Machen, Prüfung und Verwendung von Kalium-Ionen selektive Mikroelektroden im erwachsenen Gehirn Gewebe Scheiben

Zusammenfassung

Kalium-Ionen zur Membran-Ruhepotential der Zellen und extrazellulären K⁺ -Konzentration ist ein entscheidender Regulator der zellulären Erregbarkeit. Wir beschreiben, wie zu machen, zu kalibrieren und monopolare K⁺-selektive Mikroelektroden. Mit Hilfe dieser Elektroden ermöglicht die Messung von elektrisch evozierten K⁺ Konzentration Dynamik in Erwachsene hippocampal Scheiben.

Zusammenfassung

Kalium-Ionen wesentlich dazu beitragen, die Membran-Ruhepotential der Zellen und extrazellulären K⁺ Konzentration ist daher ein entscheidender Regulator der Erregbarkeit der Zelle. Konzentrationen von extrazellulären K⁺ beeinflussen die ruhenden Membran potenzielle und zellulären Erregbarkeit durch Verschiebung der Gleichgewichte zwischen geschlossenen, offenen und inaktivierten im Hinblick auf spannungsabhängige Ionenkanäle, die Aktionspotentials zugrunde liegen verändert Initiierung und Leitung. Daher ist es wertvoll, extrazelluläre K⁺ Dynamik im Gesundheits- und Kranken Staaten direkt zu messen. Hier beschreiben wir, wie zu machen, zu kalibrieren und monopolare K⁺-selektive Mikroelektroden. Wir ihnen in Erwachsene hippocampal Gehirnscheiben elektrisch evozierten K⁺ Konzentration Dynamik Messen eingesetzt. Die vernünftige Nutzung von solchen Elektroden ist ein wichtiger Bestandteil der zelluläre und biophysikalische Mechanismen zu bewerten, die extrazelluläre K⁺ -Konzentrationen im Nervensystem Steuern musste Toolkit.

Einleitung

Kalium-Ionen-Konzentrationen sind fest im Gehirn geregelt, und deren Schwankungen üben einen starken Einfluss auf die Membran-Ruhepotential aller Zellen. Im Hinblick auf diese kritische Beiträge ist ein wichtiges Ziel der Biologie, die zellulären und biophysikalischen Mechanismen zu bestimmen, die verwendet werden, um die Konzentration von K⁺ fest zu regulieren in den extrazellulären Raum in verschiedenen Organen des Körpers^{1 , 2}. eine wichtige Voraussetzung in diesen Studien ist die Fähigkeit, K⁺ Konzentrationen genau zu messen. Obwohl viele Komponenten, die zur Kalium Homöostase im Gehirn in gesunden und Kranken Staaten beitragen identifizierten^3,4,5, wurden wurde weitere Fortschritte aufgrund der speziellen Art der verlangsamte Messung von Kalium vorbereiten Ionen selektive Mikroelektroden. Mikroelektrode Sensoren sind der Goldstandard für die Messung von K⁺ -Konzentrationen in Vitro, Gewebe und in Vivo.

Neuere Ansätze zur K⁺ Überwachung sind in der Entwicklung mit optischen Sensoren, aber diese eine biologisch relevante Bereich von K⁺ -Konzentrationen nicht erkennen oder nicht wurde komplett in biologischen Systemen, überprüft haben obwohl erste Ergebnisse erscheinen Sie vielversprechend^6,7,8. Im Vergleich zu optischen Sensoren, sind Mikroelektroden grundsätzlich beschränkt sich auf eine Punktquelle Messung von Ionen, obwohl Elektroden die räumliche Auflösung⁹verbessert werden könnte. Dieser Artikel konzentriert sich auf die Einzel-barreled Mikroelektrode Sensoren zur Überwachung der K⁺ Dynamik.

