作成、テスト、および成人の脳の切片でカリウム イオン選択的な電極を使用して

要約

カリウム イオンは細胞の静止膜電位に貢献し、細胞外の K⁺濃度細胞興奮性の重要な調節因子であります。確認、調整、モノポーラ K⁺を使用する方法について説明-選択的な電極。そのような電極を使用すると、大人の海馬スライスにおける電気的誘発 K⁺濃度動態の測定ができます。

要約

カリウム イオンは細胞の静止膜電位に貢献し、そのため、細胞外の K⁺濃度は細胞興奮性の重要な調節因子。活動電位の根底にある電位依存性イオン チャネルのクローズ、オープン、不活化状態間の平衡をシフトすることによって静止膜電位および細胞内興奮性細胞外の K⁺影響の濃度を変更発生と伝導。したがって、健康と病気にかかった状態で細胞外の K⁺のダイナミクスを直接測定する貴重なです。ここでは、確認、調整および単極 K⁺を使用する方法について述べる-選択的な電極。我々 は電気的誘発 K⁺濃度動態を測定する成体海馬スライスで展開します。そのような電極の賢い使用は神経系における細胞外の K⁺の濃度を制御する細胞および生物物理学的メカニズムを評価するために必要なツール キットの重要な部分です。

概要

カリウム イオンの濃度が脳内で堅く調整され、それらの変動はすべての細胞の静止膜電位に強力な影響を及ぼします。これらの重要な貢献の観点から、生物学の重要な目標は、¹体のさまざまな器官の細胞外スペースでしっかりと K⁺の濃度を調節するために使用する細胞および生物物理学的メカニズムを決定することです。^,2。 これらの研究で重要な要件は、K⁺濃度を正確に測定する能力。健康と病気の状態では、脳でカリウムの恒常性に貢献する多くのコンポーネントされているが、識別された^3,4、5、さらに進行中の専門にされた性質のため抑制されていますカリウム測定用イオン選択性電極の準備。電極センサーを表す K⁺濃度の in vitro組織スライスのin vivo測定のゴールド スタンダード。

監視 K⁺のための新しいアプローチがしかし、これらは生物学的関連性の高い範囲の K⁺濃度を検出しないまたはない吟味されている完全に生体が光センサーを使用して開発中の最初の結果有望な^6,7,8が表示されます。光センサーと比較して、電極、電極アレイ⁹空間分解能を向上させることが根本的にイオンの点光源測定に限定。K⁺の動態を監視するため銃身の単一電極センサーについて説明します。

この仕事で K⁺の選択的な電極、高選択的許可バリノマイシン ベース カリウム イオノフォアを使用して (10⁴倍 K⁺ Na⁺選択性) をする段階的な手順の詳細は報告する K⁺膜¹⁰を移動します。自然に発生するポリペプチド、バリノマイシンは K⁺透水性孔として機能し、それの電気化学的勾配を K⁺の流れが容易になります。電極を調整する方法についても述べる保存し、それらを使用する方法、最後に大人のマウスから急性海馬脳スライスの K⁺濃度動態を測定するための展開方法について。特定のイオン チャネル細胞外 K⁺のダイナミクスを規制する提案を持たない遺伝子改変マウスと共にそのような電極を使用する必要があります K の大気中濃度を制御する神経系によって使用される細胞メカニズムを明らかにします。⁺細胞外の環境の中で。

プロトコル

すべての動物実験は、ケアと実験動物の使用のため国立の研究所に従って健康ガイドを実施し、カリフォルニア大学ロサンゼルス校で一等書記官の動物研究委員会によって承認されました。すべてのマウスは、12 h 光暗い環境で食料や水の利用可能な自由で収容されました。すべての動物は明らかな行動変化と健康だったが以前の研究に関与していない、ライト サイクルの犠牲になった。実験のデータは、成体マウス (6-8 週間すべての実験のために古い) から収集されました。

