, die Exzision der aufgespaltenen kleine RNAs (Abbildung 2) zu lenken. Verbrauchssteuern Sie das Gel.
  11. Legen Sie die ausgeschnittene Gel in eine 0,5 mL-Tube, entworfen, um Gel Scheiben, fest positioniert in einem 1,5 mL silikonisierte Microcentrifuge Schlauch fragment. Zentrifugieren bei 16.000 x g für 3 min bei RT Aufschwemmen der fragmentierten Gels mit 300 µL 400 mm NaCl-Lösung, das Röhrchen verschließen und versiegeln Sie es mit dem Paraffin-Film.
  12. Legen Sie das Rohr auf Erregung auf einem Thermomixer bei 1.100 u/min in einem 4 ° C kalten Zimmer für eine Übernachtung Inkubation (16-17 h).

4. Unterbindung des Adapters 5'

  1. Übertragen die Lösung und fragmentierten Gel zu einem 5 µm Filter sitzt in einem 1,5 mL silikonisiert Rohr Rohr, versiegeln mit Paraffin Film und Zentrifugieren für 5 min bei 2.300 x g und RT.
  2. Die filtrierte Lösung 950 µL 100 % Ethanol hinzu, das Röhrchen verschließen, kehren Sie zu mischen, Zentrifugieren für 2 s, versiegeln Sie das Rohr mit Paraffin Film, und für 1 h auf Eis legen.
  3. Bereiten Sie eine 12 % Seite gel wie unter Punkt 3.3 beschrieben, aber kombinieren Sie 12,6 mL Verdünnungsmittel, 14,4 mL Konzentrat, 3 mL Puffer, 240 µL APS und 12 µL TEMED in ein 50 mL-Tube. Bereits laufen die 12 % Seite Gel für 30 min bei 450 V (~ 35 mA) in 0,5 X TBE.
  4. Zentrifugieren Sie die gereinigte kleine RNA-Lösung bei 16.000 x g für 60 min bei 4 ° C.
  5. Pipette vorsichtig aus der Überstand mit einer 1-mL-Pipette zu den größten Teil der Lösung zu entfernen und eine 200-mL-Pipette verwenden, um die restliche Lösung zu entfernen, ohne Sie zu berühren das Pellet.
  6. Trocknen Sie mit Hilfe einer Pasteurpipette mit 10 mL Spitze an ihrem Ende mit einer Thermoskanne verbunden, sorgfältig die Pellets ohne es zu berühren.
  7. Aufschwemmen das Pellet in 9 µL RNase-freies Wasser ohne pipettieren rauf und runter, aber mit leicht streichen das Rohr, Zentrifugieren für 2 s und das Rohr auf dem Eis.
  8. Bereiten Sie die 10 x RNA Ligase Puffer (mit ATP) frisch durch die Kombination von 500 µL 1 M Tris pH 7,5, 100 µL 1 M MgCl2, 50 µL von 20 mg/mL acetyliert BSA, 200 µL 10 mM ATP, 7 µL 2-Mercaptoethanol 14 M , und 143 µL RNase-freies Wasser.
  9. 10 x RNA Ligase Puffer (ATP) durch Umlegen der Röhre mischen und Zentrifugieren für 2 s, die Lösung an der Unterseite des Rohres zu sammeln.
  10. Einrichten der 5'-Adapter Ligatur durch Hinzufügen von 2 µL 10 x RNA Ligase Puffer (ATP), 1 µL 100 µM 5' Adapter und 6 µL 50 % wässrige DMSO, 9 µL, 3' Barcode small RNA-Lösung.
  11. Streichen Sie das Rohr leicht zu mischen, Zentrifugieren für 2 s, die Lösung zu sammeln legen das Rohr auf einem Heizblock bei 90 ° C für 1 min und wieder auf Eis für mindestens 2 min.
  12. Fügen Sie 2 µL T4 RNA Ligase 1 in die Lösung (nicht pipette rauf und runter), streichen Sie das Rohr, Zentrifuge für 2 s und sitzen die Röhre in schwimmenden rack im Wasserbad 37 ° C für 60 min.
