Eficiente purificación y desarrollo análisis LC-MS/MS-based para diez-once 2 desplazamiento 5-METILCITOSINA dioxigenasa

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para una purificación eficiente solo paso del humano sin etiquetar activo desplazamiento de diez-once-2 (TET2) 5-METILCITOSINA dioxygenase utilizando cromatografía de intercambio iónico y su ensayo con una masa líquida de la cromatografía-tandem Espectrometría (LC-MS/MS)-enfoque basado en.

Resumen

La regulación epigenética de la transcripción mediada por la 5-METILCITOSINA (5mC) ha desempeñado un papel crítico en el desarrollo de eucariota. Desmetilación de estas marcas epigenéticas se logra por oxidación secuencial de diez-once desplazamiento dioxygenases (TET1-3), seguido de la timina ADN glicosilasa dependiente supresión base reparación. Inactivación del gen TET2 debido a mutaciones genéticas o por otros mecanismos epigenéticos se asocia con un pronóstico pobre en pacientes con diversos tipos de cáncer, especialmente de malignidades hematopoyéticas. Aquí, describimos una purificación eficiente solo paso de enzimáticamente activa sin etiquetar dioxigenasa de TET2 humana usando la cromatografía de intercambio catiónico. Además ofrecemos un enfoque líquido cromatografía-tandem espectrometría de masas (LC-MS/MS) que se puede separar y cuantificar las cuatro bases del ADN normales (A, T, G y C), así como de las cuatro bases de citosina modificado (5-metil, 5-hidroximetil, 5-formil y 5-carboxilo). Este ensayo puede utilizarse para evaluar la actividad de tipo salvaje y mutante TET2 dioxygenases.

Introducción

La posición C5 de bases de citosina en los dinucleótidos CpG es el sitio predominante de metilación (5mCpG) en genomas mamíferos¹. Además, varios estudios recientes han descubierto extensa metilación de citosina de C5 (5mC) en sitios de CpG no (5mCpH, donde H = A, T, o C)^2,3. modificación de la 5mC sirve como un silencioso transcripcional en retrotransposones endógeno y genes promotores^3,4,5. La metilación del ADN en 5mC también juega un papel importante en la inactivación del cromosoma X, impresión de gene, reprogramación nuclear y expresión de genes específicos de tejido^5,6,7. Metilación de la citosina en la posición C5 se lleva a cabo por las ADN metiltransferasas, y las mutaciones en estas enzimas causan defectos de desarrollo significativo⁸. La eliminación de las marcas de 5mC iniciada por TET1-3 5mC oxidasas^9,10. Estos dioxygenases de TET-familia convertir 5mC 5-hidroximetilcitosina (5hmC), 5-formylcytosine (fC 5) y 5-carboxylcytosine (5caC) por oxidación secuencial pasos^11,12,13. Finalmente, reemplaza a timina ADN glicosilasa fC 5 o 5caC de citosina no modificado usando la base de la supresión reparación vía¹¹.

El gene humano de TET2 fue identificado como un gen mutado con frecuencia en diversas neoplasias hematopoyéticas incluyendo myelodysplastic (MDS) los síndromes^14,15,16, (neoplasias mieloproliferativas MDS MDS-MPN) y la leucemia mieloide aguda (AML) originarios del MDS y MDS-MPN¹⁶. Los niveles de modificación de 5hmC en la médula ósea ADN son menores en pacientes con mutaciones TET2 comparadas con aquellos con el tipo salvaje (wt)-TET2¹⁴. Varios grupos han desarrollado modelos de ratón knockout TET2 para aclarar su papel en la hematopoyesis normal y transformación mieloide^17,18,19,20. Estos ratones con mutaciones en el gen TET2 fueron inicialmente normal y viable, pero se manifiesta diversas malignidades hematopoyéticas como ellos de años causando su temprana muerte. Estos estudios demostraron el importante papel desempeñado por la wt TET2 en diferenciación Hematopoyética normal. En estos modelos de ratón, las células madre hematopoyéticas heterozigóticas (TET2^+- HSCs) y homocigótica TET2^{- / -} HSCs tenían una ventaja competitiva sobre homocigotos wt-TET2 HSCs en repoblación linajes hematopoyéticos como ambos TET2^+- y TET2^{- / -} HSCs desarrolló diversas malignidades hematopoyéticas^17,18. Estos estudios demuestran el haploinsufficiency de TET2 dioxygenase altera el desarrollo de HSCs y resultados de las malignidades hematopoyéticas.

