Fabricación, pruebas y uso de microelectrodos selectivos de Ion potasio en rebanadas del tejido del cerebro adulto

Resumen

Iones del potasio contribuyen al reclinación potencial de la membrana de las células y la concentración extracelular de K⁺ es un regulador crucial de excitabilidad celular. Describimos cómo realizar, calibrar y utilizar monopolar K⁺-microelectrodos selectivos. Uso de tales electrodos permite la medición de la dinámica de concentración de K⁺ eléctricamente evocado en rebanadas de hipocampales adulto.

Resumen

Los iones de potasio contribuyen significativamente al reclinación potencial de la membrana de las células y, por tanto, la concentración extracelular de K⁺ es un regulador crucial de la excitabilidad de la célula. Altera las concentraciones de efecto extracelular de K⁺ la excitabilidad celular y potencial de membrana reposo cambiando los equilibrios entre los Estados cerrados y abiertos inactivados para canales voltaje-dependientes del ion que subyacen a potencial de acción iniciación y conducción. Por lo tanto, es valiosa para medir directamente la dinámica extracelular de K⁺ en salud y los Estados enfermos. Aquí, describimos cómo realizar, calibrar y utilizar monopolar K⁺-microelectrodos selectivos. Les implantamos en rebanadas de cerebro hipocampo adulto para medir eléctricamente evocado dinámica de concentración de K⁺ . El uso juicioso de estos electrodos es una parte importante de las herramientas necesarias para evaluar los mecanismos celulares y biofísicos que controlan las concentraciones extracelulares de K⁺ en el sistema nervioso.

Introducción

Las concentraciones de iones de potasio están estrictamente reguladas en el cerebro, y sus fluctuaciones ejercen una poderosa influencia sobre el potencial de membrana en reposo de todas las células. A la luz de estos aportes críticos, un objetivo importante de la biología es determinar los mecanismos celulares y biofísicos que se utilizan para regular estrechamente la concentración de K⁺ en el espacio extracelular en diferentes órganos del cuerpo^{1 , 2}. un requisito importante en estos estudios es la capacidad de medir con precisión las concentraciones de K⁺ . Aunque muchos componentes que contribuyen a la homeostasis del potasio en el cerebro en Estados sanos y enfermos se han identificado^3,4,5, más progreso ha sido más lento debido a la naturaleza especializada de preparación de microelectrodos selectivos de iones para la medición de potasio. Sensores de microelectrodo representan el estándar de oro para la medición de K⁺ concentraciones en vitro, en rebanadas de tejido y en vivo.

Nuevos enfoques para K⁺ control están bajo desarrollo de sensores ópticos, sin embargo estos no detectan una concentraciones biológicamente relevante rango de K⁺ o han no sido completamente validados en los sistemas biológicos, aunque los resultados iniciales parece prometedor^6,7,8. En comparación con sensores ópticos, microelectrodos son fundamentalmente limitadas a una medición puntual de iones, aunque arreglos de electrodos podrían mejorar la resolución espacial⁹. Este artículo se centra en los sensores de microelectrodo sola-barreled para el monitoreo de la dinámica de K⁺ .

En este trabajo, nos informe los procedimientos detallados paso a paso para hacer K⁺ microelectrodos selectivos, usar un ionóforo valinomycin basado en potasio que permite altamente selectiva (10⁴ veces K⁺ a selectividad Na⁺ ) K⁺ movimiento sobre membranas¹⁰. Un polipéptido natural, valinomycin actúa como un poro permeable de K⁺ y facilita el flujo de K⁺ hacia abajo de su gradiente electroquímico. También describimos cómo calibrar los electrodos, cómo almacenar y utilizarlos y, finalmente, cómo implementar para medir la dinámica de concentración de K⁺ en rebanadas agudo cerebro hipocampo de ratones adultos. El uso de tales electrodos junto con ratones modificados genéticamente que carecen de canales iónicos específicos de propuestas para regular la dinámica de K⁺ extracelular debe revelar los mecanismos celulares utilizados por el sistema nervioso para el control de la concentración ambiental de K ⁺ en el medio extracelular.

Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con el Instituto Nacional de salud guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio y fueron aprobados por el Comité de investigación Animal del Canciller de la Universidad de California, Los Ángeles. Todos los ratones estaban alojados con disposición comida y agua ad libitum en un entorno de luz-oscuridad de 12 h. Todos los animales estaban sanos sin cambios de conducta evidentes, no participaron en los estudios anteriores y fueron sacrificados durante el ciclo de luz. Se recolectaron datos de experimentos de ratones adultos (6-8 semanas para todos los experimentos).