In dieser Arbeit berichten wir detaillierte schrittweise Verfahren zu K⁺ selektive Mikroelektroden, mit einer Streptomyceten-basierte Kalium Ionophore, die hochselektiven erlaubt (10⁴ Fach K^{+ +} Na Selektivität) K⁺ Bewegung über Membranen¹⁰. Eine natürlich vorkommende Polypeptid, Streptomyceten fungiert als eine K⁺ durchlässige Pore und erleichtert den Fluss von K⁺ hinunter die elektrochemischen Gradienten. Wir beschreiben auch, wie die Elektroden zu kalibrieren wie zu speichern und sie verwenden und schließlich zur Messung der K⁺ Konzentration Dynamik in akuten hippocampal Hirnschnitten von Erwachsenen Mäusen bereitgestellt. Die Verwendung von solchen Elektroden zusammen mit genetisch veränderten Mäusen, die spezifische Ionenkanäle vorgeschlagen, extrazelluläre K⁺ Dynamik regulieren fehlt zeigen sollte, die zellulären Mechanismen verwendet durch das Nervensystem, die ambient Konzentration von K zu kontrollieren ⁺ in das extrazelluläre Milieu.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden durchgeführt in Übereinstimmung mit den nationalen Institut Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren und wurden von der Kanzlers Animal Research Committee an der University of California, Los Angeles genehmigt. Alle Mäuse waren mit Futter und Wasser zur Verfügung Ad Libitum in einer 12 h hell-dunkel-Umgebung untergebracht. Alle Tiere waren gesund mit keine offensichtlichen Verhaltensänderungen, nicht in früheren Studien einbezogen wurden und während der lichtzyklus geopfert wurden. Daten für Experimente wurden von Erwachsenen Mäusen (6-8 Wochen alt für alle Experimente) gesammelt.

1. Vorbereitung des selektiven Mikroelektroden K⁺

1. Silanisierung von Borosilikatglas
   1. Ausreichende Glaskapillaren aus der Verpackung nehmen und in ein 50 mL konische Rohr legen. 1 M HCl. Wash Elektroden mit sanften Agitation in HCl über Nacht oder mindestens 6 Stunden lang konischem Rohr nach oben einfüllen.
   2. Spülen Sie kurz Kapillaren mit 70 % Ethanol und dann komplett bei 100-120 ° C für 6 bis 8 Stunden trocknen. Gewaschene Kapillaren in Behältern mit wasserfrei Calcium-Sulfat-Trockenmittel für bis zu 4 Wochen vor dem weiteren Gebrauch aufbewahren.
   3. Ziehen Sie vor der Silanisierung die Kapillaren zu einer feinen Spitze mit einer Mikroelektrode Puller. Die Mikroelektroden, die wir verwenden sind ca. 2 bis 5 Mikrometer im Durchmesser. Handhaben Sie gewaschene Kapillaren mit Handschuhen, als Silanisierung Öle aus der Haut stören können.
   4. Legen Sie Mikroelektroden in einem Glasbehälter, sodass die Elektroden von der Unterseite zur Spitze Bruch zu verhindern erhöht sind. Befestigen Sie die Mikroelektroden an den Container mit autoklavierbar Band oder ähnliches Klebeband.
   5. Entfernen Sie etwa 0,5 mL 5 % Dichlorodimethylsilane (DDS) Silanisierung Lösung aus dem Behälter mit der Stickstoff-Ersatz-Methode (siehe Abbildung 2). Füllen Sie einen Ballon mit Stickstoffgas und legen Sie eine Spritze oder Tube und Nadel auf den Ballon. Stechen Sie die Nadel in den DDS-Behälter bei der Erstellung DDS in eine separate Spritze über eine längere Nadel.
   6. Wenden Sie die Silanisierung Lösung tropfenweise bis in die Spitzen der Pipetten und sofort zu decken. Stellen Sie den Behälter mit Mikroelektroden Silanisierung Lösung in einen vorgewärmten (170-180 ° C) Labor-Ofen für 10-12 Stunden oder bei 200-220 ° C für 30 Minuten
   7. Nach der Inkubation den Ofen ausschalten und dann die Platte aus dem Ofen nehmen. Seien Sie vorsichtig beim Entfernen der Plattenrandes aus dem Inkubator, da es sehr heiß ist. Legen Sie die Platte auf einer Bank bei Raumtemperatur für 10-15 Minuten die Gläser abkühlen lassen.
   8. Entfernen Sie die Mikroelektroden aus der Platte (mit einer Rasierklinge oder einem Skalpellklinge Band Abschneiden) und legen Sie sie in einem Trockenmittel gefüllten luftdichten Behälter. Silanisiert Mikroelektroden frei von Feuchtigkeit können bis zu 1 Woche nach der Silanisierung verwendet werden.
2. Grundieren die Elektroden
   1. Bereiten Sie eine Stammlösung K⁺ Ionophore cocktail: 5 % w/V Streptomyceten, 93 % V/V 1,2-Dimethyl-3-Nitrobenzene, Kalium 2 % w/V tetrakis(4-chlorophenyl) Borat¹¹. Diese Lösung ist eine schwache gelbe Farbe. Unterhalt in einem luftdichten, undurchsichtige Behälter bei Raumtemperatur. Wenn diese Lösung richtig gelagert mehrere Monate dauern kann.
   2. Bereiten Sie eine Stammlösung von 10 mM HEPES 300 mM NaCl bei pH 7,4 gepuffert. Befestigen Sie die Elektrode in eine Klemme und Abgleich mit der gepufferten NaCl mit einer 28G Microfil Spitze verbunden mit einer Spritze. Beachten Sie, dass die Kochsalzlösung das Ende der Mikroelektrode Spitze erreicht hat. Bestätigen Sie, dass der Mikroelektrode große blasenfrei, die den Stromfluss stören könnten.
   3. Lösen Sie die Elektrodenspitze mit ca. 10-20 µm breit, mit der stumpfen Seite ein Skalpell oder einer Rasierklinge.
   4. Tragen Sie mit einer Mikropipette ein kleines Tröpfchen (~0.1 µl) des K⁺ Ionophore nahe der Spitze der Mikroelektrode. Wenn die Elektrode richtig silanisiert wurde die gebrochene Spitze das Tröpfchen absorbiert. Füllen Sie die Elektrode 1 – 2 mm mit dem K⁺ Ionophore, und entfernen Sie überschüssiges mittels Tissue-Papier.