1 K⁺の選択的な電極の作製

1. ホウケイ酸ガラスのシリル化
   1. 包装から十分なガラス管を取り外し、50 mL の円錐管に入れます。穏やかな撹拌一晩塩酸または最低 6 時間で 1 M 塩酸洗浄電極上部に円錐形の管を埋めます。
   2. 70% エタノールで毛細血管を簡単に洗浄し、6-8 時間 100-120 ° C で完全に乾燥します。さらに使用する前に最大 4 週間の無水カルシウム硫酸塩の乾燥剤を容器に洗った毛細血管を格納します。
   3. シリル化、前に電極の引き手を使用してファインチップに毛細血管を引き出します。使用する電極は、直径約 2-5 ミクロンです。皮膚からオイルがシリル化を妨げることができます常に手袋で洗った毛細血管を処理します。
   4. 電極が先端の破損を防ぐために下から上昇しているので、ガラスの容器に電極を配置します。オートクレーブ テープまたは同じような粘着テープを使用してコンテナーへ電極を修正します。
   5. 窒素置換メソッドを使用して、そのコンテナーから 5 %dichlorodimethylsilane (DDS) シリル化ソリューションの約 0.5 mL を削除 (図 2参照)。窒素ガスで風船をいっぱい、バルーンにシリンジやチューブ、針を取り付けます。長い針を介して別の注射器に DDS を描きながら、DDS コンテナーに針を挿入します。
   6. ピペットの先端に滴下シリル化ソリューションを適用し、すぐにカバーします。シリル化ソリューションと電極に予め温めておいた (170-180 ° C) 実験室のオーブンに 10-12 時間または保持 200-220 ° C で 30 分のコンテナーを配置します。
   7. 、孵化後は、オーブンを切りオーブンからプレートを削除します。非常に暑いので、インキュベーターからプレートを削除する注意してください。クールをガラスに 10-15 分間室温でベンチにプレートを配置します。
   8. (テープをカットするかみそりの刃やメスの刃を使用して) プレートから、電極を削除と乾燥剤充填密閉容器にそれらを置きます。水分の自由保たれるシラン処理電極は、シリル化、次まで 1 週間使用できます。
2. 電極をプライミング
   1. K⁺イオノフォア カクテルの貯蔵液の準備: 5 %w/v バリノマイシン、93 %v/v 1, 2-ジメチル-3-ニトロ ベンゼン、2 w/v カリウム tetrakis(4-chlorophenyl) ホウ酸¹¹。このソリューションは、かすかな黄色の色です。室温の気密、不透明な容器にしてください。正しく保存されているこのソリューションが数ヶ月を持続できます。
   2. 10 mM HEPES 緩衝 pH 7.4 で 300 mM の NaCl の原液を準備します。クランプとバックフィルに注射器に接続されている 28 G microfil の先端を使用してバッファーの NaCl で電極を固定します。食塩が電極先端の終わりに達したことを確認します。電極は電流の流れを妨げる大きな泡の無料を確認します。
   3. 電極の先端を約 10-20 μ m、メスやかみそりの刃の鈍側を使用して、幅に分割します。
   4. マイクロ ピペットを使用して、微小電極の先端の近くの K⁺イオノフォアの小さな液滴 (~0.1 μ l) を適用します。電極が正しく処理されている場合、壊れた先端に液滴が吸収されます。塗りつぶし K⁺イオノフォアと過剰な削除 1-2 mm の電極は、ティッシュ ペーパーを使用してください。

2 K⁺の選択的な電極の校正

1. 校正溶液の調製
   1. KCl 塩化ナトリウムに置き換えて等しい浸透圧人工髄液 (アプライド) KCl の様々 な濃度の溶液を準備します。電極校正用 0.1、1、10 および 100 ミリメートル K⁺アプライド、4.5 を使いました。表 1にこれらの校正ソリューションのレシピのとおりです。

化学	MW	最終的な mM	0.1 mM [K +]	1 mM [K +]	4.5 mM [K +]	10 mM [K +]	100 mM [K +]
	(g/mol)
塩化ナトリウム	58.44	異なります	1.51 g	1.50 g	1.44 g	1.4 g	0.345 g
KCl	在庫 1 M	異なります	20 μ l	200 μ l	900 μ l	2 ml	20 ml
CaCl2	在庫 1 M	2	400 μ l
MgCl2	在庫 1 M	1	200 μ l
NaH2PO4	119.98	1.2	0.29 g
NaHCO3	84.01	26	0.437 g
D-グルコース	180.16	10	0.360 g
水	品質 200 ml

