El análisis genético de Transthyretin Ala97Ser hereditario relacionadas con amiloidosis

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para confirmar la presencia de la mutación de punto para la diagnosis del amyloidosis de transthyretin hereditario, con Ala97Ser, la mutación más común endémica de Taiwán, por ejemplo.

Resumen

Las pruebas genéticas están la prueba más fiable para hereditaria por transtiretina relacionada con amiloidosis y debe realizarse en la mayoría de los casos del amyloidosis de transthyretin (ATTR). ATR es una enfermedad rara pero fatal con fenotipos heterogéneos; por lo tanto, la diagnosis se retrasa a veces. Con el aumento de atención y el reconocimiento más amplio de manifestaciones tempranas de atributos, así como tratamientos emergentes, estudios diagnóstico apropiados, incluyendo el genética del transthyretin (TTR) de prueba, para confirmar los tipos y variantes del ATR son por lo tanto fundamental para mejorar el pronóstico. Análisis genéticos con métodos de reacción en cadena (PCR) polimerasa confirman la presencia de mutaciones puntuales TTR mucho más rápido y más seguro que los métodos convencionales como la mancha blanca /negra meridional. Aquí, demostramos la confirmación genética de la mutación Ala97Ser ATTR, la mutación más común endémica de Taiwán. El protocolo consta de cuatro pasos principales: recogiendo muestras de sangre entera, la extracción de ADN, el análisis genético de los cuatro exones TTR con PCR y secuenciación de ADN.

Introducción

Amyloidosis de transthyretin (TTR) (ATTR) es la forma más común de amiloidosis sistémica hereditaria¹y puede ser causado por una mutación autosómica dominante heredada en la del gene del transthyretin (TTR)². Mutaciones de TTR desestabilizan la estructura de la proteína tetramérica y conducen a su disociación en monómeros que vuelve a montar en²de las fibrillas amiloideas. Más de 100 mutaciones de TTR amyloidogenic han sido reportados en todo el mundo¹. Análisis genéticos con métodos de reacción en cadena (PCR) polimerasa confirman la presencia de la mutación de punto TTR y tienen ventajas como evitar la manipulación de sondas marcadas radiactivamente en comparación con la mancha blanca /negra meridional³. PCR es una técnica rápida, fácil, barata y confiable que se ha aplicado a diversos campos de las ciencias modernas⁴.

El diagnóstico precoz de esta enfermedad progresiva y fatal es difícil dada su heterogeneidad fenotípica. Con el aumento de atención y el reconocimiento más amplio de las manifestaciones tempranas de atributos así como los emergentes de los tratamientos⁵, estudios diagnóstico apropiados incluyendo pruebas genéticas TTR son críticamente fundamentales para mejorar el pronóstico. Además, diversas mutaciones se asocian con diferentes penetrancia del rasgo, edad de inicio, patrones de evolución, severidad de la enfermedad, mediana de la supervivencia, eficacia del trasplante del hígado, o TTR estabilizadores^2,6, y grados variables de la implicación neurológica y cardiológica, que tienen grandes implicaciones para el asesoramiento genético^7,8,9. Además, una prueba genética altamente exacta es la única herramienta que distingue los dos tipos de atributos: hereditario (mutante) y tipo salvaje (no-mutante forma, amyloidosis systemic senil, SSA)⁷. Es imprescindible confirmar los tipos de atributos, porque los tratamientos varían ampliamente². Por lo tanto, hay una creciente necesidad para describir el protocolo paso a paso de la prueba genética de TTR.

La aproximación molecular para detectar la mutación será ilustrada con Ala97Ser, la mutación más común endémica de Taiwán, por ejemplo. Modificaciones en el paso de extracción de ADN reducen la cantidad de las tres soluciones que utiliza y produce una cantidad suficiente de ADN. En este protocolo, se analizaron los cuatro exones TTR, mientras incluyendo 5' contra la corriente, 3' abajo, promotores, intrones, regiones y regiones sin traducir (UTR) no fueron ordenadas.

Protocolo

Las pruebas realizadas en el laboratorio se llevó a cabo conforme a las prescripciones de los clínicos laboratorio mejora enmiendas (CLIA) de 1988, las normas aprobadas por el institucional de Junta de Chang Gung Memorial Hospital y Universidad (licencia no. 100 - 4470A3 y 104-2462A3). Se obtuvo consentimiento informado de todos los pacientes.

1. sangre recogida

1. Recoja la sangre en tubos de tratados con EDTA disponibles comercialmente. Mezclar suavemente y almacenar la muestra de sangre a 4 ° C hasta el procesamiento.

2. ADN extracción de sangre periférica

Utilice un Kit de extracción de ADN para la extracción de ADN genómica (véase Tabla de materiales).

