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요약

포 르 말린 고정 파라핀 끼워 넣어진 표본 인간의 질병의 분자 biomarkers의 귀중 한 소스를 나타냅니다. 여기 우리는 실험실 기반 cDNA 라이브러리 준비 프로토콜, 처음 신선한 냉동된 RNA로 설계 하 고 최적화 된 조직에서 보관 된 microRNAs 분석 저장 최대 35 년 제시.

초록

-보관, 임상 분류 포 르 말린 고정 파라핀 포함 (FFPE) 조직 암 개발의 회고전 분자 연구에 대 한 핵 산을 제공할 수 있습니다. 사용 하 여 나중에 침략 적인 질병을 개발 하는 환자에서 비 침 습 또는 미리 악성 병 변, 진 식 분석 암 위험을 predispose 초기 분자 변경 식별 도움이 됩니다. 그것은 음 핵 산 FFPE 직물에서 발견 한 심각한 물리적 손상과 그들의 분석을 어렵게 하 고 일반적으로 적응된 분석 실험을 요구 한다 화학 수정 받은 설명 하고있다. 그러나 MicroRNAs (miRNAs),, 소규모 클래스를 대표 하는 RNA 분자 ~ 18-24만 까지의 스패닝의 뉴클레오티드, 장기 저장을 견딜 하는 FFPE 샘플에서 성공적으로 분석 된 표시 되었습니다. 여기에서 우리는 3' 바코드 보완 DNA (cDNA) 라이브러리 준비 프로토콜 때 보관 사용 하 여 강력 하 고 매우 재현 될 최근 시연 했다 보관 된 조직에서 추출 하는 작은 RNAs의 분석을 위해 특별히 최적화 된 선물 임상 표본 최대 35 년 저장입니다. 이 라이브러리 준비는 소재의 손상/저하 (최대 18) RNA 샘플 개별 3' 바코드 어댑터와 출혈 하 고 후속 효소 및 생 화 확 적인 준비에 대 한 다음 함께 풀링된 다중 분석을 잘 적응 이전에 분석. 모든 담긴 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (페이지), 크기 관련 선택 및 바코드 작은 RNA 종의 풍부는에 의해 수행 됩니다. 이 cDNA 라이브러리 준비는 파일럿 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 차세대 시퀀싱 (NGS)에 대 한 자료의 최적의 금액을 생산 하는 특정 증폭 주기의 결정 수 분 RNA 입력에 잘 적응. 이 이렇게 최대 35 년 동안 보관 하는 표본에서 저하 FFPE RNA의 사용을 위해 최적화 되었다 고 매우 재현 NGS 데이터를 제공 합니다.

서문

miRNAs는 포 르 말린 고정 파라핀 포함 (FFPE) 표본1,2,3에 너무나 잘 보존 된다. 이러한 짧은 규제 비 코딩 단일 좌초 RNA 분자의 표현을 FFPE 샘플에서 총 RNA를 사용 하 여 성공적으로 평가할 수 있다 고 관련 유전자 표현 데이터 원본 신선한에 비해 제공 이전 작품 시연 하고있다 조직4,,56,7,8. 비판적으로 FFPE 조직 처리 (포름알데히드, 열, 건조, 등), 내 생 RNases miRNAs (~ 18-24의 작은 크기는 견본의 나이 의해 영향을 받을 수 표시 된 큰 크기 메신저 RNAs에 비교 될 때 뉴클레오티드) 저하 방지 및 장기 저장, 보관 된 표본9의 높은 처리량 mRNA 연구를 능가할 미르 식 연구를 통해 증명 또한 탄력 있도록 나타납니다. miRNA 식 연구 주로 소규모 분석에서 수행 되었습니다, 보관 된 임상 견본을 사용 하 여 해당 단일 증명 또는 다중화 정량 PCR 분석 실험, microarray 기술, 그리고 가장 최근 NGS의 종류 수 있습니다. 이 분석 실험10,,1112,,1314의 최적화 후 보존 된 miRNAs의 식을 평가 하기 위해 사용.

그것은 명백한 되고있다 dysregulation 미르 식의 다양 한 인간 악성의 개발과 관련 된 되었습니다 하 고 보관 된 표본 주석는 잠재적으로 거 대 한 공급의 임상,을이 작은 RNA 분자는 잠재적인 암 바이오 마커의15,16,,1718의 유망한 소스를 나타냅니다. NGS 같은 높은 처리량 유전자 표현 기술의 사용 PCR 그리고/또한 microarrays19등 대상된 기술에 비교 될 때 모든 miRNA 성적표의 글로벌 평가 제공의 이점이 있다. 이러한 이유로, NGS 위한 이전 보관 된 표본에서 작은 RNAs의 cDNA 라이브러리 준비를 위한 최적화 된, 저렴 한 가격, 그리고 쉽게 적용 가능한 프로토콜 대규모 회고전 연구20수 있도록 최적화 되었다.

우리는 이전 우리 현대 상업 키트21을 능가할 수 있는 오래 된 보관 된 표본에서 RNA와 DNA의 별도 복구에 대 한 동시 RNA/DNA 추출 프로토콜을 설립. 시간의 연장된 기간 동안 보관 하는 FFPE 직물에서 총 RNA를이 추출 프로토콜을 사용 하 여, 우리 최대 35 년 동안 임상 표본에서 보존 하는 miRNAs의 NGS 위한 cDNA 라이브러리의 준비를 최적화. 또한, 최근에 출판 된 연구에서 우리가 어디에서 임상 분류 ductal 암에 제자리에 cDNA 라이브러리 (DCIS) 표본 준비, 우리는 표시 된 정량 PCR에 의해 검증 된 차동 표현 된 miRNAs 확인 그 특정 miRNA 표정 변화 DCIS 유방암을 개발 하지 않는 환자에서 DCIS 장애에 비해 유방암에 걸린 환자에서 병 변에서 감지 될 수 있습니다.