2. Kalibrierung des selektiven Mikroelektroden K⁺

1. Vorbereitung der Kalibrierlösungen
   1. Erarbeiten Sie Lösungen der verschiedenen Konzentrationen von KCl in gleicher Osmolarität künstliche Liquor cerebrospinalis (ACFS) NaCl durch KCl ersetzen. Für die Kalibrierung der Elektroden verwendeten wir 0,1, 1, 10 und 100 mM K⁺ ACFS, 4.5. Die Rezepte für diese Kalibrierlösungen sind in Tabelle 1aufgeführt.

Chemische	MW	endgültige mM	0,1 mM [K +]	1 mM [K +]	4,5 mM [K +]	10 mM [K +]	100 mM [K +]
	(g / Mol)
NaCl	58.44	variiert	1,51 g	1,50 g	1,44 g	1,4 g	0,345 g
KCl	1 M Lager	variiert	20 µl	200 µl	900 µl	2 ml	20 ml
CaCl2	1 M Lager	2	400 µl
MgCl2	1 M Lager	1	200 µl
NaH2PO4	119,98	1.2	0,29 g
Nahco33	84.01	26	0,437 g
D-Glucose	180.16	10	0,360 g
Wasser	q.s. 200 ml

Tabelle 1. Kalium-Kalibrierlösungen

2. Mikroelektrode Kalibrierung
   1. Bubble-alle Lösungen mit 95 % O₂5 % CO₂ für mindestens 20 Minuten vor Beginn des Experiments. Beginnen, das Bad mit 4,5 mM [K⁺] Vorrichtung ACFS mit einer Rate von 3 mL pro Minute. Legen Sie die K⁺ selektivere Elektrode in Elektrodenhalter an der Elektrode Headstage auf dem Manipulator angebracht. Diese Headstage ist an einen entsprechenden Verstärker angeschlossen. Legen Sie die Spitze der Elektrode in Bad Perfusat.
   2. Sicherstellen der Masseelektrode Ag/AgCl in derselben Lösung getaucht ist und stabil läuft. Gelten Sie Kalibrierlösungen in einer schrittweisen Mode und zeichnen Sie die möglichen Änderungen in mV über die Elektrodenspitze auf. Warten Sie auf das Potential an der Elektrodenspitze, einen stabilen Wert zu erreichen, bevor Sie mit der nächsten Lösung wechseln
   3. Messen Sie die Steady-State-Spannungsänderung in Reaktion auf die Anwendung der Kalibrierlösungen auf der Elektrodenspitze. Bestätigen Sie, dass die Neigung der Elektrode Antwort mindestens 52 und nicht mehr als 58 mV pro Protokoll Wechsel in [K⁺].