  13. Gleichzeitig richten Sie zwei grundsätzlich zwischen den 19 nt-3 "Adapter und den Adapter 5' und zwei grundsätzlich zwischen den 24 nt-3" Adapter und die 5'.
    1. Kombinieren Sie 2 µL des 19nt-3 "Adapter (250 ng/µL) oder 24 nt-3" Adapter (250 ng/µL) mit: 2 µL der 5'-Adapter (100 µM), 2 µL 10 x RNA Ligase Puffer (ATP), 6 µL 50 % wässrige DMSO, 6 µL RNase-freies Wasser , und 2 µL T4 RNA Ligase 1 in einem 1,5 mL silikonisiert Microcentrifuge Schlauch.
    2. Streichen Sie die Rohre zu mischen, Zentrifugieren für 2 s und die Röhrchen bei 37 ° C für 60 Minuten.
  14. Alle Verbindlichkeiten 20 µL PAA Denaturierung Puffer hinzufügen (gereinigt kleinen RNAs, 2 grundsätzlich mit 19nt-3 "Adapter und 2 grundsätzlich mit 24nt-3" Adapter).
    1. Mix von flicking die Rohre, Zentrifuge für 2 s, und inkubieren Sie die Rohre auf einem Heizblock bei 90 ° C für 1 min. Transfer alle Röhren zu Eis, und bereiten eine Leiter (3 mL Leiter mit 20 µL PAA).
  15. Leeren Sie das Oberbecken des Gel-Geräts mit dem Vorlauf 12 % Seite Gel, und fügen Sie frische 0,5 X TBE Lösung unter dem Niveau der Brunnen (Brunnen sind mit einer langen, dünnen Spitze Pipette geleert).
    1. Laden Sie die Proben mit einer dünnen PIPETTENSPITZE, wie in Abbildung 3beschrieben.
    2. Verwendung frischer 0,5 X TBE, individuelle Vertiefungen an der Spitze des Gels zu füllen.
    3. Fügen Sie frische 0,5 X TBE zum Stausee oberhalb der Brunnen und Start der Elektrophorese des 12 % Seite für 60 min bei 450 V (~ 35 mA).
    4. Anhalten der Ausführung durch das Abschalten des Generators für 10 min. abkühlen lassen, das Gel. Starten Sie den Generator und führen Sie das Gel für 60 min bei 520 V (~ 25 mA).
  16. Der Generator wird gestoppt, leeren die Stauseen durch invertieren das Gerät über ein Waschbecken und 12 % uncast Seite durch einen der Glasplatten zu entfernen.
  17. Setzen Sie das Glas mit dem flachen Gel, Sprühen Sie das Gel mit 10 µL der fluoreszierenden Farbstoff in 25 mL 0,5 X TBE, brüten im Dunkeln für 5 min. mit dem Gel auf eine blaue Licht Transilluminator das Glas legen und Ausrichten der beiden 19 nt und sowohl die 24 nt Größe Marker mit ein Lineal, um direkt die Exzision der aufgespaltenen kleine RNAs (Abbildung 3).
    1. Das Gel Verbrauchsteuern und die ausgeschnittenen Gel Stück in ein 0,5 mL Gel Breaker Rohr übertragen. Schließen Sie die Kappe des Gel Breaker Rohres, zu einem 1,5 mL silikonisiert Microcentrifuge Schlauch Set und sicher mit Paraffin Film. Das Gel-Breaker-Rohr zu entfernen, die zerkleinerten Gel Stücke in einer 1,5 mL Tube 300 µL von 300 mM NaCl und 1 µL 100 µM 3' PCR Primer hinzufügen.
    2. Versiegeln Sie das Rohr mit Paraffin Film auf Erregung auf einem Thermomixer bei 1.100 u/min bei 4 ° C über Nacht (17 – 18 Uhr) in einem kalten Raum.