고려 상업 키트 작은 RNA cDNA 라이브러리의 준비를 위해, 그들의 중지에 대 한 잠재력의 비용으로 최적화할 수 없습니다 저작권/특허 보호 시 약의 사용, 우리는 이전 게시 된 적응 하기로 실험실 및 키트 무료 3' 바코드 cDNA 라이브러리 준비 위한 프로토콜 FFPE 표본에서 보관 하는 작은 RNAs의 NGS,22를샘플링 18의 동시 분석을 허용 합니다. 이 프로토콜 FFPE RNA 견본에 적응에 대 한 중요 했다, 시각 및 기술 평가 검문소와 이상적이 고 강력한 단계별 절차를 제공 하 고 손상 된 또는 어려운 다른 소스를 응용 프로그램에 대 한 강한 잠재력을가지고 이용 하 여 RNA 소재. 원래 프로토콜의 적용 형광 (예를 들어, SYBR 골드)와 방사성 레이블된 크기 마커를 대체 하 여 향상 되었습니다 감지 RNA 크기 마커 큰 polyacrylamide 젤에 합자 라이브러리의 선택 사용. 3' 18 개별 FFPE RNA 견본을에 바코드 어댑터의 결 찰 의존이 최적화 된 프로토콜 다음 5' 어댑터 결 찰을 함께 풀링된 리버스-전사, 그리고 파일럿 PCR 분석에 대 한 맞춤형 최종 cDNA의 증폭 높은 처리량 시퀀서에 대규모 PCR 증폭, 정화, 그리고 NGS 이전 도서관.

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프로토콜

1입니다. 모든 시 약 및 뇌관의 준비

  1. 그림 1에 설명 된 대로 모든 뇌관 및 어댑터를 주문.
  2. 준비는 교정기 칵테일 주식 각 개별 결 찰에 아군 것입니다.
    1. RNase 무료 물 0.5 µ m 캐리어 oligonucleotide (그림 1) resuspend 0.5 µ M 캐리어 oligonucleotide 솔루션을 사용 하 여 100 µ m 10 교정기 oligonucleotides (그림 1) resuspend
    2. 100 µ M 칵테일 교정기 재고를 시 microcentrifuge에서 10 교정기의 각각의 10 µ L를 결합 하 고-20 ° c.에 저장할 0.026 nM 솔루션 준비
  3. 20 고유, 동결 건조 된, adenylated 3' 어댑터 50 µ M (그림 1)의 최종 농도에 RNase 무료 물과 함께 희석.
    참고: 그것은 개별 시 튜브에 각 어댑터에서 2.5 µ L aliquots를 준비 하 고 2 년까지-80 ° C에서 그들을 저장 하 고 좋습니다.
  4. Resuspend desalted 19 nt-3' 어댑터와 24 nt-3' 어댑터 크기 마커 oligonucleotides 250 ng/ml (그림 1).
  5. RNAse 무료 물으로 100 µ m HPLC 정제 5' 어댑터 resuspend 100 5'과 3' PCR 뇌관 resuspend µ M RNase 무료 물 (그림 1)를 사용 하 여.
    참고: 약 수 1-2 실험 및-80 ° c.에가 게에 필요한 금액에 모든 oligonucleotides
  6. Polyacrylamide (PAA) 젤 1% 98.8 %formamide 결합 하 여 염료를 로드 (v/v) 0.5 M 나2H2 EDTA, pH 8.0 및 0.2 %bromophenol 파랑, 변성 시키기를 준비 하 고 1 mL aliquots-80 ° c.에 설정
    1. 나2H2 EDTA 분말의 18.6 g nuclease 무료 물 50 mL에 추가 하 여 0.5 M 나2H2 EDTA 솔루션을 준비 합니다. PH 8.0에 도달 NaOH 펠 릿을 추가 합니다. 0.5 M 나2H2 EDTA, pH 8.0 재고 솔루션을 얻을 수 100 mL를 볼륨을 조정 합니다.
    2. Bromophenol는 별도 15 mL 튜브에 파란색의 15 밀리 그램 무게. Nuclease 무료 물 600 µ L를 추가 합니다. 드 이온된 formamide의 14.25 mL를 추가 합니다. 0.5 M 나2H2 EDTA, pH 8.0 솔루션의 150 µ L를 추가 합니다.
    3. 약 수 1 mL aliquots-80 ° c.에 15 mL의 PAA 최종 솔루션
  7. Agarose 젤 0.2 %bromophenol 파랑, 0.2% 자일 렌 cyanol FF, 50 m 나2H2 m EDTA, pH 8.0, 및 20%를 결합 하 여 염료를 로드 x 5를 준비 Ficoll 유형-400.
    1. 나2H2의 1.86 g resuspend-실 온 (RT)에서 자력에 400 mL 비 커에 nuclease 무료 물 50 mL에 EDTA. PH 8.0 도달 NaOH 펠 릿을 추가 합니다. 50mm 나2H2 EDTA 솔루션을 얻을 수 100 mL에 도달 nuclease 무료 물을 추가 합니다.
    2. 50mm 나2H2 EDTA의 5 mL에 resuspend 그리고 bromophenol 블루 가루 20 mg, 20mg 자일 렌 cyanol FF 분말, 및 Ficoll 유형 400 가루 2 g 무게.
    3. 와 3을 포함 하는 관 동 염료 고 50mm 나2H2 EDTA의 5 mL를 추가 합니다. 5 x agarose 젤 로드 염료를 혼합 하 고, 1 mL aliquots, 준비 하 고-80 ° c.에 저장