3. Vorbereitung des akuten Hippocampal Gehirnscheiben

1. Vorbereitung der Slice-Lösungen
   1. Bereiten Sie 500 mL Saccharose schneiden Lösung bestehend aus: 194 mM Saccharose, 30 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 10 mM D-Glucose, 1 mM MgCl₂, 1,2 mM NaH₂PO₄, und 26 mM Nahco3₃, 290-300 mOsm, gesättigt mit 95 % O₂ und 5 % CO₂.
   2. Bereiten Sie 1-2 Liter Aufnahmelösung (ACFS) bestehend aus: 124 mM NaCl, 4,5 mM KCl, MgCl₂1 mM, 10 mM D-Glucose, 2 mM CaCl₂, 1,2 mM NaH₂PO₄und 26 mM Nahco3₃; pH 7,3-7,4 (nach sprudeln), 290-300 mOsm, gesättigt mit 95 % O₂ und 5 % CO₂. Füllen Sie einen Becher mit einem Gehirn Scheibe Halter Kammer mit recording-Lösung und halten Sie es bei 32-34 ° C. Füllen Sie die Vibratome Kammer mit Eiswasser Matsch.
2. Akuten Slice-Vorbereitung
   1. Betäuben Sie tief eine Maus indem man es unter einer Glasglocke mit ca. 2-3 mL Isofluran voraufgeladen. Überprüfen Sie Zehe Prise Reflex, und wenn nicht mehr reagiert, schnell enthaupten mit ein paar scharfen Scheren oder Guillotine, da Ihr Tiere Protokoll erfordert.
   2. Machen Sie einen ca. 2-3 cm Schnitt mit der Schere aus dem kaudalen Teil des Schädels an die Kopfhaut entlang der Mittellinie geschnitten. Während manuell einfahren der Kopfhaut, stellen Sie zwei 1 cm horizontale Einschnitte aus dem Foramen Magnum entlang der Seiten des Schädels. Dann schneiden mit feinen Schere Sie einem Schnitt der Länge des Schädels, entlang der Mittellinie von der Rückseite des Schädels an der Nase.
   3. Mit feinen Pinzette eingefügt, in der Nähe der Mittellinie, zurückziehen des eingeritzten Schädels in zwei Portionen. Extrahieren Sie das Gehirn der Maus aus dem Schädel zu und verwenden Sie eine Klinge um zu entfernen, das Kleinhirn und der olfaktorischen Lampen, die jeweils an der kaudalen und rostral Teile des Gehirns befinden. Diese können durch die große Risse identifiziert werden, die sie aus dem Kortex trennen.
   4. Montieren Sie den Gehirn-Block auf der Vibratome Tablett mit super-Klebstoff. Füllen Sie Vibratome Tablett mit eiskalten Cutting-Lösung.
   5. Schneiden Sie Gewebeschnitte auf der koronalen Ebene bei 300 µm Dicke. In der Regel können 6 koronale hippocampale Scheiben gesammelt werden.
   6. Nach jedem Schnitt sofort übertragen Sie die Scheiben auf die Scheibe halten Becherglas auf 32-34° c erwärmt Halten Sie die Abschnitte bei dieser Temperatur für 20 min vor dem Entfernen der Becher mit den Abschnitten und stellen Sie diese bei Raumtemperatur mindestens 20-30 Minuten vor der Aufnahme.

4. Messung von elektrisch evozierten K⁺ Dynamik

1. Einrichten der Slice-Vorbereitung
   1. Legen Sie vorsichtig die Gehirn-Scheibe in der Badewanne mit einer Pasteurpipette und halten Sie ihn sanft mit einem Platin Harfe mit Nylon-Saiten.
   2. Sicherzustellen, dass die Spitzen der anregenden bipolare Elektrode parallel zueinander und sind mit dem Flugzeug der Scheibe. Langsam, im Laufe von ca. 6-7 Sekunden, legen Sie den Elektroden in CA3 Stratum Radiatum ca. 40-50 µm tief um Schaffer Sicherheiten zu stimulieren. Im koronalen Abschnitte können CA3 etwa als der Teil des Hippocampus richtige Lateral, das Granulat Zellschicht an der hippocampalen Genu mit der Stratum Radiatum fallen mediale und ventralen auf der pyramidalen Zellschicht identifiziert werden.
   3. Legen Sie die K⁺-selektiven Elektrode in CA1 Stratum Radiatum ca. 50 µm tief, langsam senken die Elektrode über ca. 3-4 Sekunden. Das Potenzial, über die Elektrode zu stabilisieren, bevor Stimulationen auf die Scheibe zu ermöglichen: Dies dauert in der Regel 5 bis 10 Minuten. Wenn die Scheibe spontane zeigt Veränderungen der extrazellulären K⁺ dann verwerfen und wiederholen Sie diesen Vorgang mit einer neuen Scheibe.
2. Messen Sie evozierten K⁺ -Freigabe
   1. Gelten Sie Züge der elektrischen Stimulation (8 Impulse) durch manuell drücken den Auslöser auf der Stimulator während der Aufnahme Digital Antworten. Gelten Sie Stimulation bei 10 Hz und 1 ms Pulsbreite, beginnend bei 10 µA Impuls Amplitude.
   2. Gelten Sie zunehmende Stimulation Amplituden um einen Faktor von 2, bis eine maximale K⁺ Antwort Amplitude erkannt wird. Wenn Sie keine Antwort angezeigt werden, verschieben Sie die Position der Elektrode näher K⁺ Stimulation Standort in Schritten von 100 µm
   3. Bestimmen Sie die Impuls-Amplitude, die die halbe maximale Reaktion produziert. Nach unserer Erfahrung ist dies zwischen 40-160 µA, je nach Qualität der Vorbereitung, Alter des Tieres und der Abstand zwischen Stimulation Elektroden und selektiven Elektrode K⁺ .
   4. In dem gleichen Segment mit einem Impuls-Amplitude am niedriger als die Amplitude, die die halbe maximale Reaktion produziert einen Schritt (z.B. wenn 80 µA eine Hälfte-maximale Reaktion erzeugt, verwenden 40 µA) gelten Reiz Züge der zunehmenden Anzahl von Impulsen. Zunächst haben wir Züge der 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 und 128 Impulse verwendet.
   5. Um zu bestätigen, dass K⁺ Signale durch Aktionspotential Abfeuern von elektrisch stimuliert Schaffer Sicherheiten Bad vermittelt werden, gelten Sie 0,5 µM TTX in ACFS für 10 Minuten und wiederholen Sie die Stimulation-Protokoll. Keine evozierten Antworten sollten beachtet werden.
   6. Nach Beendigung der Slice-Experiment, zu bestätigen, die Elektrode unterhält seine Empfindlichkeit durch neu kalibrieren der Elektrode in die Kalibrierlösungen und Gewährleistung der Reaktion ist nicht um mehr als 10 % von der ersten Kalibrierung abgewichen

