Facendo, test e l'utilizzo di microelettrodi selettivo di ioni potassio in fettine di tessuto del cervello adulto

Riepilogo

Gli ioni del potassio contribuiscono per il potenziale di membrana di riposo delle cellule e concentrazione extracellulare di K⁺ è un regolatore fondamentale dell'eccitabilità cellulare. Descriviamo come fare, calibrare e utilizzare monopolare K⁺-selettivi microelettrodi. Utilizzando tali elettrodi consente la misurazione delle dinamiche di concentrazione K⁺ elettricamente evocate nelle fette hippocampal adulti.

Abstract

Gli ioni potassio contribuiscono in modo significativo per il potenziale di membrana di riposo delle cellule e, di conseguenza, la concentrazione extracellulare di K⁺ è un regolatore cruciale dell'eccitabilità delle cellule. Alterato le concentrazioni extracellulari di K⁺ effetto l'eccitabilità cellulare e potenziali di membrana riposo spostando gli equilibri tra stati chiusi, aperti e inattivati per canali ionici voltaggio-dipendenti che sono alla base di potenziale di azione Iniziazione e conduzione. Quindi, è prezioso per misurare direttamente extracellulare K⁺ dinamiche in salute e stati malati. Qui, descriviamo come fare, calibrare e utilizzare monopolare K⁺-selettivi microelettrodi. Li abbiamo distribuito in fette di cervello hippocampal adulto per misurare elettricamente evocate K⁺ concentrazione dinamica. L'uso giudizioso di tali elettrodi è una parte importante di tool-kit necessari per valutare i meccanismi biofisici e cellulari che controllano le concentrazioni extracellulari di K⁺ nel sistema nervoso.

Introduzione

Concentrazioni di ioni di potassio sono strettamente regolati nel cervello, e le loro fluttuazioni esercitano una potente influenza sul potenziale di membrana di riposo di tutte le cellule. Alla luce di questi contributi critici, un obiettivo importante di biologia è determinare i meccanismi biofisici e cellulari che vengono utilizzati per regolare strettamente la concentrazione di K⁺ nello spazio extracellulare in vari organi del corpo^{1 , 2}. un requisito importante in questi studi è la capacità di misurare le concentrazioni di K⁺ con precisione. Anche se molti componenti che contribuiscono all'omeostasi del potassio nel cervello negli stati sani e malati sono stati identificati^3,4,5, ulteriori progressi sono stato rallentato a causa della natura specialistica preparazione di microelettrodi selettiva dello ione per la misura di potassio. Microelettrodo sensori rappresentano il gold standard per la misurazione di K⁺ le concentrazioni in vitro, in fettine di tessuto e in vivo.

Approcci più recenti per K⁺ monitoraggio sono in fase di sviluppo mediante sensori ottici, tuttavia questi non rilevano un concentrazioni biologicamente rilevanti gamma di K⁺ o non siano stati completamente controllati nei sistemi biologici, anche se i risultati iniziali appaiono promettenti^6,7,8. Rispetto ai sensori ottici, microelettrodi sono fondamentalmente limitati ad un punto sorgente di ioni, anche se l'array di elettrodi potrebbe migliorare la risoluzione spaziale di⁹. Questo articolo si concentra sui sensori del microelettrodo singolo-canna per monitoraggio K⁺ dynamics.