2.에 3' 바코드 어댑터 Ligations 18 개별 RNA 샘플 설정

  1. 18 개별 RNA 표본을 식별 (pre-100 aliquoted nuclease 무료 물 1.5 mL 시 microcentrifuge 튜브에 9.5 µ L에서 ng), 10 분 녹을 얼음에 튜브를 설정.
  2. (ATP) 없이 RNA 리가 버퍼 신선한 x 10을 준비 합니다.
    1. 1.5 mL 시 microcentrifuge 튜브에 RNase 무료 물 343 µ L, 500 µ L 트리 1 M pH 7.5, 1 M MgCl2, 20 mg/mL 소 혈 청 알 부 민의 50 µ L의 14 M 2-mercaptoethanol 7 µ L의 100 µ L의 결합. 튜브, 2 원심 분리기를 터치 하 여 믹스 g와 RT, 그리고 설정된에서 얼음 x 2000에서 s.
      참고: 모든 단계에이 프로토콜을 나타내는 "원심 분리기 2 s" 튜브의 하단에 솔루션을 수집 RT 2000 x g의 최고 속도에서 벤치탑 microcentrifuge에서 수행 됩니다.
  3. 2 mL 시 microcentrifuge 관에서 DMSO의 1 mL에 물 RNase 무료의 1 mL을 추가 하 여 50% 수성 DMSO 주식을 준비 하 고, 알루미늄 호 일에 튜브를 포장 하 고 실시간 저장
  4. 1.5 mL 시 microcentrifuge 관에서 다음 순서로 결합 하 여 10 분 준비 결 찰 마스터 믹스에 대 한 얼음에 0.026 nM 캘 리브레이 터 칵테일을 없애다: RNA 리가 버퍼와 200 mL 피 펫을 사용 하 여 50% 수성 DMSO의 120 µ L 10의 40 µ L 10 µ L 피 펫을 사용 하 여 칵테일 0.026 nM 교정기의 10 µ L을 추가 하 고. 터치 믹스 2 s, 및 설정에 대 한 원심을 1.5 mL 튜브 얼음에 그것.
  5. 부드럽게 터치 튜브, 2 s, 그리고 얼음에 저장소에 대 한 원심 분리기, 18 개별적으로 aliquoted FFPE RNA 샘플의 각각 결 찰 마스터 믹스 8.5 µ L를 추가 합니다.
  6. 18, 3' 바코드 어댑터의 각 2.5 µ L aliquots를 녹 인 다 고 20 분 녹을 얼음에 넣어.
    1. 3 µ L 피 펫을 사용 하 여 각 어댑터의 1 µ L RNA 및 결 찰 마스터 믹스 (즉, 9.5 µ L + 8.5 µ L) 포함 된 해당 FFPE RNA 샘플을 전송.
    2. 하지를 위아래로 플라스틱, 단순히 액체에 분배 하 고 팁을 꺼내. 팁 FFPE RNA 샘플 사이 변경할 수 있는지 확인 합니다. 각 튜브를 닫습니다, 터치 믹스, 하 원심 분리기 2 s, 그리고 얼음에 설정된에 대 한.
  7. 1 분 동안 90 ° C에서 열 블록에 18 튜브를 배치 하 여 반응을 변성 하 고 즉시 얼음에 놓습니다.
  8. 준비 결 찰 효소 솔루션 diluting 10 µ L 잘린 K227Q T4 RNA 리가 2의 RNase 무료의 10 µ L로 하 여 물 시 신선한 1.5 mL microcentrifuge 튜브로.
  9. 3 µ L 피 펫을 사용 하 여 각 18 RNA 샘플의 희석된 결 찰 효소의 1 µ L를 전송 (아래로, 플라스틱 없고 각 튜브 사이의 팁을 변경). 얼음에 18 ligations를 설정 하 고 4 ° C 18 h의 야간 보육에 대 한 차가운 공간에 둡니다.