(5) reverse Transkription von 5' Ligiert und 3' Barcode gereinigt kleinen RNAs

  1. Abrufen der Schlauch aus dem Thermomixer und Filter reinigen die Lösung mit einem 5 µM Filter Schlauch.
    1. Verwendung einer 1-mL-Pipette, die Lösung auf eine 5 µM Filter Rohr eingeschoben 1,5 mL übertragen silikonisiert RNase-freie sammelröhrchen. Zentrifugieren Sie das Rohr für 3 min bei 2.300 x g und RT.
    2. Entsorgen Sie das Filter-Rohr und das 1,5 mL Microcentrifuge sammelröhrchen, die gefilterte Lösung enthält fügen Sie 950 µL 100 % Ethanol hinzu. Invertieren Sie das Rohr, Mix, Zentrifuge für 2 s und Platz für 60 min. Niederschlag die RNA pellet durch Zentrifugieren das Rohr auf 16.000 x g und 4 ° C für 1 h auf Eis.
  2. Trocknen Sie die RNA-Pellet.
    1. Öffnen Sie die Kappe und entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit einer 1-mL-Pipette etwas Flüssigkeit am Ende verlassen.
    2. Verwenden Sie eine 20 µL Pipette, um den verbleibenden überstand zu entfernen, ohne das Pellet. Kippen Sie das Rohr um eine Lösung auf der gegenüberliegenden Seite des Pellet-sitzen zu ermöglichen.
    3. Verwenden Sie eine Pasteurpipette mit einer 10 mL ungefiltertes PIPETTENSPITZE Aspirieren überstand und trocknen Sie die Pellets mit Vakuum.
  3. Die RNA-Pellet in 5,6 µL RNase-freies Wasser aufschwemmen.
    1. Auftauen der reversen Transkription Reagenzien auf dem Eis für 15 min. Set bis eine reverse Transkription Reaktion durch Zugabe von 3 µL 5 x Puffer, 4.2 µL 10 X deoxynucleotide triphosphat (dNTPs) (je 2 mM) und 1,5 µL Dithiothreitol (DTT), 5,6 µL RNase-frei resuspendierte Pellet.
    2. Streichen Sie sanft das Rohr um die Reaktion zu mischen, und Zentrifugieren für 2 s, die Lösung zu sammeln. Richten Sie die Reaktion auf einem Heizblock bei 90 ° C genau 30 s und übertragen Sie dann direkt auf eine Thermomixer bei 50 ° C.
    3. Lassen Sie das Rohr für den Thermomixer für 2 min, so dass die Temperatur ausgleicht. Fügen Sie 0,75 µL des Enzyms reverse Transkription direkt in die Lösung, Flick sanft zu mischen und der Schlauch wieder auf den Thermomixer bei 50 ° C für 30 min sofort-Set.
  4. Übertragen Sie nach 30 min das Rohr auf einem Heizblock bei 95 ° C für 1 min, reverse Transkription zu stoppen. Fügen Sie 95 µL RNase-freies Wasser der reversen Transkription direkt hinzu, wechseln Sie das Rohr zu mischen, und setzen Sie ihn direkt auf dem Eis für 2 min.
  5. Beschriften Sie das Rohr mit der cDNA Materialbibliothek und Bibliothek-ID.