Similar a los ratones con mutaciones en el gen TET2, la mayoría de pacientes con leucemia manifiestan haploinsufficiency de TET2 dioxygenase actividad. Estas mutaciones somáticas principalmente heterozigóticas incluyen mutaciones de cambio del marco y absurdo dispersadas por todo el cuerpo de gene TET2 mientras que las mutaciones sin sentido que están más agrupados en el dioxygenase dominio¹². Hasta la fecha, poca caracterización de wt y mutante TET2 es divulgado en la literatura principalmente debido a las dificultades con la producción de TET2 dioxigenasa y su ensayo²¹. Aquí, Divulgamos una simple purificación solo paso de nativo dioxygenase TET2 mediante cromatografía de intercambio iónico. Además, un ensayo LC-MS/MS fue optimizado y utilizado para medir la actividad enzimática del dioxygenase TET2 nativo.

Protocolo

1. clonación y purificación del Dioxygenase TET2 humano sin etiquetar

1. Clon humano TET2 dioxigenasa (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) en el vector de destino de pDEST14 utilizando la técnica de recombinación específica del sitio como se describió anteriormente²².
   Nota: Estudios previos han demostrado que el dominio C-terminal TET2 dioxigenasa (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) es el dominio catalítico activo mínimo^21,23. Para expresar el dominio sin etiquetar de dioxygenase TET2 utilizando el vector de pDONR221, secuencias Shine Dalgarno y Kozak se incorporaron en el primer avance durante PCR (tabla 1).
2. Para la transformación bacteriana, añadir 1 μl de vector de la expresión de pDEST14 recombinante que contiene humano dioxygenase TET2 sin etiquetar (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) a 100 μl de químicamente competentes de e. coli BL21 (DE3) las células en un tubo de 1,7 mL. Mantener la mezcla en hielo durante al menos 15 minutos seguido por choque térmico a 42 ° C para 30 s en un baño de agua.
   1. Inmediatamente después del choque del calor, mantener las células en hielo para mínimo de 2 minutos. A continuación, Añadir 250 μl de caldo super óptima con represión catabólica (S.O.C medios) a las células. Incube las células bacterianas por 1 h a 37 ° C en un agitador.
   2. Después de la incubación, desactivación de las células por centrifugación del tubo a 9.000 x g durante 1 min descartar sobrenadante de 70% mediante pipeteo y disolver el pellet en la izquierda sobre los medios de comunicación.
   3. Extender la suspensión de células en una placa de agar Luria caldo (LB) que contiene 100 ampicilina μg/mL. Incubar la placa de 16 h a 37 ° C.
3. Seleccionar una colonia aislada e inocular en 10 mL de medio LB-ampicilina en un tubo de 50 mL. Incubar el tubo a 37 º C en un agitador para pasar la noche. A continuación, utilice 100 μl del cultivo desde el tubo de 50 mL para inocular 100 mL de medio LB-ampicilina. Incube el frasco a 37 ° C en un agitador a 180 rpm y usarlo como cultivo primario. Al día siguiente, usar 6 mL de cultivo primario para inocular frascos de 15, cada que contiene medios de 600 mL LB-ampicilina. Ahora, incubar 15 frascos a 37 º C en un agitador a 180 rpm.
   Nota: Para verificación de clones transformados, realizar digestión de secuenciación o restricción de ADN con el ADN del plásmido aislado.
4. Para comprobar la densidad de cultivo bacteriano, medir su OD₆₀₀ usando un espectrofotómetro. Después de que la cultura alcance una densidad de 0,8 en OD₆₀₀, inducen la expresión de la proteína TET2 con 300 μL de 1 IPTG de M (concentración final de 0,5 mM en 600 mL) en cada frasco y crecer aún más la cultura de 16 h a 17 ° C.
5. Después de 16 h, transferir el cultivo bacteriano a botellas de centrífuga. Centrifugar el cultivo bacteriano expresan la enzima TET2 a 5.250 x g durante 45 min uso el pellet bacteriano TET2 purificación.
   Nota: Realice todos los pasos de purificación de proteínas restantes en el hielo o a 4 ° C.
6. Resuspender el precipitado bacteriano en 100 mL de MES de 50 mM (2-(N-morfolino) ácido (n-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-ácido) tampón, pH 6 y someter a ultrasonidos de 5 × 30 s a la potencia 20 con intervalos de enfriamiento de s 60.
7. Los filtros de vuelta recoge el sobrenadante que contiene la enzima soluble TET2 lisado a 5.250 x g durante 45 minutos y pasa a través de 0,45 μm antes de la carga en un sistema FPLC.
   Nota: En estos experimentos, la enzima TET2 era muy estable, pero si es necesario una proteasa inhibidor coctel que contiene 1 mM benzamidine-ácido clorhídrico, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM (PMSF) y 0,5 mM 1,10 -o- fenantrolina puede añadirse a la celda de lisado de evitar la degradación de la enzima TET2. Evitar el uso de EDTA o EGTA en el inhibidor de Cóctel como éstos pueden interferir con la siguiente cromatografía de intercambio catiónico.
8. Paquete de 30 mL de una resina de intercambio catiónico fuerte en una columna FPLC. Equilibrar la columna con 10 volúmenes de cama de tampón de lavado (buffer MES de 50 mM, pH 6) en el flujo constante de 0,3 mL/min utilizando un sistema FPLC.
9. Cargar el clarificado lisado en la columna previamente equilibrado y el lavado con volúmenes de cama de ∼10 de tampón de lavado hasta que el flujo a través de llega a estar claro.
10. Eluir TET2 utilizando un 0-100% gradiente desde el tampón de lavado para el tampón de elución (buffer MES de 50 mM, pH 6, 1 M NaCl) en 15 volúmenes de cama siguió manteniendo en el tampón de elución de 100% para volúmenes de dos camas.
    Nota: Recoger muestras (100 μL) de lisado antes y después de cargar con todas las fracciones de elución de la columna de la celda y analizar 10% solución de SDS-PAGE.
11. Piscina las fracciones que contienen proteína TET2, congelar seco, disolver plataforma de enzimas en 10 mL de agua y conservar a-80 ° C.