3입니다. 합자 작은 RNAs의 정화

  1. 90 ° C에서 열 블록에 1 분 18 튜브를 삽입 하 여 결 찰 반응을 비활성화 하 고 진정 적어도 2 분 동안 얼음에 반환 합니다.
  2. Covalently 5 M RNase 무료 NaCl의 26 µ L glycogen 신선한 시 microcentrifuge 튜브로 연결 된 파란 염료의 1 µ L을 추가 하 여 강 수 마스터 믹스를 준비 합니다.
    1. 각 18 튜브로 강수량 마스터 믹스의 1.2 µ L를 전송 합니다. 18 관의 각 100% 에탄올의 63 µ L를 추가 합니다. 각 튜브를 닫습니다, 터치 믹스, 2 s, 그리고 장소에 대 한 원심 하 얼음에 튜브. 시 단일 1.5 mL 튜브에 모든 18 튜브의 내용을 결합 합니다.
    2. 튜브를 닫습니다, 그리고 2 s, 그리고 침전에 60 분 동안 얼음에 대 한 혼합, 원심 분리기를 세 번 반전.
  3. 페이지에 대 한 큰 (16 x 20 cm2) 15 %polyacrylamide 젤을 준비 합니다.
    1. 캐스트 2 시 0.1 cm 스페이서가 유리 접시 (안전한 대안 실 란 코팅을 함께 처리).
    2. 시스템 희석제, 시스템 집중, 시스템 버퍼의 3 mL, ap (9%), 240 µ L의 50 mL 튜브에서 TEMED의 12 µ L 18 mL의 9 mL을 결합 합니다.
    3. 30 mL 피 펫을 사용 하 여 유리 접시 사이 페이지 젤 솔루션 전송, 14 잘 빗 (0.1 c m 두께), 삽입 하 고 젤 30 분 RT에서 공고히 하자.
  4. 16000 x g 및 60 분 동안 4 ° C에서 풀링된 ligations와 1.5 mL 튜브 원심
  5. 빗을 제거 합니다. RNase 무료 물 우물 안에 도달 하는 싱크대 위에 (하나 잘 한 번에) 취소 polymerized 아크릴 끝 200 µ L 팁 물 총 병을 사용 하 여 풍부 하 게 우물을 청소. 설정 15% 페이지 젤 기구에 트리 스 Borate EDTA (TBE) 솔루션, x 0.5 저수지 작성 및 미리 30 분 젤 450 V에서 실행.
  6. 원심 분리기에서 풀링된 ligations와 튜브를 복구 하 고 신중 하 게 RNA 펠 릿 건조.
    1. 1 mL 피 펫 팁 상쾌한 제거 하지만 하단에 어떤 액체를 두고. 튜브를 기울기 고 20 mL 피 펫을 사용 하 여 나머지 상쾌한 펠 릿을 건드리지 않고 제거. 진공 흡입 튜브의 끝에 10 µ L 팁 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 펠 릿을 건드리지 않고.
    2. 튜브를 터치 하 여 RNA 펠 릿 RNase 무료 물 20 µ L에서 resuspend. PAA 젤 resuspend RNA, 터치 믹스 하는 솔루션을 로드의 20 µ L를 추가, 2 원심 분리기 RT, 토를 1 분 동안 90 ° C에 튜브를 설정 하 고 즉시 얼음에 장소.
  7. 양쪽 (그림 2)에 2-빈 우물을 떠나는 신선한 0.5 x TBE, 고 부하, 사다리 크기 마커, 그리고 합자 miRNAs는 젤의 센터에서 젤 기구의 교체 0.5 x TBE.
  8. 젤 450 V에서 실행 (35 mA) 60 분, 10 분, 진정 하 고 다시 520 V에서 실행에 대 한 실행을 일시 중지 (25 mA) 대 한 또 다른 60 분 Uncast 15% 유리 접시 중 하나를 제거 하 여 페이지.
  9. 가볍게 유리 접시에 젤 스프레이 TBE, 고 x 0.5 25 mL에 형광 염료 솔루션 (10 µ L)으로 평면 어둠 속에서 5 분 동안 앉아.
  10. 파란 가벼운 transilluminator에 젤과 유리를 놓고 정렬 모두 19 nt와 합자 작은 RNAs (그림 2)의 절단을 직접 통치자와 24 nt 크기 마커. 젤 삭제하시오
  11. 장소 삭제 젤 0.5 mL 튜브, 조각 젤 조각, 시 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 안전 하 게 위치 하도록 설계 되었습니다. 실시간 Resuspend에서 3 분 16000 x g에서 400 mM NaCl 솔루션의 300 µ L로 조각난된 젤 centrifuge 튜브, 닫고 파라핀 영화와 함께 그것을 봉인.
  12. 야간 보육 (16-17 h)에 대 한 4 ° C 차가운 방에 1100 rpm에서 thermomixer에 동요에 튜브를 설정 합니다.

