Fazendo, testando e usando potássio íon seletivo microeletrodos em fatias de tecido do cérebro de um adulto

Resumo

Íons de potássio contribuem para o descanso potencial de membrana das células e a concentração extracelular de K⁺ é um regulador crucial da excitabilidade celular. Descrevemos como fazer, calibrar e usar monopolar K⁺-seletivos microeletrodos. Usar tais eletrodos permite a medição da dinâmica de concentração de K⁺ eletricamente evocada em fatias hippocampal adultas.

Resumo

Íons de potássio contribuem significativamente para o descanso potencial de membrana das células e, portanto, a concentração extracelular de K⁺ é um regulador crucial da excitabilidade da célula. Alterou a concentrações extracelulares K⁺ vai afectar a excitabilidade de celular e potenciais de membrana de descanso deslocando o equilíbrio entre Estados fechados, abertos e inativados para canais dependentes de voltagem íon que fundamentam o potencial de ação iniciação e condução. Portanto, é valioso para medir diretamente o extracelular K⁺ dinâmica na saúde e Estados doentes. Aqui, descrevemos como fazer, calibrar e usar monopolar K⁺-seletivos microeletrodos. Nós lhes implantado em fatias hippocampal cérebro de um adulto para medir evocada eletricamente dinâmica de concentração de K⁺ . O uso criterioso de tais eletrodos é uma parte importante do kit de ferramentas necessária para avaliar os mecanismos celulares e biofísicos que controlam a concentração extracelular de K⁺ no sistema nervoso.

Introdução

Concentrações de íons potássio estão fortemente regulamentadas no cérebro, e suas flutuações exercem uma poderosa influência sobre o potencial de membrana descanso de todas as células. À luz destas contribuições críticas, um objectivo importante da biologia é determinar os mecanismos celulares e biofísicos que são usados para regular firmemente a concentração de K⁺ no espaço extracelular em diferentes órgãos do corpo^{1 , 2}. a capacidade de medir concentrações de K⁺ com precisão, constitui um requisito importante nestes estudos. Apesar de muitos componentes que contribuem para a homeostase do potássio no cérebro em Estados saudáveis e doentes foram identificados^3,4,5, ainda mais progresso tem sido abrandado devido à natureza especializada do preparando íon seletivo microeletrodos para medição de potássio. Sensores de microeletrodos representam o padrão de ouro para medir K⁺ concentrações em vitro, em fatias de tecido e em vivo.

Novos enfoques para K⁺ de monitoramento estão em desenvolvimento utilizando sensores ópticos, porém estes não detectar uma gama biologicamente relevantes de K⁺ concentrações ou já não foram totalmente analisados em sistemas biológicos, embora os resultados iniciais Parece promissor,^6,7,8. Comparado com sensores ópticos, microeletrodos são fundamentalmente limitados a uma medição de ponto fonte de íons, embora matrizes eletrodo poderiam melhorar a resolução espacial⁹. Este artigo enfoca os sensores de cano único microeletrodos para monitoração dinâmica K⁺ .

Neste trabalho, relatamos os procedimentos detalhados em etapas para fazer K⁺ seletivos microeletrodos, usando um ionóforo de potássio valinomicina-baseado que permite altamente seletivo (dobra⁴ 10 K⁺ a seletividade Na⁺ ) K⁺ movimentação de membranas¹⁰. Um polipeptídeo natural, valinomicina atua como um poro permeável K⁺ e facilita o fluxo de K⁺ para baixo é um gradiente electroquímico. Também descreveremos como calibrar os eletrodos, como armazenar e usá-los e, finalmente, como implantá-las para medir a dinâmica de concentração K⁺ em fatias aguda hippocampal cérebro de ratos adultos. O uso de tais eletrodos juntamente com ratos geneticamente modificados que não possuem canais de íon específico propostos para regular extracelular K⁺ dinâmica deve revelar os mecanismos celulares usados pelo sistema nervoso para controlar a concentração ambiente de K ⁺ no meio extracelular.

Protocolo

Todos os animais de experimentos foram conduzidos em conformidade com o Instituto Nacional de saúde-guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório e foram aprovados pelo Comitê de pesquisa Animal do Chanceler a Universidade da Califórnia, Los Angeles. Todos os ratos foram alojados com comida e água disponível ad libitum em um ambiente de claro-escuro de 12 h. Todos os animais eram saudáveis sem alterações comportamentais óbvias, não estavam envolvidos em estudos anteriores e foram sacrificados durante o ciclo de luz. Dados de experimentos foram coletados de ratos adultos (6-8 semanas de idade para todos os experimentos).