1. Añadir 10 mL de solución 1 para la muestra de sangre de 4,0 mL. Incubar la muestra en hielo durante 10 minutos.
2. Centrifugar la muestra a 2.000 x g durante 5 min a 4 ° C. Retire y descarte el sobrenadante cuidadosamente. Resuspender el precipitado en 3 mL de solución 1.
3. Centrifugar la muestra a 2.000 x g durante 5 min a 4 ° C otra vez y descartar el sobrenadante. Resuspender el precipitado en 3 mL de solución 2.
4. Añadir 10 μl de la solución madre de pronasa (225 mg/mL) para obtener una concentración final de 100 μg/mL y mezclar bien. Incubar a 37 ° C durante la noche.
5. Enfriar el tubo en hielo durante 10 minutos agregar 0,8 mL de solución 3 a la muestra e invertir 3 - 5 veces. Coloque la muestra en hielo durante 5 minutos.
6. Centrifugar la muestra a 3.000 x g durante 15 min a 4 ° C. Cuidadosamente transfiera el sobrenadante a un tubo de centrifugadores cónicos estériles de 15 mL.
7. Añadir 6 μl de solución stock de Rnasa (10 mg/mL) para obtener una concentración final de 20 μg/mL. Incubar a 37 ° C durante 15 minutos.
8. Añadir 2,5 mL de alcohol isopropílico y mezclar bien invirtiendo suavemente varias veces para precipitar DNA (se forman filamentos de material blanco, floculante). Utilizando una pipeta de gran diámetro, transferir el precipitado de ADN a un nuevo tubo de centrífuga de 1.5 mL.
9. Centrifugar a 12.000 x g durante 3 min a 4 ° C. Descartar el sobrenadante cuidadosamente. Pellet de ADN lavar añadiendo 500 μl de etanol al 70%.
10. Centrifugar a 12.000 x g durante 1 min y descartar el sobrenadante. Secar el pellet de ADN a temperatura ambiente. Añada 100 μl de ddH₂O e incubar a 65 ° C por 15 min a Resuspender el ADN.

3. cuantificación de ADN genómica

Use un espectrofotómetro (véase Tabla de materiales) para detectar la cantidad y calidad de la DNA genomic.

1. Inicie sesión en el ordenador conectado a la máquina de espectrofotómetro. Abrir el software.
2. Inicializar la máquina del espectrofotómetro:
   1. Haga clic en "Ácidos nucleicos" en el software de espectrofotómetro.
   2. Limpie el pedestal con una toallita de papel desechable y agua purificada.
3. En blanco el espectrofotómetro:
   1. 2 μl de agua purificada en el pedestal de la carga.
   2. Baje el brazo superior del espectrofotómetro y haga clic en "En blanco" para calibrarlo.
   3. Cuando esté hecho, levante el brazo y seque el pedestal con una toallita.
4. Medida de la muestra:
   1. Haga clic en "ADN-50" en el tipo de muestra.
   2. 2 μl de muestra de ADN en el pedestal de la carga.
   3. Baje el brazo y haga clic en "Medida" para medir el cociente A260/A280 y la concentración de la muestra.
   4. Limpie el pedestal entre cada serie con un trapo y agua purificada.
5. Haga clic en "Imprimir pantalla" para recoger los datos.

4. genéticos análisis de mutaciones

Amplificar el ADN diana con el PCR⁴. Realizar PCR en una reacción de 25 μl mezcla utilizando una polimerasa de la DNA kit (véase Tabla de materiales). La tabla 1 muestra el gen TTR intronic cartillas.

gene	Secuencia de primer
Exon1	F: 5'-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3' R: 5'-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3'
Exon2	F: 5'-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3' R: 5'-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3'
Exon3	F: 5'-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3' R: 5'-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3'
Exon4	F: 5'-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3' R: 5'-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3'

Tabla 1. Cebadores intronic del gene de TTR. (Secuencia NCBI referencia: NC_000018.10)

1. Añadir los reactivos en la tabla 2 a un tubo PCR de 0.2 mL.

Componentes	Volumen (μL)	Concentración final
10 x Buffer	2.5	1 x
MgCl2 (25 mM)	1.5	1,5 mM
Potenciador de GC 360	1	-
Polimerasa de la DNA 360	0.2	2 reacción U
dNTP Mix (25 mM)	2	2 mM
Primer F (10 μm)	1	0.4 ΜM
Primer R (10 μm)	1	0.4 ΜM
ADN (100 ng)	2
Agua grado PCR	13.8	-
Volumen total	25	-

Tabla 2. Condiciones de reacción de PCR.