4입니다. 5' 어댑터의 결 찰

  1. 전송 솔루션 및 5 µ m 필터에 조각난된 젤 시 1.5 mL 튜브에 앉아 튜브, 파라핀 필름, 인감 및 g 및 실시간 x 2300에서 5 분 동안 원심
  2. 필터링된 솔루션을 100% 에탄올의 950 µ L를 추가, 튜브를 닫고, 혼합, 2 원심 반전 s, 파라핀 필름, 튜브를 밀봉 하 고 1 시간에 대 한 얼음에 설정.
  3. 12% 페이지 젤 3.3, 단계에서 설명한 대로 준비 하지만 희석제, 집중, 버퍼의 3 mL의 14.4 mL의 12.6 mL, 240 µ L APS, 50 mL 튜브에 TEMED의 12 µ L을 결합 하 여. 사전 실행 12 %450 V에서 30 분 동안 페이지 젤 (~ 35 mA) 0.5에서 x TBE.
  4. 4 ° c.에 60 분 16000 x g에서 순화 된 작은 RNA 솔루션을 원심
  5. 조심 스럽게 1 mL 피 펫을 사용 하 여 솔루션의 대부분을 제거 하 고 펠 릿을 건드리지 않고 나머지 솔루션을 제거 하려면 200 mL 피 펫을 사용 하는 상쾌한 밖으로 플라스틱.
  6. 진공 플라스 크에 연결 하는 그것의 끝에 10 mL 팁 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 신중 하 게 건조 한 펠 릿 그것을 건드리지 않고.
  7. 아래로, pipetting 없이 RNase 무료 물 9 µ L에 펠 릿을 resuspend 하지만 가볍게 터치 튜브, 하 여 원심 2 s, 및 세트 얼음에 튜브.
  8. 1 M Tris pH 7.5의 500 µ L를 결합 하 여 RNA 리가 버퍼 (ATP) 신선한 x 10을 준비, 1 M MgCl2, 20 mg/mL의 50 µ L의 100 µ L acetylated BSA, 10 m ATP, 2-mercaptoethanol의 7 µ L m의 200 µ L 14 M 그리고 143 µ L RNase 무료 물.
  9. 튜브를 터치 하 여 RNA 리가 버퍼 (ATP)와 x 10을 혼합 하 고 2에 대 한 원심 튜브의 하단에 솔루션을 수집 하는 s.
  10. RNA 리가 버퍼 (ATP), x 10의 추가 2 µ L 5' 어댑터 결 찰 설정 100 µ M 5' 어댑터 및 9 µ L, 3' 바코드 작은 RNA 솔루션을 6 µ L 50% 수성 DMSO의 1 µ L.
  11. 가볍게 혼합, 2 원심 튜브 영화 s 솔루션을 수집 하 고 적어도 2 분 동안 얼음에 다시 1 분 동안 90 ° C에서 열 블록에 튜브 장소.
  12. 추가 솔루션에 T4 RNA 리가 1 2 µ L (할 하지 플라스틱 아래로), 튜브, 원심 분리기 2 s, 그리고 떠 있는 튜브 랙 60 분 동안 37 ° C 물 욕조에 앉아에 대 한 영화.
  13. 동시에, 19 nt-3 사이 2 개의 ligations 설정 ' 어댑터와 5' 어댑터, 그리고 24 nt-3 사이 2 개의 ligations' 어댑터와 어댑터 5'.
    1. 2 µ L 19nt-3의 결합 ' 어댑터 (250 ng / µ L) 또는 24 nt-3' 어댑터 (250 ng / µ L): 5' 어댑터 (100 µ M), RNA 리가 버퍼 (ATP), x 10의 2 µ L의 2 µ L 50% 수성 DMSO, RNase 무료 물 6 µ L의 6 µ L 그리고 시 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 T4 RNA 리가 1 2 µ L.
    2. 터치 믹스, 2 s, 및 설정에 대 한 원심 관 튜브 60 분 동안 37 ° C에서.
  14. 20 µ L PAA 변성 시키기 버퍼의 모든 ligations에 추가 (작은 RNAs, 19nt-3 2 ligations 정화 ' 어댑터, 그리고 24nt-3 2 ligations' 어댑터).
    1. 튜브, 2 원심 분리기를 터치 하 여 믹스 s, 얼음, 모든 튜브 1 분 전송에 대 한 90 ° C에서 열 블록에 튜브를 품 어 그리고 사다리 (3 mL의 사다리와 함께 PAA의 20 µ L)를 준비.
  15. 사전 실행 젤 기구의 위 저수지 비어 12% 페이지 젤, 그리고 신선한 0.5 x TBE 솔루션 (웰 스는 길고, 얇은 팁 피 펫을 비우지는) 우물의 수준 아래에 추가.
    1. 그림 3에 설명 된 대로 얇은 피 펫 팁과 샘플을 로드 합니다.
    2. 젤 상단에 개별 우물을 채우기 위해 사용 신선한 0.5 x TBE.
    3. 신선한 0.5 추가 x TBE 우물과 시작 12%의 전기 이동 법 위에 저수지에 450 V에서 60 분에 대 한 페이지 (~ 35 mA).
    4. 젤을 10 분 동안 발전기에서 전환 하 여 실행을 일시 중지 합니다. 생성자를 다시 시작 하 고 60 분 젤 520 V에서 실행 (25 mA).
  16. 발전기, 멈추고, 반전, 싱크대 위에 장치 하 여 저수지 비어 12 %uncast 유리 접시 중 하나를 제거 하 여 페이지.
  17. 앉아 젤 평면 유리, 스프레이 젤 25 mL 0.5에에서 형광 염료의 10 µ L x TBE, 5 분 블루 빛 transilluminator에 젤과 유리 하다 대 한 어둠 속에서 알을 품고 있고 정렬 모두 19 nt 및 모두는 24 nt 크기 마커 (그림 3) 합자 작은 RNAs의 절단을 직접 통치자.
    1. 젤을 삭제할 고 삭제 젤 조각 0.5 mL 젤 분리기 관으로 전송. 젤 브 레이 커 튜브 1.5 mL 시 microcentrifuge 튜브로 설정 하 고 파라핀 영화와 함께 보안의 뚜껑을 닫습니다. 젤 브 레이 커 튜브 제거, 1.5 mL 튜브에 짓 눌린된 젤 조각 300 mm NaCl, 300 µ L 및 100 µ M 3' PCR 뇌관의 1 µ L를 추가.
    2. 추운 방에 (17-18 h) 4 ° C에서 1100 rpm에서 thermomixer에 동요 하룻밤에 파라핀 영화와 함께 튜브를 봉인.

