Yapma, test etme ve yetişkin beyin doku dilimler halinde potasyum iyon seçici Microelectrodes kullanma

Özet

Potasyum iyonları hücre istirahat membran potansiyelini katkıda bulunmak ve ekstraselüler K⁺ konsantrasyon hücresel uyarılabilirlik çok önemli bir düzenleyicisidir. Biz nasıl yapmak, kalibre ve monopolar K⁺tarif-seçici microelectrodes. Böyle elektrotları kullanarak elektriksel olarak uyarılmış K⁺ konsantrasyon dynamics yetişkin Hipokampal dilimleri içinde ölçüm sağlar.

Özet

Potasyum iyonları hücre istirahat membran potansiyelini önemli ölçüde katkıda bulunmak, bu nedenle, ve ekstraselüler K⁺ konsantrasyonu hücre uyarılabilirlik çok önemli bir regülatör. Aksiyon potansiyeli altında yatan voltaj bağımlı iyon kanalları için kapalı, açık ve Inaktif devletler arasında denge ilerletmeniz istirahat membran potansiyeli ve hücresel uyarılabilirlik ekstraselüler K⁺ etkiler konsantrasyonları değişmiş başlatma ve iletken. Bu nedenle, doğrudan hücre dışı K⁺ dynamics sağlık ve hastalıklı Birleşik ölçmek için değerlidir. Burada, nasıl yapmak, kalibre ve monopolar K⁺tarif-seçici microelectrodes. Biz onları elektriksel olarak uyarılmış K⁺ konsantrasyon dynamics ölçmek için yetişkin Hipokampal beyin dilimler halinde dağıtılabilir. Böyle elektrotlar akılcı kullanımı ekstraselüler K⁺ konsantrasyonları sinir sisteminde kontrol hücresel ve biyofizik mekanizmalar değerlendirmek için gerekli araç kitinin önemli bir parçasıdır.

Giriş

Potasyum iyon konsantrasyonlarının sıkıca beyinde düzenlenir ve onların dalgalanmaları istirahat membran potansiyeli tüm hücrelerin üzerinde güçlü bir etkisi uygulamak. Bu kritik katkıları ışığında Biyoloji önemli bir amacı sıkı K⁺ konsantrasyonu düzenlemek için kullanılan hücresel ve biyofiziksel mekanizmaları hücre dışı alan vücut¹ farklı organlarda belirlemektir ^{, 2}. bu çalışmalarda önemli bir gereksinimi K⁺ konsantrasyonları doğru ölçmek için yeteneğidir. Sağlıklı ve hastalıklı Birleşik beyinde homeostazı potasyum katkıda birçok bileşeni tanımlanan^3,4,5, olmasına rağmen daha fazla ilerleme özel yapısı nedeniyle yavaşladı İyon seçici microelectrodes potasyum ölçüm için hazırlanıyor. Elektrot sensörler K⁺ konsantrasyonları vitro, dokusu dilimlerin ve içinde vivoölçmek için altın standart temsil eder.

K⁺ için yeni yaklaşımlar izleme bunlar biyolojik ilgili aralığı K⁺ konsantrasyonları algılamaz veya tamamen biyolojik sistemlerde, her ne kadar incelenmesi değil ancak optik sensörler, kullanarak ilk sonuçları geliştiriliyor gelecek vaat eden^6,7,8görünür. Elektrot dizilerin Uzaysal çözünürlük⁹artırabilirsiniz optik sensörler için karşılaştırıldığında, microelectrodes temelde bir nokta kaynak ölçüyle iyonlar, sınırlı olmakla birlikte. Bu makale K⁺ dynamics izlemek için tek namlulu elektrot sensörler üzerinde duruluyor.