In questo lavoro, segnaliamo procedure dettagliate graduale di rendere K⁺ microelettrodi selettivi, utilizzando un ionoforo potassio valinomicina-basato che permette altamente selettivo (10⁴ piega alla selettività Na⁺ K⁺ ) K⁺ movimento su membrane¹⁰. Un polipeptide natura, valinomicina agisce come un poro permeabile K⁺ e facilita il flusso di K⁺ giù di gradiente elettrochimico. Inoltre descriviamo come calibrare gli elettrodi, come memorizzare e utilizzarli e, infine, come distribuirle per misurare K⁺ concentrazione dinamica in fettine di cervello hippocampal acuta da topi adulti. L'uso di tali elettrodi insieme ai topi geneticamente modificati che non dispongono di canali ionici specifico proposti per regolare extracellulare K⁺ dinamica dovrebbe rivelare i meccanismi cellulari utilizzati dal sistema nervoso per controllare la concentrazione ambientale di K ⁺ nell'ambiente extracellulare.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con l'Istituto nazionale di guida alla salute per la cura e l'uso di animali da laboratorio e sono stati approvati dal comitato di ricerca degli animali del cancelliere presso la University of California, Los Angeles. Tutti i topi sono stati alloggiati con cibo e acqua disponibile ad libitum in un ambiente di luce-buio di 12 h. Tutti gli animali erano sani senza evidenti modifiche comportamentali, non sono stati coinvolti in studi precedenti e sono stati sacrificati durante il ciclo di luce. Dati per gli esperimenti sono stati raccolti da topi adulti (6-8 settimane di vita per tutti gli esperimenti).

1. preparazione di microelettrodi selettivi K⁺

1. Silanizzazione in vetro borosilicato
   1. Rimuovere sufficiente tubi capillari in vetro da imballaggio e collocare in una provetta conica da 50 mL. Riempire la provetta conica verso l'alto con gli elettrodi di 1 M HCl. lavaggio con agitazione delicata in HCl durante la notte o per un minimo di 6 ore.
   2. Risciacquare brevemente capillari con etanolo al 70% e poi asciugare completamente a 100-120 ° C per 6-8 ore. Conservare i capillari lavati in contenitori con essiccante solfato di calcio anidro per fino a 4 settimane prima dell'ulteriore uso.
   3. Prima di silanizzazione, tirare capillari a punta sottile con l'estrattore microelettrodo. I microelettrodi che usiamo sono circa il 2-5 micron di diametro. Maneggiare sempre lavati capillari con i guanti, come oli da pelle possono interferire con la silanizzazione.
   4. Luogo microelettrodi in un contenitore di vetro in modo che gli elettrodi sono elevati dal basso per prevenire la rottura della punta. Difficoltà microelettrodi al contenitore mediante nastro autoclavabili o nastro adesivo simile.
   5. Rimuovere circa 0,5 mL di soluzione di silanizzazione 5% dichlorodimethylsilane (DDS) dal relativo contenitore utilizzando il metodo di sostituzione di azoto (Vedi Figura 2). Riempire un palloncino con gas azoto e fissare tubo o una siringa e un ago il palloncino. Inserire l'ago nel contenitore DDS durante l'elaborazione di DDS in una siringa separata tramite un ago più lungo.
   6. Applicare la soluzione di silanizzazione goccia a goccia per le punte delle pipette e coprire immediatamente. Posizionare il contenitore che tiene i microelettrodi con soluzione di silanizzazione in un forno pre-riscaldato del laboratorio (170-180 ° C) per 10-12 ore o a 200-220 ° C per 30 minuti
   7. Dopo l'incubazione, spegnere il forno e quindi rimuovere la piastra da forno. Prestare attenzione quando si rimuove la piastra dall'incubatrice, quanto è estremamente caldo. Posizionare la piastra su una panchina a temperatura ambiente per 10-15 minuti consentire la vetreria raffreddare.
   8. Rimuovere i microelettrodi dalla piastra (usando una lama di rasoio o bisturi per tagliare il nastro) e inserirli in un contenitore ermetico riempito disseccante. Silanizzata microelettrodi prive di umidità possono essere utilizzati per fino a 1 settimana che segue la silanizzazione.
2. Gli elettrodi di adescamento
   1. Preparare una soluzione stock di K⁺ ionoforo cocktail: valinomicina w/v 5%, 93% v/v 1,2-dimetil-3-nitrobenzene, potassio 2% w/v tetrakis(4-chlorophenyl) borato¹¹. Questa soluzione è un debole colore giallo. Tenere in un contenitore ermetico, opaco a temperatura ambiente. Questa soluzione può durare molti mesi se correttamente conservato.
   2. Preparare una soluzione stock di 10 mM HEPES tamponata 300 mM NaCl a pH 7,4. Fissare l'elettrodo in un morsetto e recupero con il NaCl tamponato utilizzando una punta di microfil 28G collegata ad una siringa. Osservare che la soluzione salina ha raggiunto l'estremità della punta del microelettrodo. Confermare che il microelettrodo è privo di grandi bolle che potrebbero interferire con il flusso di corrente.
   3. Rompere la punta dell'elettrodo a circa 10-20 µm di larghezza, utilizzando il lato smussato di un bisturi o lametta.
   4. Utilizzando una micropipetta, applicare una piccola goccia (~0.1 µ l) dello ionoforo K⁺ vicino alla punta del microelettrodo. Se l'elettrodo è stato correttamente silanizzata che la goccia sarà assorbita nel punta rotta. Riempimento dell'elettrodo a 1-2 mm con l'ionoforo K⁺ e rimuovere l'eccesso con carta velina.