5. 리버스는 5' 출혈의 전사 및 3' 바코드 정화 작은 RNAs

  1. 검색에서 thermomixer와 필터 튜브 5 µ M 필터 튜브 솔루션 정화.
    1. 전송 5 µ M 필터 튜브 1.5 mL에 삽입에 솔루션을 1 mL 피 펫 사용 시 RNase 무료 컬렉션 튜브. G 및 실시간 x 2300에서 3 분 동안 관을 원심
    2. 필터 튜브를 버리고 고 1.5 mL microcentrifuge 컬렉션 튜브 포함 하는 필터링된 솔루션을 100% 에탄올의 950 µ L를 추가 합니다. 혼합, 2 s, 및 60 분 centrifuging 16000 x g 및 1 시간에 4 ° C에 튜브에 의해 작은 RNA 침전 ice에 대 한 원심 분리기 튜브 반전.
  2. RNA 펠 릿 건조.
    1. 뚜껑 열고 하단에 어떤 액체를 떠나는 1 mL 피 펫과 상쾌한을 조심 스럽게 제거 합니다.
    2. 20 µ L 피 펫을 사용 하 여 모든 나머지 상쾌한 펠 릿을 건드리지 않고 제거. 펠 릿의 반대편에 앉아 어떤 해결책 든 지 수 있도록 튜브 기울기.
    3. 10 mL 필터링 되지 않은 피 펫 팁 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여는 상쾌한 발음 하 고 건조 한 진공 청소기를 사용 하 여 펠 릿을.
  3. RNase 무료 물 5.6 µ L에서 RNA 펠 릿을 resuspend.
    1. RNase 무료의 5.6 µ L를 버퍼, 4.2 µ L의 10 x deoxynucleotide 3 인산 염 (dNTPs) (각 2 m m), 및 dithiothreitol (DTT)의 1.5 µ L x 5의 3 µ L을 추가 하 여 반전 녹음 방송 반응을 15 분 설정에 대 한 얼음에 반전 녹음 방송 시 약을 녹 인 다 resuspended 펠 릿입니다.
    2. 혼합 반응, 2 원심을 튜브를 부드럽게 터치 솔루션을 수집 하는 s. 정확히 30 s와 50 ° c.에 thermomixer에 직접 다음 전송에 대 한 90 ° C에서 열 블록에 반응 설정
    3. 온도 균일화를 2 분 동안 thermomixer에 튜브를 둡니다. 튜브 30 분 50 ° C에서 thermomixer에 즉시 다시 집합, 솔루션, 부드럽게를 섞어, 영화에 직접 역 전사 효소의 0.75 µ L를 추가 합니다.
  4. 30 분, 후 반전 녹음 방송 중지를 1 분 동안 95 ° C에서 열 블록에 튜브를 전송 합니다. 반전 녹음 방송에 직접 RNase 무료 물 95 µ L을 추가 하 고 혼합, 튜브 영화 2 분 동안 얼음에 직접 설정.
  5. CDNA 재고 라이브러리 및 라이브러리 id 튜브 라벨

