Análise genética de hereditária transtirretina Ala97Ser relacionados a amiloidose

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para confirmar a presença da mutação de ponto para o diagnóstico de amiloidose hereditária transtirretina, usando Ala97Ser, a mutação mais comum endémica em Taiwan, por exemplo.

Resumo

Testes genéticos são o teste mais confiável para transtirretina hereditária relacionadas com amiloidose e deve ser realizado na maioria dos casos de amiloidose transtirretina (ATTR). ATTR é uma doença rara mas fatal com fenótipos heterogêneos; Portanto, o diagnóstico é por vezes adiado. Com o aumento da atenção e reconhecimento mais amplo sobre as manifestações iniciais de ATTR, bem como tratamentos emergentes, estudos de diagnósticos adequados, incluindo a transtirretina (TTR) genética teste, para confirmar os tipos e variantes de ATTR são, portanto fundamental para melhorar o prognóstico. Análises genéticas com métodos de reação em cadeia (PCR) polimerase confirmam a presença de mutações pontuais TTR muito mais rápido e mais seguro do que métodos convencionais tais como borrão do Sul. Aqui, demonstramos a confirmação genética da ATTR Ala97Ser mutação, a mutação mais comum endémica em Taiwan. O protocolo é composto por quatro etapas principais: coleta de amostra de sangue total, a extração de DNA, a análise genética de todos os quatro exões TTR com PCR e sequenciamento de DNA.

Introdução

Amiloidose transtirretina (TTR) (ATTR) é a forma mais comum de amiloidose sistêmica hereditária¹e pode ser causada por uma mutação autossômica dominante herdada no gene transtirretina (TTR)². Mutações de TTR desestabilizam a estrutura da proteína tetramérica e levam a sua dissociação em monômeros que reagrupa em amiloides². Mais de 100 mutações de TTR amiloidogénicos foram relatados em todo o mundo¹. Análises genéticas com métodos de reação em cadeia (PCR) polimerase confirmam a presença da mutação de ponto TTR e têm vantagens, incluindo evitar a manipulação de sondas radioactivamente etiquetadas em comparação com o borrão do Sul³. PCR é uma técnica rápida, fácil, barata e confiável que tem sido aplicada a inúmeros campos em ciências modernas⁴.

O diagnóstico precoce desta doença progressiva e fatal é um desafio, dada a sua heterogeneidade fenotípica. Com o aumento da atenção e reconhecimento mais amplo sobre as manifestações iniciais de ATTR, bem como as emergentes de tratamentos⁵, estudos de diagnóstico apropriados, incluindo teste genético de TTR, portanto, são criticamente fundamentais para melhorar o prognóstico. Além disso, diferentes mutações estão associados com penetrância diferente do traço, idade de início, os padrões de progressão, severidade da doença, a sobrevida mediana, eficácia do transplante de fígado, ou TTR estabilizadores^2,6, e graus variáveis de envolvimento neurológico e cardiológico, que têm grandes implicações para o aconselhamento genético^7,8,9. Além disso, um teste genético altamente preciso é a única ferramenta que diferencia os dois tipos distintos de ATTR: hereditária (mutante) e tipo selvagem (formulário não mutantes, amiloidose sistêmica senil, SSA)⁷. É imperativo para confirmar os tipos de ATTR, porque as terapias variam amplamente². Portanto, há uma necessidade crescente para descrever o protocolo gradual do teste genético de TTR.

A abordagem molecular para detectar a mutação será ilustrada usando o Ala97Ser, a mutação mais comum endémica em Taiwan, por exemplo. Modificações na etapa de extração de DNA, reduzir a quantidade das três soluções usadas e produz uma quantidade suficiente de DNA. Neste protocolo, todos os quatro exões TTR foram analisados, enquanto regiões incluindo 5' montante 3' a jusante, os promotores, os intrões, e regiões untranslated (UTR) não foram sequenciadas.

Protocolo

Os testes realizados em laboratório foi realizado em conformidade com os requisitos do clínico laboratório melhoria alterações (CLIA), de 1988, os regulamentos aprovados pela institucional Review Board de Chang Gung Memorial Hospital e Universidade (licença n º 100 - 4470A3 e 2462A3-104). Foi obtido o consentimento de todos os pacientes.

1. coleta de amostras de sangue

1. Colete sangue total em tubos de EDTA-Tratado comercialmente disponíveis. Misture delicadamente e armazenar a amostra de sangue a 4 ° C até o processamento.

2. o DNA extraído do sangue periférico

Usar um Kit de extração de DNA para a extração de DNA genômica (ver Tabela de materiais).