2. taratura del microelettrodo selettiva K⁺

1. Preparazione delle soluzioni di taratura
   1. Preparare soluzioni di varie concentrazioni di KCl in uguale osmolarità del liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) sostituendo NaCl con KCl. Abbiamo usato 0.1, 1, 4.5, 10 e 100 mM K⁺ ACSF, per la calibrazione degli elettrodi. Le ricette per queste soluzioni di calibrazione sono elencate nella tabella 1.

Prodotto chimico	MW	finale mM	0,1 mM [K +]	1 mM [K +]	4,5 mM [K +]	10 mM [K +]	100 mM [K +]
	(g / mol)
NaCl	58,44	varia	1,51 g	1,50 g	1,44 g	1,4 g	0,345 g
KCl	Stock di 1 M	varia	20 µ l	200 µ l	900 µ l	2 ml	20 ml
CaCl2	Stock di 1 M	2	400 µ l
MgCl2	Stock di 1 M	1	200 µ l
NaH2PO4	119.98	1.2	0,29 g
NaHCO3	84.01	26	0,437 g
D-glucosio	180,16	10	0,360 g
Acqua	q.s. 200 ml

Tabella 1. Soluzioni di calibrazione di potassio

2. Calibrazione del microelettrodo
   1. Bubble tutte le soluzioni con 95% O₂5% CO₂ per almeno 20 minuti prima di iniziare l'esperimento. Iniziare che irrora il bagno con 4,5 mM [K⁺] ACSF ad un tasso di 3 mL al minuto. Inserire l'elettrodo selettivo K⁺ portaelettrodo attaccato all'headstage elettrodo sul manipolatore. Questo headstage è collegato ad un amplificatore appropriato. Inserire la punta dell'elettrodo nel bagno perfusato.
   2. Garantire l'elettrodo di terra di Ag/AgCl è bagnata nella stessa soluzione e che il flusso è costante. Applicare soluzioni di calibrazione in un modo graduale e registrare i cambiamenti di potenziali in mV attraverso la punta dell'elettrodo. Attendere che il potenziale presso la punta dell'elettrodo per raggiungere un valore stabile prima di passare alla soluzione successiva
   3. Misurare la variazione di tensione allo stato stazionario in risposta all'applicazione delle soluzioni di taratura per la punta dell'elettrodo. Confermare che la pendenza della risposta dell'elettrodo è almeno 52 e non superiore a 58 mV a cambio di registro in [K⁺].