Bu çalışmada, biz K⁺ selektif microelectrodes, (10⁴ kat K⁺ Na⁺ seçicilik) çok seçici izin veren bir valinomycin tabanlı potasyum ionophore kullanarak yapmak için detaylı kademeli işlemler raporu K⁺ membranlar¹⁰üzerinden hareket. Doğal olarak meydana gelen bir polipeptit valinomycin K⁺ geçirgen gözenek davranır ve K⁺ akış aşağı 's elektrokimyasal gradyan kolaylaştırır. Biz de elektrotlar, kalibre açıklar nasıl depolamak ve bunları kullanmak ve nihayet onları K⁺ konsantrasyon dinamiklerini akut Hipokampal beyin dilimleri yetişkin fareler üzerinden ölçmek için daà ° ã½tma. Böyle elektrotlar ile birlikte hücre dışı K⁺ dynamics düzenleyen için önerilen belirli iyon kanalları eksikliği genetiği değiştirilmiş fare kullanımı K ortam konsantrasyonu kontrol etmek için sinir sistemi tarafından kullanılan hücresel mekanizmaları ortaya çıkarmak ⁺ ekstrasellüler ortamında.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri Ulusal Enstitüsü, Sağlık Rehberi uygun olarak bakım ve kullanım laboratuvar hayvanları için yapılmıştır ve Kaliforniya Üniversitesi, Los Angeles Chancellor's hayvan Araştırma Komitesi tarafından kabul edildi. Bütün fareler ile yiyecek ve su kullanılabilir ad libitum 12 h koyu ortamda muhafaza. Bütün hayvanlar hiçbir belirgin davranış değişiklikleri ile sağlıklı, önceki çalışmalarda dahil edilmemişlerdir ve ışık döngüsü sırasında kurban edildi. Deneyler için veri--dan yetişkin fareler (6-8 hafta tüm deneyler için eski) toplanmıştır.

1. K⁺ selektif microelectrodes hazırlanması

1. Borosilikat cam Silanization
   1. Yeterli cam kılcal paketinden çıkarın ve 50 mL konik tüp içine yerleştirin. Dön konik tüp nazik ajitasyon HCl gecede veya en az 6 saat ile 1 M HCl. yıkama elektrotlar ile doldurun.
   2. Kısaca kılcal % 70 etanol ile durulayın ve 6-8 saat için 100-120 ° C'de tamamen kuru. Yıkanmış kılcal kapları susuz kalsiyum sülfat kurutucu ile 4 hafta daha da kullanmadan önce için saklayın.
   3. Silanization önce kılcal bir elektrot çektirmenin kullanarak iyi bahşiş çek. Kullandığımız microelectrodes yaklaşık 2-5 mikron çapında vardır. Cilt yağlar ile silanization engelleyebilir gibi her zaman eldiven ile yıkanmış kılcal başa.
   4. Microelectrodes elektrotlar alttan uç kırılma önlemek için yüksek bir cam kap içine yerleştirin. Autoclavable teyp veya benzer yapışkan bant kullanarak kapsayıcı microelectrodes saptamak.
   5. Yaklaşık 0.5 mL % 5 dichlorodimethylsilane (DDS) silanization çözeltisi azot değiştirme yöntemini kullanarak kendi kapsayıcıdan Kaldır (bkz. Şekil 2). Bir balon azot gazı ile doldurun ve bir şırınga veya tüp ve iğne için balon ekleyebilirsiniz. İğne ile uzun bir iğne ayrı bir şırınga DDS kadar çizerken DDS konteyner içine yerleştirin.
   6. Silanization çözüm dropwise Pipetler ipuçları için geçerlidir ve hemen kapağı. Microelectrodes silanization çözüm ile Önceden ısıtılmış (170-180 ° C) laboratuvar fırın içine 10-12 saat için ya da 200-220 ° C'de 30 dakika boyunca tutarak konteyner yerleştirin
   7. Kuluçka sonra fırın ve plaka fırından çıkarın. Olarak son derece sıcak plaka kuluçka makinesi çıkartırken dikkatli olun. 10-15 dakika soğumasını Züccaciye Mağazaları için oda sıcaklığında bir bankta plaka yerleştirin.
   8. Microelectrodes (kaset kesmek için bir jilet veya neşter bıçak kullanarak) plaka kaldırmak ve nem alıcı bir dolu hava geçirmez konteyner içine koyun. Silanized microelectrodes nem ücretsiz tutulması için ilâ 1 hafta silanization takip kullanılabilir.
2. Elektrotlar priming
   1. K⁺ ionophore kokteyl stok çözeltisi hazırlamak: % 5 w/v valinomycin, % 93 v/v 1,2-Dimetil-3-nitrobenzene, %2 w/v potasyum tetrakis(4-chlorophenyl) Bor¹¹. Bu çözüm bir soluk sarı renktir. Oda sıcaklığında opak hava geçirmez bir kapta tutun. Düzgün depolanan bu çözüm aylar sürebilir eğer.
   2. 10 mM 300 mM NaCl pH 7.4 arabelleğe HEPES stok çözeltisi hazırlamak. Elektrot bir kelepçe ve backfill bir şırıngaya bağlı 28 G microfil ucu kullanarak tamponlu NaCl ile sabitleyin. Tuzlu çözüm elektrot ucunu sonuna ulaştı gözlemlemek. Elektrot akım akışı ile engelleyebilir büyük baloncuklar ücretsiz olduğunu doğrulayın.
   3. Elektrot ucunu yaklaşık 10-20 µm için geniş, kör tarafı bistüri veya jilet kullanarak bölünürler.
   4. Bir micropipette kullanarak, küçük damlacık (~0.1 µl) elektrot ucuna yakın K⁺ ionophore uygulanır. Elektrot silanized düzgün olmuşsa damlacığı ucu kırık emilir. Dolgu için 1-2 mm K⁺ ionophore ve Kaldır fazla elektrot kağıt mendil kullanarak.