表 1。カリウム校正ソリューション

2. 電極校正
   1. 実験を開始する前に、少なくとも 20 分間 95% O₂5% CO₂とすべてのソリューションをバブルします。4.5 mM [K⁺] と一緒にお風呂を灌開始 3 mL/分の速度でアプライド。マニピュレーターを電極パッチアンプ用アダプターに接続されている電極ホルダーに K⁺電極を配置します。このパッチアンプ用アダプターは、適切なアンプに接続されます。浴液に電極の先端を挿入します。
   2. 銀/塩化銀接地電極は同じソリューションに包まれて流れが安定したことを確認します。段階的校正ソリューションを適用し、電極先端部にわたって mV の電位変化を記録します。次の解決策に切り替える前に安定した値に達するまで電極先端部の電位を待つ
   3. 電極先端部に校正ソリューションのアプリケーションへの応答の定常電圧変化を測定します。電極の応答の斜面が少なくとも 52 と 58 を超えないことを確認 [K⁺] のログ変更ごとの mV。

3. 急性海馬脳スライスの準備

1. スライス溶液の調製
   1. 500 mL のショ糖を準備切削ソリューションから成る: 194 mM ショ糖、30 mM の NaCl、4.5 mM KCl、10 mM 1 mM MgCl₂D-グルコース、1.2 mM NaH₂PO₄と 26 mM NaHCO₃95% O₂と 5% CO₂飽和 290 300 mOsm。
   2. 構成されてレコーディング ソリューション (アプライド) の 1-2 リットルを準備: 124 mM の NaCl、4.5 mM KCl、1 mM MgCl₂、10 mM D-グルコース、CaCl₂2 mM、1.2 mM NaH₂PO₄と 26 mM NaHCO₃;pH 7.3 7.4 (バブル) 後、95% O₂と 5% CO₂飽和 290 300 mOsm。録音ソリューションと脳スライス ホルダー チャンバーを含むビーカーを記入し、32-34 ° c. でそれを維持Vibratome のチャンバーを氷-水の秘密を持つ。
2. 急性スライス標本
   1. 深く 2-3 mL イソフルランとプリチャージ ベルジャーにそれを置くことによってマウスを麻酔します。つま先ピンチ反射確認し、場合非対応で急速に首を切る鋭いハサミやギロチンのペアを使用して動物のプロトコルを必要とします。
   2. 正中線に沿って頭皮をカットする頭蓋骨の尾の部分からはさみを使用して 2-3 cm の切開を行います。頭皮を手動で取り消す中、2 1 cm 水平切開辺後頭孔から頭蓋を作る。その後、切開鼻に頭蓋の後部から正中線に沿って、頭蓋骨の長さをカット良い鋏を使用しています。
   3. 正中線近くに挿入された微細鉗子を使用して、2 つの部分で切開頭蓋骨リトラクトします。頭蓋骨からマウスの脳を抽出し、小脳や脳の尾側と吻側部分にそれぞれ位置する嗅球を削除するブレードを使用します。これらは、皮質からそれらを分ける大きな亀裂によって識別することができます。
   4. スーパー接着剤を使用して vibratome トレーに頭脳のブロックをマウントします。氷冷切削ソリューションで vibratome トレイを埋めます。
   5. 300 μ m の厚みでコロナの平面の組織切片をカットします。通常 6 コロナ海馬スライスを収集できます。
   6. 各セクションをカットすると後は、すぐにビーカー 32 から 34 ° C に加温を保持しているスライスにスライスを転送します。セクションを含むビーカーを削除する前に 20 分間この温度でセクションを維持し、記録する前に、少なくとも 20 〜 30 分の室温でこれを置きます。