2. Mezclar suavemente y centrifugar brevemente en una centrífuga de mesa para recoger todos los componentes en la parte inferior del tubo. Coloque el tubo en un termociclador.
3. Realizar PCR para 30 ciclos. Cada ciclo consiste en un paso de desnaturalización durante 30 s a 94 ° C, primer recocido durante 30 s a 58 ° C y la extensión de la polimerasa para 45 s a 72 ° C (ver tabla 3).

Paso	Temperatura (° C)	Tiempo	ciclo
Desnaturalización inicial	95	5 min	1
Paso de la desnaturalización de ADN	94	30 s	30 ciclos
Paso de recocido de la cartilla	58	30 s	30 ciclos
Paso de extensión de polimerasa	72	45 s	30 ciclos
Paso de elongación post	72	10 min	1
Final de la polimerización en cadena bicicleta	4	Indefinida

Tabla 3. Condiciones para la amplificación de productos de la PCR en bicicleta.

4. Validar el producto PCR visualizando con electroforesis en gel:
   1. Preparar un gel de agarosa al 1.2%:
      1. 1.2 g de agarosa en polvo se mezclan con 100 mL de 0.5 x TBE en una mufla para microondas. Microondas durante 2 minutos hasta que la agarosa se disuelva completamente. Enfríe la mezcla de agarosa a 55 ° C.
      2. Añadir 2 μl de una solución de bromuro de etidio (10 mg/mL) a la mezcla de agarosa y mezclar suavemente. Vierta la mezcla de agarosa en una bandeja de gel a 5-7 mm, luego añadir la comb(s) en lugar. Deje que se solidifique (por lo menos 30 minutos) y retire con cuidado la comb(s).
   2. Las muestras de la carga y ejecuta un gel de agarosa:
      1. Coloque el gel y bandeja en la célula de electroforesis. Llenar la célula de electroforesis con 0.5 x TBE hasta cubre el gel.
      2. Cuidadosamente la carga 2 μl de 100 bp ADN ladder (véase Tabla de materiales) en el otro carril del gel como marcador de tamaño molecular. Mezcla de tinte/muestra de carga (5 μl de mezcla de productos PCR con 1 μl 6 x tinte de carga) en los carriles adicionales.
      3. Encienda la fuente de alimentación. Correr el gel durante 25 minutos a 100 V.
      4. Retirar el gel de la célula de electroforesis. Visualizar los fragmentos de ADN bajo luz de un sistema de proyección de imagen UV.

5. secuencia de ADN

1. Purificar productos PCR utilizando un kit comercial y secuencia comercialmente o con un secuenciador automático (véase Tabla de materiales).
2. Enviar secuencias de nucleótidos en el servidor de NCBI BLAST para comparar la consulta nucleótidos los nucleótidos bases de datos¹⁰. Después de que los resultados se muestran, realizar alineaciones de la secuencia e identificar la mutación esperada.

Resultados

Electroforesis en agarosa de dos pacientes y bandas reveló individuales saludables uno de los tamaños previstos, incluyendo un producto PCR bp 454 para el exón 4 del gene de TTR (figura 1).

Figura 1 . Electroforesis en gel con PCR amplificaron el gen TTR. Normal: un i...

Discusión

Hay dos pasos críticos en el protocolo. En primer lugar, para tener el suficiente número de glóbulos blancos, un espécimen de hemodiluted debe ser evitada¹¹. En segundo lugar, el uso de adecuados primers PCR es fundamental para obtener resultados fiables¹². Utilizamos la herramienta de la web de cartilla-BLAST para diseñar los primers^4,13; debe cubrir un mínimo de 40 pares de bases en cada lado de los cuatro e...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
EDTA-treated tubes	BD
DNA Extraction Kit	Stratagen	200600
NanoDrop ND2000 spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	NanoDrop 2000
Delicate Task Wipers	Kimberly-Clark	Kimtech Science Kimwipes
AmpliTaq Gold 360 DNA Polymerase kit	Applied Biosystems	4398823
TTR gene intronic primers	Exon1	F: 5’-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3’
	Exon1	R: 5’-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3’
	Exon2	F: 5’-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3’
	Exon2	R: 5’-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3’
	Exon3	F: 5’-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3’
	Exon3	R: 5’-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3’
	Exon4	F: 5’-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3’
	Exon4	R: 5’-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3’
thermocycler	Applied Biosystems	GeneAmp PCR System 9700
electrophoresis cell	ADVANCE	Mupid-2plus
DNA ladder	Protech	PT-M1-100
dye	BioLabs	B7021
AlphaImager EC	Alpha Innotech	AlphaImager EC
automatic sequencer	Applied Biosystems	3730xl DNA Analyzer