Ergebnisse

Für selektive Messung der extrazellulären K⁺bereiteten wir IONENSELEKTIVE Mikroelektroden beschichtet mit einer hydrophoben Schicht durch Silanisierung sauber Borosilikatglas Pipetten (Abbildung 1A). Diese Beschichtung ermöglicht die K⁺ -Ionophore mit Streptomyceten zum Ausruhen an der Spitze der Elektrode und erlauben nur K⁺ Fluss durch eine schmale Öffnung an der Elektrodenspitze (Abbildung 1 b

Diskussion

Die Methode, die wir hier beschreiben konnten wir K⁺ Dynamik als Reaktion auf die elektrische Stimulation von Schaffer Sicherheiten in akuten hippocampal Scheiben von Erwachsenen Mäusen zu beurteilen. Unsere Methode der Vorbereitung K⁺ Ion selektiv Mikroelektroden ist ähnlich wie bei den zuvor beschriebenen Verfahren^12,13,14,15. Diese Methode hat jedoch Vorteile gegenüb...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vibratome	DSK	Microslicer Zero 1
Mouse: C57BL/6NTac inbred mice	Taconic	Stock#B6
Microscope	Olympus	BX51
Electrode puller	Sutter	P-97
Ag/AgCl ground pellet	WPI	EP2
pCLAMP10.3	Molecular Devices	n/a
Custom microfil 28G tip	World precision instruments	CMF28G
Tungsten Rod	A-M Systems	716000
Bipolar stimulating electrodes	FHC	MX21XEW(T01)
Stimulus isolator	World precision instruments	A365
Grass S88 Stimulator	Grass Instruments Company	S88
Borosilicate glass pipettes	World precision instruments	1B150-4
A to D board	Digidata 1322A	Axon Instruments
Signal Amplifier	Multiclamp 700A or 700B	Axon Instruments
Headstage	CV-7B Cat 1	Axon Instruments
Patch computer	Dell	n/a
Sodium Chloride	Sigma	S5886
Potassium Chloride	Sigma	P3911
HEPES	Sigma	H3375
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S0751
D-glucose	Sigma	G7528
Calcium Chloride	Sigma	21108
Magnesium Chloride	Sigma	M8266
valinomycin	Sigma	V0627-10mg
1,2-dimethyl-3-nitrobenzene	Sigma	40870-25ml
Potassium tetrakis (4-chlorophenyl)borate	Sigma	60591-100mg
5% dimethyldichlorosilane in heptane	Sigma	85126-5ml
TTX	Cayman Chemical Company	14964
Hydrochloric acid	Sigma	H1758-500mL
Sucrose	Sigma	S9378-5kg
Pipette Micromanipulator	Sutter	MP-285 / ROE-200 / MPC-200
Objective lens	Olympus	PlanAPO 10xW