6. pilot PCR und groß angelegte PCR Verstärkung

  1. Bereiten Sie frisch 10 X PCR Puffer durch Hinzufügen von 304 µL RNase-freies Wasser, 125 µL 2 M KCl, 50 µL 1 M Tris pH 8.0, 10 µL 1 M MgCl2, 5 µL 1 % Triton X-100 und 6 µL 1 M 2-Mercaptoethanol in einem silikonisierte Microcentrifuge Schlauch , und halten Sie bei RT
  2. Montieren die Pilot PCR-Reaktion durch die Kombination von 67 µL RNase-freies Wasser, 10 µL 10 x PCR-Puffer, 10 µL 10 X dNTPs, 0,5 µL 100 µM 5' PCR Primer, 0,5 µL 100 µM 3' PCR Primer, 10 µL cDNA Materialbibliothek und 2 µL 50 X Taq Polymerase.
    1. Richten Sie zwei PCR-Zyklen in einem Thermocycler folgendermaßen: Datei 1: 94 ° C für 45 s, 50 ° C für 85 s und 72 ° C für 60 s für 10 Zyklen zu halten, bei 4 ° C; Datei 2: 94 ° C für 45 s, 50 ° C für 85 s und 72 ° C für 60 s für 2 Zyklen, bei 4 ° c zu halten Einrichten der Pilot PCR-Reaktion in den Thermocycler und Datei 1.
    2. Am Ende der Datei 1 Öffnen Sie das PCR-Röhrchen, und mit einer 20 µL Pipette, Transfer 12 µL aus der Pilot PCR-Reaktion zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch mit 3 µL 5 X gel laden Farbstoff, mischen, indem Sie auf und ab pipettieren, das Röhrchen verschließen , und beschriften Sie sie "10 Zyklen".
    3. Das Pilot-PCR-Röhrchen verschließen und File 2 an einem Thermocycler beginnen. Am Ende der Datei 2 Öffnen Sie PCR Tube und verwenden Sie eine 20-mL-Pipette, um 12 µL Lösung in 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch mit 3 µL 5 x Gel Loading Dye transfer, und beschriften sie "12 Zyklen".
    4. Wiederholen Sie die Schritte in den Schritten 6.2.2 und 6.2.3 12 µL PCR-Produkte aus der Pilot PCR-Reaktion bei PCR-Zyklen, 14, 16, 18 und 20 zu sammeln. Jedes der 12 µL PCR Aliquote 3 µL 5 x Gel laden Farbstoff hinzu, und an die 20 nt-Leiter, 3 µL der Leiter und 9 µL RNase-freies Wasser enthält.
  3. Bereiten Sie eine 2,5 % Agarose-Gel mit 0,5 X TBE.
    1. Gewicht 2,5 g Agarose in ein sauberes Becherglas und 100 mL 0,5 X TBE. Die Lösung in der Mikrowelle erhitzen Sie, bis es kocht. Entfernen Sie die Lösung aus der Mikrowelle, Wirbeln Sie die Flasche zum Mischen der Agarose, Hinzufügen von 4 μL der Interkalation Bromid (10 mg/mL) und übertragen Sie die Lösung auf einem 7 x 10 cm2 Elektrophorese Tablett, an beiden Enden mit Klebeband verschlossen.
    2. Legen Sie eine 8-Well-Kamm und lassen Sie das Agarosegel erstarren bei RT. Transfer erstarrten Agarose-gel in einer Elektrophorese-Apparatur gefüllt mit 0,5 X TBE.
  4. Laden Sie die Leiter und PCR-Proben auf dem Agarosegel, und führen Sie es für 30 min bei 120 V.
  5. Bewerten Sie das Gel auf einem UV-Box, die optimale PCR-Zyklus (Abb. 4A) zu identifizieren.
    Hinweis: Die Größe der erwarteten PCR Bands zeigt Abbildung 4 b.
    1. Die beiden PCR-Bands in jedem der verschiedenen Brunnen zu beobachten (obere Band: DNA-Bibliothek, unterband: Grundierung Dimere).
    2. Identifizieren die angemessene PCR-Zyklus für die cDNA-Verstärkung durch die Auswahl des Zyklus wo die cDNA-Bibliothek ist sichtbar, aber die Grundierung Dimere sind kaum zu beobachten.
      Hinweis: Im Allgemeinen ist die angemessene PCR-Zyklus zwischen 12 – 16 Zyklen ausgewählt. Abbildung 4Aleuchtet die entsprechende PCR-Zyklus für diese Bibliothek 14.
  6. Richten Sie die groß angelegte PCR-Reaktionen (6 x 100 µL) für Agarose-Gel-Bibliothek-Reinigung.
    1. Bereiten Sie eine frische Röhre 10 x PCR-Puffer nach Schritt 6.1.
    2. Bereiten Sie die groß angelegte PCR Master-Mix in einem 1,5 mL Röhrchen durch die Kombination 435.5 µL RNase-freies Wasser, 65 µL 10 X PCR Puffer, 65 µL 10 X dNTPs 3,25 µL des PCR-Primer 5' 3,25 µL des PCR-Primer 3' und pipettieren rauf und runter zu mischen.
    3. Übertragen Sie 88 µL des PCR-Master-Mix in sechs 0,5 mL PCR Rohre. 10 µL cDNA Materialbibliothek (gespeichert auf Eis) zu übertragen, fügen Sie 2 µL 50 X Taq Polymerase in jedes der 6 PCR-Rohre und pipette um zu mischen.
    4. Bereiten Sie eine negative PCR-Reaktionsgefäß durch die Kombination von 77 µL RNase-freies Wasser, 10 µL 10 X PCR Puffer 10 µL 10 X dNTPs, 0,5 µL des PCR-Primer 5', 0,5 µL des PCR-Primer 3' und 2 µL 50 X Taq Polymerase und Pipette zu mischen.
    5. Legen Sie die PCR-Röhrchen in den Thermocycler mit Hilfe der PCR-Zyklus im Schritt 6.2.1 beschrieben und die optimale Anzahl der Verstärkung Zyklen. Bereiten Sie eine 2,5 % Agarosegel mit 0,5 X TBE, wie unter Punkt 6.3 beschrieben.
  7. Übertragen Sie nach PCR Verstärkung 9 µL aus jedem PCR-Röhrchen in sechs 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen, 3 µL 5 x Gel laden Farbstoff enthält.
    1. Bereiten Sie 20 nt Leiter durch die Kombination von 3 mL der Leiter in 9 µL RNase-freies Wasser und Hinzufügen von 3 µL Gel Farbstoff in einem 1,5 mL-Tube laden.
    2. Laden Sie die Leiter, PCR Negativkontrolle und 6 PCR-Produkte auf das Agarosegel, und führen Sie das Gel für 30 min bei 120 V.
    3. Überprüfen Sie die Einheitlichkeit der PCR Vergrößerungen zwischen Fahrspuren auf eine UV-Box (nehmen Sie ein Bild).
    4. Kombinieren Sie 3 PCR-Reaktionen in zwei 1,5 mL silikonisiert Microcentrifuge Schlauch (3 x 91 µL), 27 µL 5 M NaCl und 950 µL 100 % Ethanol. Invertieren Sie die Rohre zu mischen und setzte sie bei-20 ° C über Nacht, die PCR-Produkte auszufällen.