4. 電気的誘発 K⁺のダイナミクス計測

1. スライス標本を設定
   1. 浴をパスツール ピペットを用いた脳スライスをそっと置き、ナイロン弦とプラチナ ハープの場所に押し当ててください。
   2. 双極刺激電極の先端が互いに平行で、スライスの面でレベルを確認します。ゆっくりと、6-7 秒のコースで、電極に挿入 CA3 地層結腸寄生虫約 40-50 μ m シャファー側枝を刺激する深い。コロナ セクションの CA3 約で識別できる適切な外側の海馬海馬の膝で顆粒細胞の層の部分の地層結腸寄生虫内側腹側錐体細胞層に落下します。
   3. K⁺を慎重に挿入-CA1 地層結腸寄生虫約 50 μ m ゆっくり約 3-4 秒間に電極を下げることによって、深部に電極。刺激をスライスに適用する前に電極間で安定する可能性を許可する: これは通常 5 ~ 10 分かかります。スライスを表わす自発場合細胞外 K⁺の変化は、破棄し、新しいスライスと、このプロセスを繰り返します。
2. メジャー誘発 K⁺リリース
   1. 手動で応答をデジタル記録中刺激でトリガーを押すことによって電気刺激 (8 パルス) の列車を適用します。10 Hz と 10 μ A 刺激振幅から始まる 1 ms のパルス幅で刺激を適用します。
   2. 最大 K⁺応答振幅が検出されるまで、2 の要因によって増加の刺激振幅を適用します。任意の応答がない場合は、100 μ m 単位で刺激サイトに近い K⁺電極の位置を移動します。
   3. 半分の最大応答を生成する刺激の振幅を決定します。我々 の経験で、これは準備の質、動物と刺激電極と K⁺電極間距離の年齢に応じて 40 160 μ A の間です。
   4. 同じスライスの半分の最大応答を生成する振幅より一段低いで刺激の振幅を使用して (例えば 80 μ A は、半最大応答を生成する場合は、40 μ A を使用して) のパルス数を増加させる刺激列車を適用。当初は、1、2、4、8、16、32、64、128 パルスの列車を使用しています。
   5. K⁺の信号は電気的刺激シャファー担保風呂の活動電位発火によって仲介されることを確認するには、10 分間 0.5 μ M アプライドの TTX を適用し、刺激プロトコルを繰り返します。換起された応答を観察しない必要があります。
   6. スライス実験を終えて確認電極は、再校正ソリューションで電極のキャリブレーションによってその感度を維持しているし、初期の校正から 10% 以上も逸脱していないが応答を確保します。

結果

細胞外 K⁺の選択的測定のきれいなホウケイ酸ガラス ピペット (図 1 a) のシリル化による疎水性の層で被覆されたイオン選択性電極を作製しました。このコーティングにより、バリノマイシン電極の先端に置き、電極先端 (図 1 b) の狭い開口部を通って K⁺フラックスのみを許可するを含む K⁺イオノフ?...

ディスカッション

ここで説明するメソッドを使用して、K⁺大人のマウスから急性海馬スライスでシャファー側枝の電気刺激に対する応答のダイナミクスを評価するためができました。K⁺イオン選択的な電極を準備するための手法は、以前記載されている手順^12,13,14,15に似ています。ただし、このメソ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vibratome	DSK	Microslicer Zero 1
Mouse: C57BL/6NTac inbred mice	Taconic	Stock#B6
Microscope	Olympus	BX51
Electrode puller	Sutter	P-97
Ag/AgCl ground pellet	WPI	EP2
pCLAMP10.3	Molecular Devices	n/a
Custom microfil 28G tip	World precision instruments	CMF28G
Tungsten Rod	A-M Systems	716000
Bipolar stimulating electrodes	FHC	MX21XEW(T01)
Stimulus isolator	World precision instruments	A365
Grass S88 Stimulator	Grass Instruments Company	S88
Borosilicate glass pipettes	World precision instruments	1B150-4
A to D board	Digidata 1322A	Axon Instruments
Signal Amplifier	Multiclamp 700A or 700B	Axon Instruments
Headstage	CV-7B Cat 1	Axon Instruments
Patch computer	Dell	n/a
Sodium Chloride	Sigma	S5886
Potassium Chloride	Sigma	P3911
HEPES	Sigma	H3375
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S0751
D-glucose	Sigma	G7528
Calcium Chloride	Sigma	21108
Magnesium Chloride	Sigma	M8266
valinomycin	Sigma	V0627-10mg
1,2-dimethyl-3-nitrobenzene	Sigma	40870-25ml
Potassium tetrakis (4-chlorophenyl)borate	Sigma	60591-100mg
5% dimethyldichlorosilane in heptane	Sigma	85126-5ml
TTX	Cayman Chemical Company	14964
Hydrochloric acid	Sigma	H1758-500mL
Sucrose	Sigma	S9378-5kg
Pipette Micromanipulator	Sutter	MP-285 / ROE-200 / MPC-200
Objective lens	Olympus	PlanAPO 10xW