6. 파일럿 PCR 및 대규모 PCR 증폭

  1. 신선한 10 x PCR 버퍼 RNase 무료 물 추가 304 µ L에 의해, 2 M KCl, 1 M Tris pH 8.0의 50 µ L의 125 µ L를 준비 1 M MgCl2의 10 µ L, 1% 트라이 톤 X-100, 그리고 6 µ L의 1 M 2-mercaptoethanol 시 microcentrifuge 튜브에서의 5 µ L 실시간에 계속
  2. RNase 무료 물 67 µ L, 10 µ L PCR 버퍼, 10 µ L 10 x dNTPs, 100 µ M 5' PCR 뇌관, 100 µ M 3' PCR 뇌관의 0.5 µ L, 사진 라이브러리, cDNA의 10 µ L의 0.5 µ L의 x 10의 그리고 50의 2 µ L를 결합 하 여 파일럿 PCR 반응 조립 x Taq 중 합 효소.
    1. 2 설정 PCR 주기는 thermocycler에 다음과 같이: 45 1: 94 ° C 파일 s, 50 ° C 85에 대 한 s, 및 60 72 ° C 10 사이클에 대 한 s 4 ° C;에서 개최 파일 2: 94 ° C 45 s, 50 ° C 85에 대 한 s, 및 60 72 ° C s 2 사이클, 4 ° c.에서 개최 thermocycler에서 파일럿 PCR 반응 고 파일 1을 시작 합니다.
    2. 파일의 끝 1, PCR 튜브를 열고 20 µ L 피 펫을 사용 하 여 전송 12 µ L의 5 x 3 µ L을 포함 하는 1.5 mL microcentrifuge 관으로 파일럿 PCR 반응에서 염료를 로드 젤, 아래로 pipetting으로 혼합, 튜브 및 "10 주기" 레이블을.
    3. 파일럿 PCR 튜브를 닫고는 thermocycler에서 파일 2를 시작 합니다. 파일 끝에의 2, PCR 튜브 및 20 mL 피 펫을 사용 하 여 솔루션의 12 µ L 1.5 mL microcentrifuge 튜브 젤 로드 염료, x 5의 3 µ L로 전송 열고 "12 사이클" 레이블을.
    4. 6.2.2 고 6.2.3 파일럿 PCR 반응에서 PCR 주기 14, 16, 18, 및 20에서 12 µ L PCR 제품을 수집 하는 단계에 설명 된 단계를 반복 합니다. 각 12 µ L PCR aliquots 젤 로드 염료 x 5의 3 µ L을 추가 하 고 20 nt 사다리 사다리의 3 µ L 및 RNase 무료 물 9 µ L를 포함.
  3. 0.5와 2.5 %agarose 젤 준비 x TBE.
    1. 깨끗 한 비 커에 agarose의 2.5 g의 무게와 0.5의 100 mL를 추가 x TBE. 전자 레인지에 솔루션을 열 때 그것은 종 기까지. 전자 레인지에서 솔루션을 제거, 소용돌이 agarose를 혼합, ethidium 평범한 사람 (10mg/mL)의 4 μ를 추가 하 고 솔루션 테이프로 양쪽 끝에 폐쇄 7 x 10 cm2 전기 이동 법 용지함에 전송 하는 병.
    2. 설정 8 잘 빗 고 응고 agarose 젤 전기 이동 법 기구 0.5로 가득에 실시간 전송에서 공고히 agarose 젤 x TBE.
  4. 사다리와 agarose 젤에 PCR 샘플을 로드 하 고 120 V에서 30 분 동안 그것을 실행.
  5. 최적의 PCR 주기 (그림 4A)를 식별 하는 UV 상자에 젤을 평가 합니다.
    참고: 예상된 PCR 밴드의 크기는 그림 4B에 표시 됩니다.
    1. 관찰 다른 우물의 각 두 개의 PCR 밴드 (위 밴드: DNA 도서관, 낮은 밴드: 뇌관 이합체).
    2. CDNA 라이브러리 표시 하 하지만 뇌관 이합체는 거의 주기를 선택 하 여 cDNA 증폭에 대 한 적절 한 PCR 주기를 식별 관찰.
      참고: 일반적으로, 적절 한 PCR 주기 12-16 주기 사이 선택 됩니다. 그림 4A에이 라이브러리에 대 한 적절 한 PCR 주기는 14 이다.
  6. Agarose 젤 라이브러리 정화에 대 한 대규모 PCR 반응 (6 x 100 µ L)를 설정 합니다.
    1. PCR 버퍼 다음 단계 6.1 x 10의 신선한 튜브를 준비 합니다.
    2. 1.5 mL 튜브에 대규모 PCR 주인 혼합 RNase 무료 물, 10 x PCR 버퍼, 65 µ L 10 x dNTPs의 5' PCR 뇌관, 3' PCR 뇌관, 및 혼합 아래로 pipetting 3.25 µ L의 3.25 µ L의 65 µ L의 435.5 µ L를 결합 하 여 준비 합니다.
    3. 6 0.5 mL PCR 튜브에 PCR 주인 혼합의 88 µ L를 전송 합니다. 10 µ L cDNA 재고 라이브러리 (얼음에 저장 된)의 전송, 6 PCR 튜브의 각 50 x Taq 중 합 효소의 2 µ L을 추가 하 고 혼합 플라스틱.
    4. RNase 무료 물, 10 x PCR 버퍼의 10 µ L, 10 x dNTPs의 10 µ L, 5' PCR 뇌관의 0.5 µ L, 0.5 µ L 3' PCR 뇌관의 그리고 50 x Taq 중 합 효소, 및 혼합 피 펫 2 µ L의 77 µ L를 결합 하 여 부정적인 PCR 반응 관을 준비 합니다.
    5. PCR 튜브 thermocycler PCR 주기 단계 6.2.1에서에서 설명 하 고 증폭 사이클의 최적의 수 설정을 사용 하 여 놓습니다. 0.5를 사용 하 여 2.5 %agarose 젤 준비 x TBE, 단계 6.3에서에서 설명한 대로.
  7. PCR 확대 후 전송할 9 µ L 각 PCR 튜브에서 6 1.5 mL microcentrifuge 관 젤 로드 염료 x 5의 3 µ L를 포함.
    1. RNase 무료 물과 1.5 mL 튜브에 염료를 로드 하는 추가 3 µ L 젤 9 µ L에 사다리의 3 mL을 결합 하 여 20 nt 사다리를 준비 합니다.
    2. 사다리, 부정적인 PCR 제어, 그리고 6 PCR 제품 agarose 젤에 로드 하 고 30 분 동안 젤 120 V에서 실행.
    3. UV 상자 (이미지 걸릴에) 차선 사이 PCR 확대의 균일성을 확인 합니다.
    4. 두 시 1.5 mL microcentrifuge 튜브 (3 x 91 µ L)으로 3 PCR 반응 결합, 5 M NaCl의 27 µ L 및 100% 에탄올의 950 µ L를 추가 합니다. 혼합-20 ° C 하룻밤 침전 PCR 제품에서 그들을 설정 하는 튜브를 반전.