3. preparazione di fettine di cervello Hippocampal acuta

1. Preparazione delle soluzioni di fetta
   1. Preparare il saccarosio 500ml taglio soluzione composta da: saccarosio 194 mM, 30 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 10 mM D-glucosio, 1 mM MgCl₂, 1,2 mM NaH₂PO₄e 26 mM NaHCO₃, 290-300 mOsm, saturo di 95% O₂ e 5% CO₂.
   2. Preparare 1-2 litri di soluzione di registrazione (ACSF) composti da: 124 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 10 mM D-glucosio, 2mm CaCl₂, 1,2 mM NaH₂PO₄e 26 mM NaHCO₃; pH 7.3-7.4 (dopo il bubbling), 290-300 mOsm, saturo di 95% O₂ e 5% CO₂. Riempire un becher contenente una camera di titolare fetta di cervello con soluzione di registrazione e la tiene a 32-34 ° C. Riempire la camera vibratome con granita di acqua e ghiaccio.
2. Preparazione di fetta acuta
   1. Profondamente anestetizzare un mouse collocandolo in una campana di vetro pre-caricato con 2-3 mL isoflurano. Verifica per reflex di punta pizzico e se non rispondono, rapidamente decapitare utilizzando un paio di forbici taglienti o ghigliottina come richiede il protocollo animale.
   2. Fare un'incisione di 2-3 cm usando le cesoie dalla porzione caudale del cranio per tagliare il cuoio capelluto lungo la linea mediana. Durante il riavvolgimento manualmente il cuoio capelluto, fare due incisioni orizzontali 1cm dal magnum di orifizio lungo i lati del cranio. Poi, usando le cesoie bene, tagliare un'incisione la lunghezza del cranio, lungo la linea mediana dalla parte posteriore del cranio al naso.
   3. Utilizzando una pinzetta inserita vicino al midline, ritrarre il cranio inciso in due porzioni. Estrarre il cervello di topo dal cranio e utilizzare una lama per rimuovere il cervelletto e bulbi olfattivi, che si trovano rispettivamente le porzioni rostrale e caudale del cervello. Questi possono essere identificati da grandi fenditure, che li separano dalla corteccia.
   4. Montare il blocco di cervello sul vassoio vibratome utilizzando colla super. Riempire il vassoio del vibratome con soluzione di taglio di ghiaccio freddo.
   5. Tagliare le sezioni di tessuto sul piano corona a 300 µm spessore. Di solito possono essere raccolti 6 fette hippocampal coronale.
   6. Dopo ogni sezione viene tagliato, trasferire immediatamente le fette per la fetta che tiene Becher riscaldato a 32-34° C. Mantenere le sezioni a questa temperatura per 20 minuti prima di rimuovere il becher contenente le sezioni e questo posto a temperatura ambiente per almeno 20-30 minuti prima della registrazione.

4. misurazione delle dinamiche elettricamente evocate K⁺

1. Impostazione per la preparazione di fetta
   1. Posizionare delicatamente la fetta di cervello nella vasca utilizzando una pipetta di Pasteur e tenerlo delicatamente in posizione con un platino arpa con corde in nylon.
   2. Garantire le punte dell'elettrodo stimolante bipolare sono parallele tra loro e sono livello con il piano della sezione. Lentamente, nel corso di 6-7 secondi, inserire gli elettrodi in CA3 strato radiato circa 40-50 µm profondità per stimolare collaterali di Schaffer. In sezioni coronali, CA3 può essere identificato circa come la porzione di laterali ippocampo adeguato per lo strato delle cellule del granello al genu hippocampal, con la strato radiato cadendo mediale e ventrale per lo strato delle cellule piramidali.
   3. Inserire con cautela il K⁺-elettrodo selettivo in CA1 strato radiato circa 50 µm profonda, abbassando lentamente l'elettrodo sopra circa 3-4 secondi. Consentire il potenziale stabilizzare attraverso l'elettrodo prima di applicare stimoli la fetta: questo di solito richiede 5-10 minuti. Se la fetta esibisce spontanea modifiche in extracellulare K⁺ scartare e ripetere questo processo con una fetta di nuovo.
2. Misurare il rilascio evocato K⁺
   1. Applicare i treni di stimolazione elettrica (8 impulsi) premendo manualmente il trigger sullo stimolatore durante la registrazione digitale di risposte. Applicare la stimolazione a 10 Hz e 1 larghezza di impulso di ms, a partire da ampiezza di stimolo 10 µA.
   2. Applicare le ampiezze di stimolazione crescente di un fattore di 2 fino a quando viene rilevata un'ampiezza massima di risposta K⁺ . Se non vedete alcuna risposta, è possibile spostare la posizione dell'elettrodo K⁺ più vicino al sito di stimolazione in 100 µm in passi da
   3. Determinare l'ampiezza di stimolo che produce la risposta massima mezza. Nella nostra esperienza, questo è tra 40-160 µA, dipendendo la qualità di preparazione, l'età dell'animale e la distanza tra gli elettrodi di stimolazione ed elettrodo selettivo K⁺ .
   4. Nella stessa sezione, utilizzando un'ampiezza di stimolo ad un passo inferiore l'ampiezza che produce la risposta massima mezza (ad es. se 80 µA produce una risposta mezzo massima, utilizzare 40 µA) applicare i treni di stimolo di aumento del numero di impulsi. Inizialmente, abbiamo usato i treni di impulsi di 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 e 128.
   5. Per confermare che K⁺ segnali sono mediati da infornamento del potenziale d'azione del bagno collaterals Schaffer stimolato elettricamente, applicare 0,5 µM TTX in ACSF per 10 minuti e ripetere il protocollo di stimolazione. Nessun risposte evocate dovrebbero essere osservate.
   6. Dopo aver terminato l'esperimento di fetta, confermare l'elettrodo ha mantenuto la sua responsività ri-calibrare l'elettrodo nelle soluzioni di calibrazione e garantire la risposta non si è discostato di oltre il 10% dalla taratura iniziale