1. Adicione 10 mL de solução 1 para a amostra de sangue de 4,0 mL. Incube a amostra no gelo por 10 min.
2. Centrifugar a amostra a 2.000 x g por 5 min a 4 ° C. Remover e descartar o sobrenadante cuidadosamente. Resuspenda o pellet em 3 mL de solução 1.
3. Centrifugar a amostra a 2.000 x g por 5 min a 4 ° C novamente e descartar o sobrenadante. Resuspenda o pellet em 3 mL de solução 2.
4. Adicione 10 µ l de solução-mãe pronase (225 mg/mL) para obter uma concentração final de 100 µ g/mL e misture bem. Incube a 37 ° C durante a noite.
5. Refrigere o tubo no gelo durante 10 min. Adicionar 0,8 mL de solução 3 para a amostra e inverter a 3 - 5 vezes. Coloque a amostra no gelo por 5 min.
6. Centrifugar a amostra a 3.000 x g por 15 min a 4 ° C. Transferi com cuidado o sobrenadante para um tubo de centrifuga conico estéril 15 mL.
7. Adicione 6 µ l da solução estoque do RNase (10 mg/mL) para obter uma concentração final de 20 µ g/mL. Incube a 37 ° C por 15 min.
8. Adicione 2,5 mL de álcool isopropílico e misturar completamente suavemente várias vezes por inversão para precipitar o DNA (fios de material branco, floculante formarão). Usando uma pipeta de grande diâmetro, transferi o dessensibilizador de DNA para um novo tubo de centrifugação de 1,5 mL.
9. Centrifugar a 12.000 x g por 3 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante cuidadosamente. Pellet de DNA lave adicionando 500 µ l de etanol 70%.
10. Centrifugar a 12.000 x g por 1 min e descartar o sobrenadante. Ar seca pelota do ADN à temperatura ambiente. Adicione 100 µ l de DDQ₂O e incubar a 65 ° C por 15 min Ressuspender o DNA.

3. quantificação de DNA genômica

Use um espectrofotômetro (consulte a Tabela de materiais) para detectar a quantidade e a qualidade do DNA genômico.

1. Faça logon no computador ligado à máquina Espectrofotômetro. Abra o software.
2. Inicialize a máquina espectrofotômetro:
   1. Clique em "Ácidos nucleicos" sobre o software de Espectrofotômetro.
   2. Limpe o pedestal com uma toalhita de papel descartáveis e água purificada.
3. Branco o espectrofotômetro:
   1. Carrega 2 µ l de água filtrada no pedestal.
   2. Abaixe o braço superior do espectrofotómetro e clique "Em branco" para calibrá-lo.
   3. Quando estiver pronto, levante o braço e o pedestal com uma limpeza a seco.
4. Medida da amostra:
   1. Clique em "DNA-50" no tipo de amostra.
   2. Carrega 2 µ l de amostra de DNA no pedestal.
   3. Abaixe o braço superior e clique em "Medida" para medir a relação A260/A280 e a concentração da amostra.
   4. Limpe o pedestal entre cada execução com uma limpeza e água purificada.
5. Clique em "Print Screen" para coletar os dados.

4. genéticas análises de mutações

Amplifica o ADN do alvo com a PCR⁴. Realizar a PCR em uma reação de 25 µ l kit de mistura usando uma DNA polimerase (ver Tabela de materiais). A tabela 1 mostra o gene TTR intrônicas cartilhas.

Gene	Sequência da primeira demão
Exon1	F: 5'-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3' R: 5'-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3'
Exon2	F: 5'-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3' R: 5'-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3'
Exon3	F: 5'-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3' R: 5'-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3'
Exon4	F: 5'-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3' R: 5'-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3'

Tabela 1. As primeiras demão intrônicas de gene TTR. (Sequência de referência NCBI: NC_000018.10)

1. Adicione os reagentes na tabela 2 , a um tubo PCR de 0,2 mL.

Componentes	Volume (µ l)	Concentração final
10 x Buffer	2.5	1 x
MgCl2 (25 mM)	1.5	1.5 mM
360 GC Enhancer	1	-
360 da DNA polimerase	0.2	2 U/reação
dNTP Mix (25 mM cada)	2	2 mM cada
Primeira demão F (10 µM)	1	0,4 ΜM
Primeira demão R (10 µM)	1	0,4 ΜM
DNA (100 ng)	2
Água da PCR-classe	13,8	-
Volume total	25	-

Tabela 2. Condições de reação de PCR.