7. cDNA 라이브러리 정화 및 평가

  1. 4 ° c.에 60 분 16000 x g에서 PCR 반응 두 튜브 원심
  2. 1 mL 피 펫과 상쾌한 제거 그리고 기울기 상부에 펠 릿와 더 낮은 측에 액체 튜브 욕조와 진공 플라스 크에 연결 된 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 액체 10 mL 팁 파스퇴르 피 펫의 끝에 발음 하는 고.
  3. PmeI 다이제스트를 설정 합니다.
    1. Nuclease 무료 물, 17.5 µ L PCR 펠 릿 중 하나를 resuspend 하 고 resuspended 펠 릿 두 번째 PCR 펠 릿을 전송. 버퍼 x 10의 2 µ L 및 PmeI 효소의 0.5 µ L을 추가 하 고 37 ° c.에 2 h 물 욕조에 다이제스트를 설정
    2. 0.5를 사용 하 여 2.5 %agarose 젤 준비 x TBE (단계 6.3). 다이제스트를 젤 로드 염료 x 5의 6 µ L를 추가 합니다. Agarose 젤의 두 인접 한 우물으로 각 다이제스트의 13 µ L를 전송, 끝 웰 스에서 20 nt 크기 사다리를 로드 하 고 실행 (그림 4D) 150 V에서 90 분 젤.
    3. UV 상자에 젤에서 상단 PCR 악대 소비 세, 갓 무게 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 젤 조각 전송 및 규모에 젤 조각 무게.
  4. 제조업체의 지침에 따라 젤 추출 키트를 사용 하 여 삭제 PCR 증폭된 cDNA 라이브러리를 정화. 계량 DNA 정량화 분석 결과 및 제조업체의 지침에 따라 악기를 사용 하 여 cDNA 라이브러리.
  5. 크기와 Bioanalyzer (그림 5)에 높은 감도 DNA 칩과 cDNA 라이브러리의 순도 평가 합니다. 높은 처리량의 시스템을 사용 하 여 cDNA 라이브러리 시퀀스입니다. 어댑터 트리밍 및 미르 시퀀스를 식별 하는 인간 게놈에 정렬에 대 한 RNAworld 파이프라인에 FASTQ 데이터 파일을 전송.

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결과

총 18 개별 FFPE RNA 샘플 메서드는 여기에 설명 된 대로 (100 ng 각) 3' adenylated 바코드 oligonucleotide T4 내 고 하룻밤을 별도 튜브에 설정 됩니다. 다음 날, 효소 반응 열 비활성화, 결합, 되며 단일 튜브에 침전. RNA 펠 릿 resuspended와 합자 RNA 분자 15 %polyacrylamide 젤 (페이지), 페이지 젤의 인접 한 우물에 하는 RNA oligonucleotide 크기 마커를 적절 하 게 크기의 3' 바코드를 선택 하는 데 사?...

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토론

NGS FFPE RNA 표본에서 보관 하는 작은 RNAs의에 대 한 높은 재현성 및 강력한 cDNA 라이브러리 준비 프로토콜 Hafner 외. 에 의해 설명 하는 절차의 수정 하 고 최적화 된 버전은이 프로토콜에서 제공 됩니다. 22

이 프로토콜의 모든 단계는 FFPE 표본에서 발견 이전 보관 및 손상 된 총 RNA와 함께 사용 하기 위해 최적화 되었습니다. 이 프로토콜 FFPE RNA의 적은 양?...

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공개

저자는이 원고에 표시 하는 데이터의 일부를 포함 하는 간행물 Loudig 그 외 여러분 에 의해 분자 과학의 국제 저널에 출판 되었음 공개 하고자 21.

감사의 말

우리는 박사 토마스 Tuschl, RNA 분자 생물학 실험실의 머리 뿐만 아니라 그들의 지원에 대 한와 그의 실험실에 RNAworld 파이프라인에 대 한 액세스를 제공 하는 개발 된 기술을 공유 하기 위한 그의 실험실의 구성원 감사. 우리는 또한 그의 프로토콜을 공유 하 고 그의 초기 절차에 사용 된 모든 생화학 및 효소 단계에 자세한 설명을 제공 하 박사 마르쿠스 Hafner 감사 합니다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
1% Triton x-100InvitrogenHFH10
10mM ATPAmbionAM8110G
10X dNTPsAmbionAM8110G
10x TBEThermofisher Scientific15581044
14M MercaptoethanolSigmaO3445I-100
20 nt ladderJena BioscienceM-232S
20mg/ml Bovine Serum AlbumineSigmaB8894-5ML
50X Titanium TaqClontech Laboratories639208
Ammonium PersulfateFisher Scientific7727-54-0
BRL Vertical Gel Electrophoresis System with glass plates and combsGIBCOV16
Dimethyl sulfoxide (DMSO)SigmaD9170-5VL
Eppendorf microcentrifuge 5424RUSA scientific4054-4537Q
Eppndorf ThermomixerUSA scientific4053-8223Q
Fisherbrand™ Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5mlFisher Scientific02-681-320
Gel Breaker Tube 0.5 mlIST Engineering Inc,3388-100
Gel electrophoresis apparatus 7cm x10cm- Mini-sub Cell GT with gel trays and combsBiorad1704446
GlycoblueAmbionAM9516
Jersey-CoteLabScientific, Inc1188
KcL 2MAmbionAM9640G
MgCl2 1MAmbionAM9530G
Minifuge dual rotor personal centrifugeUSA scientific2641-0016
Model V16 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus, glasses, combs, and spacersCiore Life Science21070010
OligonucleotidesIDTDefined during order
Owl EasyCast B2 mini electrophoresis system- with gel trays and combsThermofisher ScientificB2
Qiaquick Gel Extraction kitQiagen28704
Restriction enzyme PmeINEBR0560S
RNase-free waterAmbionAM9932
Safe Imager 2.0Life TechnologiesG6600
Safe Imager 2.0 blue light transilluminatorThermofisherG6600
SeaKem LE agaroseLonza50002
Superscript III reverse transcription kitInvitrogen18080-044
SybrGoldLife TechnologiesS11494
T4 RNA Ligase 1NEBM0204S
T4 RNA Ligase 2 Truncated K227QNEB0351L
TEMEDFisher ScientificO3446I-100
Themocycler with heated lidApplied Biosystem4359659
Tris 1M pH 7.5Invitrogen15567027
Tris 1M pH8.0AmbionAM9855G
UltraPure Sequagel system concentrate, diluent, and bufferNational DiagnosticsEC-833

참고문헌

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