1. preparação de microeletrodos seletivas K⁺

1. Silanização de vidro de borosilicato
   1. Remova o suficiente capilares de vidro da embalagem e coloque em um tubo cónico de 50 mL. Encha o tubo cônico para cima com eletrodos de 1m HCl. lavagem com agitação suave em HCl durante a noite ou durante um período mínimo de 6 horas.
   2. Brevemente, enxágue capilares com etanol a 70% e depois seque completamente a 100-120 ° C por 6 a 8 horas. Loja capilares lavados em recipientes com dessecante de sulfato de cálcio anidro por até 4 semanas antes de nova utilização.
   3. Antes da silanização, puxe os capilares para uma ponta fina usando um extrator de microeletrodos. Os microeletrodos que usamos são cerca de 2 a 5 mícrons de diâmetro. Sempre lidar com capilares lavados com luvas, como óleos de pele podem interferir com a silanização.
   4. Colocar microeletrodos para um recipiente de vidro para que os eletrodos são elevados da parte inferior para evitar a ruptura de ponta. Corrigi os microeletrodos ao contêiner usando fita de autoclave ou similar de fita adesiva.
   5. Remova aproximadamente 0,5 mL de solução de silanização 5% diclorodimetilsilano (DDS) do seu contêiner usando o método de substituição de nitrogênio (ver Figura 2). Encha um balão com gás de nitrogênio e anexar uma seringa ou tubo e agulha para o balão. Inserir a agulha em recipiente DDS enquanto elaboração de DDS para uma seringa separada através de uma agulha mais longa.
   6. Aplicar a solução de silanização gota a gota as dicas das pipetas e cubra imediatamente. Coloque o recipiente segurando os microeletrodos com solução de silanização em um forno de laboratório (170-180 ° C) pré-aquecido por 10-12 horas ou a 200-220 ° C por 30 minutos
   7. Após a incubação, desligar o forno e, em seguida, retire a placa do forno. Tenha cuidado ao retirar a placa da incubadora, como é extremamente quente. Coloque a placa em um banco na temperatura ambiente por 10-15 minutos para permitir que o vidro esfriar.
   8. Remova a placa (usando uma lâmina de navalha ou lâmina de bisturi para cortar a fita) os microeletrodos e colocá-los em um recipiente hermético preenchido dessecante. Microeletrodos silanizada mantidos livres de umidade podem ser usados por até 1 semana após silanização.
2. Aprontar os eléctrodos
   1. Prepare uma solução stock de K⁺ ionóforo cocktail: valinomicina de 5% p/v, 93% v/v 1,2-dimetil-3-nitrobenzeno, potássio 2% w/v tetrakis(4-chlorophenyl) borato¹¹. Esta solução é uma cor amarela fraca. Mantenha-se em um recipiente hermético, opaco em temperatura ambiente. Se armazenado corretamente esta solução pode durar muitos meses.
   2. Prepare uma solução stock de 10 mM HEPES buffer 300 mM NaCl em pH 7,4. Fixe o eletrodo em uma braçadeira e aterre com o NaCl no buffer usando uma ponta de micropartículas de 28G conectada a uma seringa. Observe que a solução salina atingiu o fim da ponta de microeletrodos. Confirme que o microeléctrodo é livre de grandes bolhas que podem interferir com o fluxo da corrente.
   3. Quebre a ponta do eletrodo de aproximadamente 10-20 µm de largura, utilizando o lado sem corte de um bisturi ou lâmina de barbear.
   4. Utilizando uma micropipeta, aplica uma gota pequena (~0.1 µ l) do ionóforo K⁺ perto da ponta dos microeletrodos. Se o eletrodo foi devidamente silanizada a gota será absorvida na ponta quebrada. Preenchimento do eletrodo para 1-2 mm com o ionóforo K⁺ e remove o excesso usando lenços de papel.

2. calibração de microeletrodos seletivas K⁺

1. Preparação das soluções de calibração
   1. Prepare soluções de diferentes concentrações de KCl em osmolaridade igual artificial líquido cefalorraquidiano (ACSF) substituindo NaCl por KCl. Usamos a 0.1, 1, 4.5, 10 e 100 mM K⁺ ACSF, para calibração de eletrodos. As receitas para essas soluções de calibração são listadas na tabela 1.