2. K⁺ selektif Microelectrodes kalibrasyonu

1. Kalibrasyon çözüm hazırlanması
   1. KCl eşit Osmolarite yapay serebrospinal sıvı (ACSF) çeşitli konsantrasyonları çözümleri ile KCl NaCl değiştirerek hazırlayın. Biz 0,1, 1, 4.5, 10 ve 100 mM K⁺ ACSF, elektrot kalibrasyon için kullanılır. Bu kalibrasyon çözümler tariflerini Tablo 1' de listelenmiştir.

Kimyasal	MW	son mM	0,1 mM [K +]	1 mM [K +]	4.5 mM [K +]	10 mM [K +]	100 mM [K +]
	(g / mol)
NaCl	58.44	değişir	1,51 g	1.50 g	1.44 g	1.4 g	0,345 g
KCl	1 M hisse senedi	değişir	20 µl	200 µl	900 µl	2 ml	20 ml
CaCl2	1 M hisse senedi	2	400 µl
MgCl2	1 M hisse senedi	1	200 µl
NaH2PO4	119.98	1.2	0.29 g
NaHCO3	84.01	26	0,437 g
D-glikoz	180.16	10	0,360 g
Su	QS 200 ml

Tablo 1. Potasyum kalibrasyon çözüm

2. Elektrot kalibrasyon
   1. Tüm çözümleri ile % 95'i O₂/5% CO₂ deneme başlamadan önce en az 20 dakika kabarcık. Banyo 4,5 mM [K⁺] ile Ventriküler başlamak dakikada 3 mL oranında ACSF. K⁺ seçici elektrot elektrot tutucu elektrot headstage manipülatör üzerinde bağlı yerleştirin. Bu headstage için uygun bir amplifikatör bağlıdır. Elektrot ucunu banyo perfusate yerleştirin.
   2. Ag/AgCl zemin elektrot aynı çözüm içinde boğulmuş olduğunu ve akış sabit olduğundan emin olun. Kalibrasyon çözüm kademeli bir şekilde uygulayın ve olası değişiklikler mV içinde kaydetmek arasında elektrot uç. İstikrarlı bir değer sonraki çözüme geçmeden önce ulaşma potansiyeline elektrot uç bekleyin
   3. Kararlı duruma voltaj değişikliği yanıt kalibrasyon çözüm uygulamaya elektrot uç olarak ölçmek. Elektrot yanıt eğimi en az 52 58 fazla olduğunu doğrulayın ve mV başına günlük değişim [k⁺].