2. Misture delicadamente e centrifugue brevemente em uma centrífuga de bancada para coletar todos os componentes para o fundo do tubo. Colocar o tubo em um thermocycler.
3. Realize o PCR para 30 ciclos. Cada ciclo consiste de uma etapa de desnaturação por 30 s a 94 ° C, primeira demão recozimento por 30 s a 58 ° C e extensão do polymerase para 45 s a 72 ° C (ver quadro 3).

Passo	Temperatura (° C)	Tempo	ciclo de
Desnaturação inicial	95	5 min	1
Passo de desnaturação do DNA	94	30 s	30 ciclos
Passo de recozimento da primeira demão	58	30 s	30 ciclos
Etapa da extensão do polymerase	72	45 s	30 ciclos
Etapa de alongamento do post	72	10 min	1
Final do PCR ciclismo	4	Por tempo indeterminado

Tabela 3. Condições de ciclismo para amplificar produtos do PCR.

4. Valide o produto do PCR visualizando com eletroforese em gel:
   1. Prepare um gel de agarose 1,2%:
      1. Misturar 1,2 g de agarose em pó com 100 mL de 0.5 x TBE num balão microwavable. Microondas por 2 min até a agarose é completamente dissolvido. Arrefecer a mistura de agarose a 55 ° C.
      2. Adicionar 2 µ l de uma solução de brometo de etídio (10 mg/mL) para a mistura de agarose e misture delicadamente. Despeje a mistura de agarose em uma bandeja de gel para cerca de 5 a 7 mm, em seguida, adicione o comb(s) no lugar. Deixe-o solidificar (pelo menos 30 min) e remova cuidadosamente comb(s).
   2. Carregar amostras e executar um gel de agarose:
      1. Coloque o gel e bandeja para a célula de electroforese. Preencher a célula de eletroforese com 0,5 x TBE até que o gel é coberto.
      2. Cuidadosamente, carregar 2 µ l de uma 100 bp DNA ladder (ver Tabela de materiais) para a um faixa do gel como marcador de tamanho molecular. Mistura de corante/amostra de carga (5 µ l do mix de produtos PCR com 1 µ l 6 x tintura de carregamento) em pistas adicionais.
      3. Ligue a fonte de alimentação. Funcione o gel para 25 min a 100 V.
      4. Remova o gel da célula de electroforese. Visualize os fragmentos de DNA sob UV luz em um sistema da imagem latente.

5. sequenciamento de DNA

1. Purificar os produtos de PCR usando um kit comercial e sequenciar comercialmente ou com um sequenciador automático (consulte a Tabela de materiais).
2. Envie sequências de nucleotídeos para o servidor de NCBI BLAST para comparar a consulta de bancos de dados o nucleotídeo¹⁰nucleotídeo. Depois que os resultados são exibidos, realizar alinhamentos de sequência e identificar a mutação esperada.

Resultados

Electroforese do gel de agarose de dois pacientes e uma saudável individual revelou bandas dos tamanhos esperados, incluindo um produto PCR bp 454 para exon 4 do gene TTR (Figura 1).

Figura 1 . Eletroforese em gel retratando PCR amplificados gene TTR. Normal: um indiví...

Discussão

Há duas etapas críticas dentro do protocolo. Em primeiro lugar, a fim de ter o número suficiente de células brancas do sangue, um espécime de hemodiluted deve ser evitada¹¹. Em segundo lugar, o uso de primers PCR apropriados é fundamental para obter resultados fiáveis¹². Usamos a ferramenta web de Primer-BLAST para projetar as primeiras demão^4,13; um mínimo de 40 pares de base em cada lado dos exões TTR qu...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
EDTA-treated tubes	BD
DNA Extraction Kit	Stratagen	200600
NanoDrop ND2000 spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	NanoDrop 2000
Delicate Task Wipers	Kimberly-Clark	Kimtech Science Kimwipes
AmpliTaq Gold 360 DNA Polymerase kit	Applied Biosystems	4398823
TTR gene intronic primers	Exon1	F: 5’-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3’
	Exon1	R: 5’-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3’
	Exon2	F: 5’-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3’
	Exon2	R: 5’-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3’
	Exon3	F: 5’-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3’
	Exon3	R: 5’-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3’
	Exon4	F: 5’-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3’
	Exon4	R: 5’-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3’
thermocycler	Applied Biosystems	GeneAmp PCR System 9700
electrophoresis cell	ADVANCE	Mupid-2plus
DNA ladder	Protech	PT-M1-100
dye	BioLabs	B7021
AlphaImager EC	Alpha Innotech	AlphaImager EC
automatic sequencer	Applied Biosystems	3730xl DNA Analyzer