1. preparación de microelectrodos selectivos K⁺

1. Silanización del vidrio de borosilicate
   1. Retire suficiente Capillares de vidrio de embalaje y coloque en un tubo cónico de 50 mL. Llene el tubo cónico hacia arriba con electrodos de 1 M HCl. lavado con agitación suave ácido clorhídrico durante la noche o por un mínimo de 6 horas.
   2. Enjuague los tubos capilares con etanol al 70% y séquelo completamente a 100-120 ° C durante 6-8 horas. Almacene lavados capilares en envases con desecante sulfato de calcio anhidro para hasta 4 semanas antes de su uso posterior.
   3. Antes de silanización, tire los capilares a una punta fina usando un extractor de microelectrodos. Los microelectrodos que utilizamos son aproximadamente 2-5 micras de diámetro. Manipule siempre lavados capilares con guantes, como los aceites de la piel pueden interferir con silanización.
   4. Colocar microelectrodos en un recipiente de vidrio para que los electrodos se elevan de la parte inferior para evitar la rotura de la punta. Fijar los microelectrodos al contenedor usando cinta de autoclave o similar cinta adhesiva.
   5. Retire aproximadamente 0,5 mL de solución de silanización de Diclorodimetilsilano 5% (DDS) de su envase usando el método de sustitución del nitrógeno (ver figura 2). Llenar un globo con gas nitrógeno y coloque una jeringa o tubo y aguja en el globo. Inserte la aguja en el recipiente DDS mientras elaboración de DDS en una jeringa separada a través de una aguja más larga.
   6. Aplique la solución de silanización gota a gota a las puntas de las pipetas y cubrir inmediatamente. Coloque el recipiente con los microelectrodos con solución de silanización en un horno de laboratorio (170-180 ° C) precalentado durante 10-12 horas o a 200-220 ° C durante 30 minutos
   7. Después de la incubación, apague el horno y luego retire la placa del horno. Tenga cuidado al retirar la placa de la incubadora, ya que es muy caliente. Coloque la placa en un banco a temperatura ambiente durante 10-15 minutos para permitir que el vidrio se enfríe.
   8. Quite los microelectrodos de la placa (usando una hoja de afeitar u hoja de bisturí para cortar la cinta) y colocarlos en un recipiente hermético relleno desecante. Silanizada microelectrodos mantenidas libres de humedad se pueden utilizar hasta 1 semana después de silanización.
2. Cebado de los electrodos
   1. Preparar una solución madre de K⁺ ionóforo cóctel: valinomycin w/v de 5%, 93% v/v 1, 2-dimetil-3-nitrobenceno, potasio 2% w/v tetrakis(4-chlorophenyl) borato¹¹. Esta solución tiene un color amarillo débil. Mantener en un recipiente hermético, opaco a temperatura ambiente. Si se almacena correctamente esta solución puede durar muchos meses.
   2. Preparar una solución stock de 10 mM HEPES tamponado con 300 mM de NaCl a pH 7.4. Fijar el electrodo en una abrazadera y rellene con el NaCl tamponada usando una punta de microfil 28G conectada a una jeringa. Observar que la solución salina ha llegado al final de la punta del microelectrodo. Confirmar que el microelectrodo está libre de grandes burbujas que podrían interferir con el flujo de corriente.
   3. Romper la punta del electrodo a aproximadamente 10-20 μm de ancho, usando el lado Romo de un bisturí o una cuchilla de afeitar.
   4. Usando una micropipeta, aplique una pequeña gota (~0.1 μl) del ionóforo K⁺ cerca de la punta del microelectrodo. Si el electrodo ha sido correctamente silanizada que será absorbida en la gota en la punta rota. Llenar el electrodo 1-2 mm con el ionóforo K⁺ y quitar exceso con papel de seda.

2. calibración de microelectrodos selectivos K⁺

1. Preparación de soluciones de calibración
   1. Preparar soluciones de diferentes concentraciones de KCl en igual osmolaridad del líquido cerebroespinal artificial (ACSF) sustituyendo la NaCl con KCl. Usamos 0.1, 1, 4,5, 10 y 100 mM K⁺ ACSF, para la calibración de los electrodos. Las recetas de estas soluciones de calibración se enumeran en la tabla 1.

Producto químico	MW	final mM	0,1 mM [K +]	1 mM [K +]	4.5 mM [K +]	10 mM [K +]	100 mM [K +]
	(g / mol)
NaCl	58.44	varía	1,51 g	1.50 g	1,44 g	1,4 g	0,345 g
KCl	Stock de 1 M	varía	20 μl	200 μL	900 μl	2 ml	20 ml
CaCl2	Stock de 1 M	2	400 μL
MgCl2	Stock de 1 M	1	200 μL
NaH2PO4	119.98	1.2	0,29 g
NaHCO3	84.01	26	g 0,437
D-glucosa	180.16	10	0,360 g
Agua	c.s.p. 200 ml