3. akut Hipokampal beyin dilimleri hazırlanması

1. Dilim çözümleri hazırlanması
   1. 500 mL sukroz hazırlamak kesme çözüm oluşur: 194 mM Sükroz, 30 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 10 mM D-glikoz, 1 mM MgCl₂, 1,2 mM NaH₂PO₄ve 26 mM NaHCO₃, 290-300 mOsm, % 95'i O₂ ve %5 CO₂ile doymuş.
   2. 1-2 litre kayıt çözüm (ACSF) oluşan hazırlamak: 124 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 10 mM D-glikoz, 2 mM CaCl₂, 1,2 mM NaH₂PO₄ve 26 mM NaHCO₃; (sonra köpüren) pH 7.3 7.4, 290-300 mOsm, % 95'i O₂ ve %5 CO₂ile doymuş. Çözüm kayıt ile beyin dilim sahibi odası içeren bir kabı ve 32-34 ° C'de tutmak Vibratome odası buz-su slush ile doldurun.
2. Akut dilim hazırlık
   1. Derin bir fare çan ile 2-3 mL isoflurane precharged bir kavanoza koyarak anestezi. Ayak çimdik refleks için kontrol ve non-yanıt veren, hızlı bir şekilde hayvan iletişim kuralı gerektirir gibi keskin makas veya Giyotin bir çift kullanarak başını kesmek.
   2. Orta çizgi boyunca kafa derisi kesmek için kafatasının Kaudal bölümünden makası kullanarak 2-3 cm kesi yapmak. El ile kafa derisi geri çeker iken, iki 1 cm Yatay kesikler deliği magnum kenarlarında üzerinden kafatası yapmak. Sonra iyi makası kullanarak, bir kesi uzunluğu boyunca kafatasının arkasından orta hat burnuna kafatası kesti.
   3. İyi forseps orta hat takılı kullanarak, iki porsiyon kazıma kafatasında geri çek. Fare beyin kafatasından ayıklamak ve serebellum ve beyin Kaudal ve rostral bölümleri sırasıyla bulunan olfaktör ampuller kaldırmak için bir bıçak kullanın. Bunlar ayrı them korteks büyük çatlaklar belirlenebilir.
   4. Beyin blok süper yapıştırıcı kullanarak vibratome tepsi üzerine monte. Vibratome tepsi buz gibi soğuk kesme çözüm ile doldurun.
   5. Doku bölümleri 300 µm kalınlık, koronal uçakta kesti. Genellikle 6 koronal Hipokampal dilimleri toplanabilir.
   6. Her bölüm kesmek sonra hemen kabı 32-34 ° C'ye sıcak tutan dilim için dilimleri aktarın Bölümü içeren kabı kaldırmadan önce bölümler 20 dk için bu sıcaklıkta tutmak ve oda sıcaklığında en az 20-30 dakika kayıt önce burası.

4. elektriksel olarak uyarılmış K⁺ Dynamics ölçümü

1. Dilim hazırlık kurma
   1. Yavaşça banyoda Pasteur pipet kullanarak beyin dilim yerleştirin ve nazikçe Platin harp naylon dizeleri ile olan yerde tutun.
   2. İki kutuplu uyarıcı elektrot uçları birbirine paralel ve dilim boyutunda düzeyiyle olun. Yavaş yavaş, 6-7 saniye boyunca, elektrotlar CA3 stratum radiatum yaklaşık 40-50 µm derin Schaffer de¤erler uyarmak için ekleyin. Koronal bölümlerde CA3 yaklaşık Hipokampus uygun lateral Hipokampal genu granül hücre katmanında bölümüyle piramit hücre katmanı düşen medial ve ventral stratum radiatum ile tespit edilebilir.
   3. Dikkatle K⁺Ekle-seçici elektrot CA1 stratum radiatum yaklaşık 50 µm elektrot yaklaşık 3-4 saniye içinde yavaş yavaş azaltarak derin içine. Dilimi elektrodlar uygulamadan önce elektrot arasında dengelemek için potansiyel izin: Bu genellikle 5-10 dakika sürer. Dilimi spontan sergileyen Eğer değişiklikleri ekstraselüler k⁺ sonra atmak ve yeni bir dilim ile bu işlemi tekrarlayın.
2. K⁺ sürüm ölçü uyarılmış
   1. Trenler elektrik stimülasyon (8 bakliyat) el ile uyarıcı tetiğe dijital olarak yanıt kaydederken iç karartıcı tarafından uygulanır. Uyarımı 10 Hz ve 10 µA uyarıcı genlik başlangıç 1 ms darbe genişliği de uygulanır.
   2. En fazla bir K⁺ yanıt genlik gelinceye artan stimülasyon genlikleri 2 kat uygulanır. Herhangi bir yanıt yoksa, 100 µm artışlarla stimülasyon sitedeki K⁺ elektrot daha yakın konumunu taşımak
   3. Yarım maksimal yanıt üreten uyarıcı genlik belirlemek. Deneyim, bu 40-160 µA, bağlı olarak üzerine hazırlık kalite, hayvan ve stimülasyon elektrotlar ve K⁺ seçici elektrot arasındaki mesafe yaş arasındadır.
   4. Bir adımda yarım maksimal yanıt üreten genlik düşük bir uyarıcı genlik aynı dilimi kullanarak (örneğin 80 µA bir yarı-azami yanıt neden oluyorsa, 40 µA kullanın) nabız sayısı artan uyarıcı trenler uygulamak. Başlangıçta, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 ile 128 bakliyat tren kullandık.
   5. K⁺ sinyalleri elektriksel olarak uyarılmış Schaffer de¤erler banyo aksiyon potansiyeli ateş tarafından aracılı onaylamak için 0.5 µM TTX ACSF içinde 10 dakika boyunca uygulayın ve stimülasyon protokolü. Hiçbir çatışmaya yanıt dikkat edilmelidir.
   6. Dilim deney bitirdikten sonra elektrot elektrot kalibrasyon çözüm yeniden ayarlama tarafından onun responsivity ettirmiştir ve yanıt sağlanması fazla % 10 oranında ilk kalibrasyon dan sapma değil onaylamak