Produto químico	MW	final mM	0,1 mM [K +]	1 mM [K +]	4.5 mM [K +]	10 mM [K +]	100 mM [K +]
	(g / mol)
NaCl	58.44	varia	1,51 g	1,50 g	1,44 g	1,4 g	0,345 g
KCl	Estoque de 1 M	varia	20 µ l	200 µ l	900 µ l	2 ml	20 ml
CaCl2	Estoque de 1 M	2	400 µ l
MgCl2	Estoque de 1 M	1	200 µ l
NaH2PO4	119.98	1.2	0,29 g
NaHCO3	84.01	26	g 0,437
D-glicose	180.16	10	0,360 g
Água	QS 200ml

Tabela 1. Soluções de calibração de potássio

2. Calibração de microeletrodos
   1. Bolha todas as soluções com 95% O₂5% CO₂ pelo menos 20 minutos antes de começar o experimento. Começar a perfusing o banho com 4,5 mM [K⁺] ACSF a uma taxa de 3 mL por minuto. Coloque o elétrodo seletivo do K⁺ no eléctrodo anexado para o eletrodo headstage sobre o manipulador. Este headstage é conectado a um amplificador adequado. Introduza a ponta do eletrodo o perfusato de banho.
   2. Certifique-se o eléctrodo de terra de Ag/AgCl é banhado na mesma solução e que o fluxo é constante. Aplicar soluções de calibração, de forma gradual e gravar as alterações de potenciais em mV, do outro lado da ponta do eletrodo. Esperar que o potencial na ponta do eletrodo para atingir um valor estável antes de mudar para a próxima solução
   3. Medir a mudança de tensão de estado estacionário em resposta a aplicação de soluções de calibração, a ponta do eletrodo. Confirmar que o declive da resposta do eletrodo é pelo menos 52 e não maior que 58 mV por registro de mudança em [K⁺].

3. preparação de fatias de cérebro Hippocampal aguda

1. Preparação de soluções de fatia
   1. Preparar a sacarose 500ml corte solução composta de: sacarose 194 mM, 30 mM de NaCl, 4,5 mM KCl, D-glicose, 1 mM MgCl₂de 10 mM, 1,2 mM NaH₂PO₄e 26 mM NaHCO₃, 290-300 mOsm, saturado com 95% O₂ e 5% de CO₂.
   2. Prepare-se 1-2 litros de solução de gravação (ACSF) compostos por: 124 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 10mm D-glicose, 2 mM CaCl₂, 1,2 mM NaH₂PO₄e 26 mM NaHCO₃; pH 7.3-7.4 (depois da subida), 290-300 mOsm, saturado com 95% O₂ e 5% de CO₂. Encha um copo contendo uma câmara de titular de fatia do cérebro com solução de gravação e mantém-na 32-34 ° C. Encha a câmara de vibratome com lama gelada.
2. Preparação de fatia aguda
   1. Anestesia profundamente um mouse, colocando-o em uma redoma de vidro pré-carregada com 2-3 mL isoflurano. Verificar se há reflexo pitada de dedo do pé e se não-responsivos, decapitá-lo usando um par de tesouras afiadas ou guilhotina como seu protocolo animal exige rapidamente.
   2. Faça uma incisão de 2-3 cm, usando tesouras da porção caudal do crânio para cortar o couro cabeludo ao longo da linha mediana. Enquanto manualmente retraindo o couro cabeludo, fazer duas 1cm horizontal incisões do foramen magnum ao longo dos lados do crânio. Em seguida, usando tesouras bem, corte uma incisão do comprimento do crânio, ao longo da linha mediana da parte posterior do crânio ao nariz.
   3. Usando a pinça bem inserida perto da linha mediana, retraia o incisão no crânio em duas partes. Extrair o cérebro de rato do crânio e usar uma lâmina para remover o cerebelo e os bulbos olfatórios, respectivamente localizadas na porção caudal e rostral do cérebro. Estes podem ser identificados por grandes fissuras, que separação-las do córtex.
   4. Monte o bloco de cérebro a bandeja vibratome com super cola. Encha a bandeja vibratome com solução de corte fria como o gelo.
   5. Seções de tecido sobre o plano coronal em 300 µm de espessura de corte. Geralmente podem ser coletadas 6 fatias hippocampal coronais.
   6. Depois de cada seção é cortada, transferir imediatamente as fatias para a fatia segurando copo aquecido para 32-34° C. Manter as seções nesta temperatura durante 20 minutos antes de retirar o béquer contendo as seções e coloque isto em temperatura ambiente pelo menos 20-30 minutos antes da gravação.