(7) cDNA Bibliothek Reinigung und Bewertung

  1. Zentrifugieren Sie beide Rohre mit dem PCR-Reaktionen bei 16.000 x g für 60 min bei 4 ° C.
  2. Entfernen Sie den Überstand mit einer 1-mL-Pipette, dann kippen Sie das Rohr mit der Pellet auf der Oberseite und Flüssigkeit auf der unteren Seite und Verwenden einer Pasteurpipette, verbunden mit einer Thermoskanne mit einer Badewanne und Flüssigkeit mit 10 mL Spitze am Ende der Pasteurpipette abzusaugen.
  3. Richten Sie die PmeI verdauen.
    1. Aufschwemmen Sie eines PCR-Pellets mit 17,5 µL Nuklease-freies Wasser, und das zweite PCR-Pellet übermitteln Sie Pellet resuspendierte. Fügen Sie 2 µL 10-fach Puffer und 0,5 µL PmeI Enzym, und legen Sie den Digest in einem Wasserbad für 2 h bei 37 ° C.
    2. Bereiten Sie eine 2,5 % Agarosegel mit 0,5 X TBE (Schritt 6.3). Der Digest 6 µL 5 x Gel laden Farbstoff hinzufügen. Übertragen Sie 13 µL jeder Digest in zwei benachbarten Vertiefungen der Agarose-Gel, laden Sie 20 nt-Größe-Leiter am Ende Brunnen und führen Sie das Gel für 90 min bei 150 V (Abbildung 4 aus).
    3. Verbrauchsteuern Sie die oberen PCR-Bänder aus dem Gel auf die UV-Box, übertragen Sie die Gel-Stücke zu einem frisch wog 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und wiegen Sie die Gel-Stücke auf einer Skala.
  4. Reinigen Sie die ausgeschnittene PCR amplifizierten cDNA-Bibliothek mit einem Gel Extraction Kit nach den Anweisungen des Herstellers. Quantifizieren der cDNA-Bibliothek mit Hilfe eines DNA-Quantifizierung Assay und Instrument, nach den Anweisungen des Herstellers.
  5. Bewerten Sie die Größe und Reinheit der cDNA-Bibliothek mit einem hochempfindlichen DNA-Chip auf einem Bioanalyzer (Abbildung 5). Reihenfolge der cDNA-Bibliothek mit einem Hochdurchsatz-System. Übertragen Sie die FASTQ-Datei an die RNAworld-Pipeline für Adapter Trimmen und Ausrichtung auf das menschliche Genom, die MiRNA-Sequenzen zu identifizieren.