Risultati

Per la determinazione selettiva di extracellulare K⁺, abbiamo preparato microelettrodi iono-selettivi, rivestiti con uno strato idrofobico attraverso silanizzazione delle pipette di vetro borosilicato pulito (Figura 1A). Questo rivestimento permette lo ionoforo K⁺ contenente valinomicina per riposare sulla punta dell'elettrodo e consentire solo K⁺ di flusso attraverso una stretta apertura presso la punta dell'elettrodo (

Discussione

Il metodo che descriviamo qui ci ha permesso di valutare K⁺ dinamiche in risposta alla stimolazione elettrica dei collaterals Schaffer in fettine ippocampali acute da topi adulti. Il nostro metodo di preparazione K⁺ microelettrodi selettiva dello ione è simile a precedenti procedure descritte^12,13,14,15. Tuttavia, questo metodo presenta vantaggi rispetto alle configurazio...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vibratome	DSK	Microslicer Zero 1
Mouse: C57BL/6NTac inbred mice	Taconic	Stock#B6
Microscope	Olympus	BX51
Electrode puller	Sutter	P-97
Ag/AgCl ground pellet	WPI	EP2
pCLAMP10.3	Molecular Devices	n/a
Custom microfil 28G tip	World precision instruments	CMF28G
Tungsten Rod	A-M Systems	716000
Bipolar stimulating electrodes	FHC	MX21XEW(T01)
Stimulus isolator	World precision instruments	A365
Grass S88 Stimulator	Grass Instruments Company	S88
Borosilicate glass pipettes	World precision instruments	1B150-4
A to D board	Digidata 1322A	Axon Instruments
Signal Amplifier	Multiclamp 700A or 700B	Axon Instruments
Headstage	CV-7B Cat 1	Axon Instruments
Patch computer	Dell	n/a
Sodium Chloride	Sigma	S5886
Potassium Chloride	Sigma	P3911
HEPES	Sigma	H3375
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S0751
D-glucose	Sigma	G7528
Calcium Chloride	Sigma	21108
Magnesium Chloride	Sigma	M8266
valinomycin	Sigma	V0627-10mg
1,2-dimethyl-3-nitrobenzene	Sigma	40870-25ml
Potassium tetrakis (4-chlorophenyl)borate	Sigma	60591-100mg
5% dimethyldichlorosilane in heptane	Sigma	85126-5ml
TTX	Cayman Chemical Company	14964
Hydrochloric acid	Sigma	H1758-500mL
Sucrose	Sigma	S9378-5kg
Pipette Micromanipulator	Sutter	MP-285 / ROE-200 / MPC-200
Objective lens	Olympus	PlanAPO 10xW