Sonuçlar

Hücre dışı K⁺seçici ölçüm için iyon-seçici microelectrodes temiz borosilikat cam Pipetler (şekil 1A) silanization ile hidrofobik bir tabaka ile kaplı hazırladık. Bu kaplama valinomycin elektrot uç vasıl dinlenme ve sadece K⁺ akı elektrot uç (şekil 1B) dar bir delikten izin vermeyi içeren K⁺ ionophore sağlar. Elektrotlar göre backfilled tuzlu çözüm ve K⁺ ionophor...

Tartışmalar

Biz burada tarif yöntemi bize K⁺ dynamics yetişkin fareler tarafından yapılan yanıt Schaffer de¤erler akut Hipokampal dilimleri içinde elektrik stimülasyon olarak değerlendirmek izin verdi. K⁺ iyon seçici microelectrodes hazırlama bizim daha önce açıklanan yordamları^12,13,14,15' e benzer bir yöntemdir. Ancak, hızlı ve basit K⁺ selektif microele...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vibratome	DSK	Microslicer Zero 1
Mouse: C57BL/6NTac inbred mice	Taconic	Stock#B6
Microscope	Olympus	BX51
Electrode puller	Sutter	P-97
Ag/AgCl ground pellet	WPI	EP2
pCLAMP10.3	Molecular Devices	n/a
Custom microfil 28G tip	World precision instruments	CMF28G
Tungsten Rod	A-M Systems	716000
Bipolar stimulating electrodes	FHC	MX21XEW(T01)
Stimulus isolator	World precision instruments	A365
Grass S88 Stimulator	Grass Instruments Company	S88
Borosilicate glass pipettes	World precision instruments	1B150-4
A to D board	Digidata 1322A	Axon Instruments
Signal Amplifier	Multiclamp 700A or 700B	Axon Instruments
Headstage	CV-7B Cat 1	Axon Instruments
Patch computer	Dell	n/a
Sodium Chloride	Sigma	S5886
Potassium Chloride	Sigma	P3911
HEPES	Sigma	H3375
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S0751
D-glucose	Sigma	G7528
Calcium Chloride	Sigma	21108
Magnesium Chloride	Sigma	M8266
valinomycin	Sigma	V0627-10mg
1,2-dimethyl-3-nitrobenzene	Sigma	40870-25ml
Potassium tetrakis (4-chlorophenyl)borate	Sigma	60591-100mg
5% dimethyldichlorosilane in heptane	Sigma	85126-5ml
TTX	Cayman Chemical Company	14964
Hydrochloric acid	Sigma	H1758-500mL
Sucrose	Sigma	S9378-5kg
Pipette Micromanipulator	Sutter	MP-285 / ROE-200 / MPC-200
Objective lens	Olympus	PlanAPO 10xW