Tabla 1. Soluciones de calibración de potasio

2. Calibración del microelectrodo
   1. La burbuja de todas las soluciones con 95% O₂5% CO₂ para al menos 20 minutos antes de comenzar el experimento. Comenzar inunda el baño con 4,5 mM [K⁺] ACSF a razón de 3 mL por minuto. Coloque el electrodo selectivo de K⁺ en sostenedor de electrodos conectado a lo headstage de electrodo en el manipulador. Este headstage está conectado a un amplificador adecuado. Inserte la punta del electrodo en la solución del baño.
   2. Asegúrese de que el electrodo de tierra de Ag/AgCl se baña en la misma solución y que el flujo es constante. Aplicar soluciones de calibración de manera gradual y registrar los cambios de potencial en mV a través de la punta del electrodo. Espere a que el potencial en la punta del electrodo alcanzar un valor estable antes de pasar a la siguiente solución
   3. Medir el cambio de voltaje de estado estable en respuesta a la aplicación de las soluciones de calibración a la punta del electrodo. Confirmar que la pendiente de la respuesta del electrodo es por lo menos 52 y no mayor de 58 mV por cambio de registro en [K⁺].

3. preparación de rebanadas cerebrales hipocampo agudas

1. Preparación de soluciones de corte
   1. Preparar sacarosa 500 mL corte solución compuesto de: sacarosa de 194 mM, 30 mM NaCl, KCl, 10 mM D-glucosa, 1 mM MgCl₂de 4.5 mM, 1,2 mM NaH₂PO₄y 26 mM NaHCO₃, 290-300 mOsm, saturado con 95% O₂ y 5% CO₂.
   2. Preparar 1-2 litros de solución de grabación (ACSF) compuesto por: 124 mM NaCl 4,5 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 10 mM D-glucose, 2 mM CaCl₂, 1,2 mM NaH₂PO₄y 26 mM NaHCO₃; pH 7.3-7.4 (después de burbujeo), 290-300 mOsm, saturado con 95% O₂ y 5% CO₂. Llenar un vaso de precipitados que contiene una cámara de soporte de rebanada de cerebro con solución de grabación y mantener a 32-34 ° C. Llene la cámara vibratome con granizado de agua de hielo.
2. Preparación de rebanada aguda
   1. Anestesiar profundamente un ratón colocándolo en una campana de cristal precargado con isoflurano 2-3 mL. Compruebe para reflejo de pellizco del dedo del pie y si no responde, rápidamente decapitar con un par de tijeras afiladas o guillotina como su protocolo animal requiere.
   2. Haga una incisión de 2-3 cm con tijeras de la porción caudal del cráneo para cortar el cuero cabelludo a lo largo de la línea media. Mientras retrae manualmente el cuero cabelludo, hacer las incisiones horizontales dos de 1 cm de la botella doble de agujero a lo largo de los lados del cráneo. Entonces, con tijeras finas, corte una incisión la longitud del cráneo, a lo largo de la línea media de la parte posterior del cráneo a la nariz.
   3. Con unas pinzas finas insertadas cerca de la línea media, retraiga el cráneo Incisa en dos porciones. Extraer el cerebro del ratón del cráneo y utilice una cuchilla para eliminar el cerebelo y los bulbos olfativos, que se encuentran respectivamente en las porciones caudales y rostrales del cerebro. Estas pueden identificarse por las grandes fisuras, que los separan de la corteza.
   4. Monte el bloque de cerebro en la bandeja de vibratome con pegamento. Llene la bandeja de vibratome con solución de corte de helado.
   5. Cortar secciones de tejido en el plano coronal en 300 μm de grosor. Generalmente se pueden recoger 6 rebanadas hippocampal coronales.
   6. Después de cada sección, es inmediatamente transferir las rebanadas a la rebanada con vaso de calentado a 32-34° C. Mantener las secciones en esta temperatura durante 20 minutos antes de retirar el vaso que contiene las secciones y colóquelo a temperatura ambiente durante al menos 20-30 minutos antes de la grabación.