Ergebnisse

Wie in der Methode hier insgesamt 18 einzelnen FFPE RNA-Proben beschrieben (100 ng jeder) befinden sich in getrennten Röhren 3' Adenylated Barcode Oligonukleotid T4 Ligatur über Nacht zu unterziehen. Am nächsten Tag sind die enzymatischen Reaktionen Hitze deaktiviert, kombiniert und in einem einzigen Rohr ausgefällt. Die RNA-Pellet Nukleinsäuretablette und der aufgespaltenen RNA-Moleküle sind auf 15 % denaturierenden Polyacrylamid-Gel (Seite), wo RNA Oligonukleotid Größe Marker, d...

Diskussion

Ein hoch reproduzierbare und robuste cDNA Bibliothek Vorbereitung Protokoll für NGS der kleinen RNAs in FFPE RNA-Proben archiviert wird in diesem Protokoll dargestellt, der eine modifizierte und optimierte Version des Verfahrens von Hafner Et Al. beschrieben ist 22

Alle Schritte dieses Protokolls wurden für den Einsatz mit älteren archiviert und kompromittierten Gesamt-RNS erholt aus FFPE-Proben optimiert. Der entscheidende Schritt dieses Protokolls für die...

Offenlegungen

Die Autoren Wünsche offen zu legen, dass eine Publikation enthält einige der Daten in dieser Handschrift von Loudig Et Al. International Journal of Molecular Sciences veröffentlicht wurde 21.

Danksagungen

Wir danken Dr. Thomas Tuschl, Leiter des Labors für Molekulare Biologie der RNA sowie Mitglieder von seinem Labor für ihre Unterstützung und für die gemeinsame Nutzung der Technologie entwickelt in seinem Labor und Zugriff auf die RNAworld-Pipeline. Wir danken auch Dr. Markus Hafner für sharing sein Protokoll und detaillierte Beschreibungen über alle biochemischen und enzymatische Schritte in seine ursprüngliche Verfahren verwendet.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
1% Triton x-100InvitrogenHFH10
10mM ATPAmbionAM8110G
10X dNTPsAmbionAM8110G
10x TBEThermofisher Scientific15581044
14M MercaptoethanolSigmaO3445I-100
20 nt ladderJena BioscienceM-232S
20mg/ml Bovine Serum AlbumineSigmaB8894-5ML
50X Titanium TaqClontech Laboratories639208
Ammonium PersulfateFisher Scientific7727-54-0
BRL Vertical Gel Electrophoresis System with glass plates and combsGIBCOV16
Dimethyl sulfoxide (DMSO)SigmaD9170-5VL
Eppendorf microcentrifuge 5424RUSA scientific4054-4537Q
Eppndorf ThermomixerUSA scientific4053-8223Q
Fisherbrand™ Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5mlFisher Scientific02-681-320
Gel Breaker Tube 0.5 mlIST Engineering Inc,3388-100
Gel electrophoresis apparatus 7cm x10cm- Mini-sub Cell GT with gel trays and combsBiorad1704446
GlycoblueAmbionAM9516
Jersey-CoteLabScientific, Inc1188
KcL 2MAmbionAM9640G
MgCl2 1MAmbionAM9530G
Minifuge dual rotor personal centrifugeUSA scientific2641-0016
Model V16 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus, glasses, combs, and spacersCiore Life Science21070010
OligonucleotidesIDTDefined during order
Owl EasyCast B2 mini electrophoresis system- with gel trays and combsThermofisher ScientificB2
Qiaquick Gel Extraction kitQiagen28704
Restriction enzyme PmeINEBR0560S
RNase-free waterAmbionAM9932
Safe Imager 2.0Life TechnologiesG6600
Safe Imager 2.0 blue light transilluminatorThermofisherG6600
SeaKem LE agaroseLonza50002
Superscript III reverse transcription kitInvitrogen18080-044
SybrGoldLife TechnologiesS11494
T4 RNA Ligase 1NEBM0204S
T4 RNA Ligase 2 Truncated K227QNEB0351L
TEMEDFisher ScientificO3446I-100
Themocycler with heated lidApplied Biosystem4359659
Tris 1M pH 7.5Invitrogen15567027
Tris 1M pH8.0AmbionAM9855G
UltraPure Sequagel system concentrate, diluent, and bufferNational DiagnosticsEC-833

Referenzen

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