4. medida da dinâmica evocado eletricamente K⁺

1. Configurando a preparação de fatia
   1. Delicadamente, coloque a fatia do cérebro na banheira com uma pipeta Pasteur e suavemente, segure-o no lugar com uma harpa de platina com cordas de nylon.
   2. Certifique-se as pontas do eletrodo bipolar estimulante são paralelas um ao outro e estão nivelados com o avião da fatia. Lentamente, ao longo de 6-7 segundos, inserir os eletrodos CA3 stratum radiatum aproximadamente 40-50 µm fundo para estimular colaterais de Schaffer. Em secções coronais, CA3 pode ser aproximadamente identificada como parte da lateral adequada para a camada de células grânulo no genu hippocampal, hipocampo com o estrato radiatum caindo ventral e medial à camada de célula piramidal.
   3. Insira cuidadosamente o K⁺-elétrodo seletivo em CA1 stratum radiatum aproximadamente 50 µm profunda, diminuindo lentamente o eletrodo durante aproximadamente 3-4 segundos. Permitir que o potencial estabilizar através do eletrodo antes de aplicar estímulos para a fatia: isto geralmente leva de 5 a 10 minutos. Se a fatia exibe espontânea mudanças no extracelular K⁺ então descartar e repita este processo com uma nova fatia.
2. Medida evocados lançamento K⁺
   1. Aplica os comboios de estimulação elétrica (8 pulsos) manualmente pressionando o gatilho sobre o estimulador durante a gravação digital de respostas. Aplica a estimulação em 10 Hz e 1 ms largura de pulso, começando na amplitude de estímulo 10 µA.
   2. Aplique amplitudes de estimulação crescente por um fator de 2 até uma amplitude máxima de resposta K⁺ é detectada. Se você não vê qualquer resposta, mover a posição do eletrodo K⁺ mais perto para o local de estimulação em 100 µm em incrementos
   3. Determine a amplitude do estímulo que produz a meia resposta máxima. Em nossa experiência, isto é entre 40-160 µA, dependendo da qualidade da preparação, idade do animal e a distância entre os eléctrodos de estimulação e elétrodo seletivo do K⁺ .
   4. Na mesma fatia, usando uma amplitude do estímulo em um passo mais baixo do que a amplitude que produz a resposta máxima metade (por exemplo, se 80 µA produz uma resposta de metade-máximo, use 40 µA) aplicam-se os comboios de estímulo de aumentar o número de pulsos. Inicialmente, nós usamos os trens de pulsos de 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 e 128.
   5. Para confirmar que K⁺ sinais são mediados por fuzilamento de potencial de ação do banho de colaterais de Schaffer estimulado eletricamente, aplique 0,5 µM TTX em ACSF por 10 minutos e repita o protocolo de estimulação. Nenhuma resposta evocada deve ser observada.
   6. Depois de terminar o experimento de fatia, confirmar o eletrodo tem mantido sua responsivity pela re-calibrar o eletrodo nas soluções de calibração e garantir a resposta não desviou-se por mais de 10% da calibração inicial

Resultados

Para a medição selectiva de extracelular K⁺, preparamos íon-seletivo microeletrodos revestidos com uma camada hidrofóbica através de silanização de pipetas de vidro de borosilicato limpo (figura 1A). Este revestimento permite que o ionóforo K⁺ contendo valinomicina para descansar na ponta do eletrodo e permitir apenas K⁺ fluxo através de uma abertura estreita na ponta do eletrodo (figura 1B

Discussão

O método que descrevemos aqui nos permitiu avaliar a dinâmica de K⁺ , em resposta à estimulação elétrica de colaterais de Schaffer em fatias hippocampal agudas de ratos adultos. Nosso método de preparação K⁺ microeletrodos seletiva de íons é semelhante a procedimentos anteriormente descritos^12,13,14,15. No entanto, este método tem vantagens sobre configuraçõe...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vibratome	DSK	Microslicer Zero 1
Mouse: C57BL/6NTac inbred mice	Taconic	Stock#B6
Microscope	Olympus	BX51
Electrode puller	Sutter	P-97
Ag/AgCl ground pellet	WPI	EP2
pCLAMP10.3	Molecular Devices	n/a
Custom microfil 28G tip	World precision instruments	CMF28G
Tungsten Rod	A-M Systems	716000
Bipolar stimulating electrodes	FHC	MX21XEW(T01)
Stimulus isolator	World precision instruments	A365
Grass S88 Stimulator	Grass Instruments Company	S88
Borosilicate glass pipettes	World precision instruments	1B150-4
A to D board	Digidata 1322A	Axon Instruments
Signal Amplifier	Multiclamp 700A or 700B	Axon Instruments
Headstage	CV-7B Cat 1	Axon Instruments
Patch computer	Dell	n/a
Sodium Chloride	Sigma	S5886
Potassium Chloride	Sigma	P3911
HEPES	Sigma	H3375
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S0751
D-glucose	Sigma	G7528
Calcium Chloride	Sigma	21108
Magnesium Chloride	Sigma	M8266
valinomycin	Sigma	V0627-10mg
1,2-dimethyl-3-nitrobenzene	Sigma	40870-25ml
Potassium tetrakis (4-chlorophenyl)borate	Sigma	60591-100mg
5% dimethyldichlorosilane in heptane	Sigma	85126-5ml
TTX	Cayman Chemical Company	14964
Hydrochloric acid	Sigma	H1758-500mL
Sucrose	Sigma	S9378-5kg
Pipette Micromanipulator	Sutter	MP-285 / ROE-200 / MPC-200
Objective lens	Olympus	PlanAPO 10xW