4. medición de la dinámica de K eléctricamente evocados⁺

1. Configuración de la preparación de la rebanada
   1. Coloque con cuidado el trozo de cerebro en el baño con una pipeta Pasteur y manténgalo suavemente en su lugar con un platino arpa con cuerdas de nylon.
   2. Asegúrese de que las puntas del electrodo de estimulación bipolar son paralelas uno al otro y son de nivel con el plano de la rebanada. Lentamente, a lo largo de 6-7 segundos, introducir los electrodos en CA3 estrato radiatum aproximadamente 40-50 μm profundo para estimular collaterals de Schaffer. En las secciones coronales, CA3 pueden identificarse aproximadamente como la porción del lateral hipocampo apropiado a la capa de células del gránulo en la rodilla del hipocampo, con el estrato radiatum caer medial y ventral a la capa de células piramidales.
   3. Inserte con cuidado el K⁺-Electrodo selectivo en CA1 estrato radiatum aproximadamente 50 μm profundamente, bajando lentamente el electrodo durante aproximadamente 3-4 segundos. Permita que el potencial de estabilizar a través de los electrodos antes de aplicar estímulos para el sector: esto toma generalmente 5 a 10 minutos. Si el segmento muestra espontánea cambios en K extracelular⁺ entonces descartarán y repetición este proceso con un nuevo sector.
2. Medida evoca la liberación de K⁺
   1. Aplicar trenes de estímulo eléctrico (8 pulsos) presionando manualmente el gatillo en el estimulador durante la grabación digital de las respuestas. Aplicar la estimulación a 10 Hz y 1 ms de pulso ancho, desde amplitud de estímulo de 10 μA.
   2. Aplicar cada vez mayor amplitud de estimulación por un factor de 2 hasta que se detecta una amplitud máxima de respuesta K⁺ . Si no ves respuesta, mover la posición del electrodo K⁺ más cerca al sitio de estimulación en 100 μm en incrementos de
   3. Determinar la amplitud del estímulo que produce la respuesta máxima media. En nuestra experiencia, esto es entre 40-160 mA, dependiendo de la calidad de la preparación, edad del animal y la distancia entre electrodos de estimulación y el electrodo selectivo de K⁺ .
   4. En el mismo segmento, usando una amplitud de estímulo en un paso inferior a la amplitud que produce el medio respuesta máxima (por ejemplo, si 80 μA produce una respuesta de máximo de la mitad, usar 40 μA) aplicar trenes de estímulo de cada vez mayor número de pulsos. Inicialmente, hemos utilizado los trenes de pulsos de 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 y 128.
   5. Para confirmar que las señales K⁺ son mediadas por el disparo del potencial de acción de la bañera de collaterals de Schaffer eléctricamente estimulado, aplicar 0,5 μm TTX en ACSF durante 10 minutos y repetir el protocolo de estimulación. No las respuestas evocadas se deben observar.
   6. Después de terminar el experimento slice, confirmar el electrodo ha mantenido su respuesta por volver a calibrar el electrodo en las soluciones de calibración y garantizando la respuesta no se ha desviado en más del 10% de la calibración inicial

Resultados

Para la medida selectiva del K extracelular⁺, preparamos microelectrodos selectivos recubiertas con una capa hidrofóbica a través de silanización de pipetas de vidrio de borosilicato limpio (figura 1A). Esta capa permite el ionóforo K⁺ que contiene valinomycin para descansar en la punta del electrodo y permitir solo K⁺ de flujo a través de una abertura estrecha en la punta del electrodo (figura 1B

Discusión

El método que Describimos aquí nos ha permitido evaluar la dinámica de K⁺ en respuesta a la estimulación eléctrica de collaterals de Schaffer en rebanadas hippocampal agudas de ratones adultos. Nuestro método de preparación K⁺ de microelectrodos selectivos de ion es similar al anteriormente descrito procedimientos^12,13,14,15. Sin embargo, este método tiene ventajas...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vibratome	DSK	Microslicer Zero 1
Mouse: C57BL/6NTac inbred mice	Taconic	Stock#B6
Microscope	Olympus	BX51
Electrode puller	Sutter	P-97
Ag/AgCl ground pellet	WPI	EP2
pCLAMP10.3	Molecular Devices	n/a
Custom microfil 28G tip	World precision instruments	CMF28G
Tungsten Rod	A-M Systems	716000
Bipolar stimulating electrodes	FHC	MX21XEW(T01)
Stimulus isolator	World precision instruments	A365
Grass S88 Stimulator	Grass Instruments Company	S88
Borosilicate glass pipettes	World precision instruments	1B150-4
A to D board	Digidata 1322A	Axon Instruments
Signal Amplifier	Multiclamp 700A or 700B	Axon Instruments
Headstage	CV-7B Cat 1	Axon Instruments
Patch computer	Dell	n/a
Sodium Chloride	Sigma	S5886
Potassium Chloride	Sigma	P3911
HEPES	Sigma	H3375
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S0751
D-glucose	Sigma	G7528
Calcium Chloride	Sigma	21108
Magnesium Chloride	Sigma	M8266
valinomycin	Sigma	V0627-10mg
1,2-dimethyl-3-nitrobenzene	Sigma	40870-25ml
Potassium tetrakis (4-chlorophenyl)borate	Sigma	60591-100mg
5% dimethyldichlorosilane in heptane	Sigma	85126-5ml
TTX	Cayman Chemical Company	14964
Hydrochloric acid	Sigma	H1758-500mL
Sucrose	Sigma	S9378-5kg
Pipette Micromanipulator	Sutter	MP-285 / ROE-200 / MPC-200
Objective lens	Olympus	PlanAPO 10xW