2. 5mC oxidación por TET2 dioxigenasa

1. Llevar a cabo todas las reacciones de desmetilación por triplicado con 3 μg de sustrato (25-mer doble trenzado DNA, tabla 2).
   1. Añadir 50 μl de tampón de reacción total que contiene 50 mM HEPES (pH 8.0), 200 μm de FeSO₄, 2 mM 2OG 100 μg de enzima purificada de TET2 (2-oxoglutarato/α-cetoglutarato) y 2 mM ascorbato e incubar a 37 ° C por 1 h²¹.
   2. Quench TET2 catalizado reacciones de oxidación con 5 μl de EDTA de 500 mM.
2. Después de apagar las reacciones TET2, preparar muestras para el análisis por LC-MS/MS por separar el ADN de mezcla de reacción TET2 utilizando columnas de purificación de oligo.
   1. Añadir 100 μl de tampón de Unión oligo a 55 μl de reacción apagada.
   2. A continuación, añadir 400 μL de etanol al 100% a la mezcla. Pasar esta mezcla por una columna de enlace de oligo.
   3. Lavar el ADN enlazado con 750 μl de tampón de lavado y eluir en 20 μl de agua.
3. Digerir el ADN aislado con 2 unidades de la ADNsa I y 60 unidades de Nucleasa S1 a 37 ° C por 12 h para producir la Unión de análogos de los nucleósidos individuales.
4. Después de la digestión, agregar 2 unidades de la fosfatasa alcalina intestinal de ternera (CIAP) en las muestras e incubar además de 12 h a 37 ° C para eliminar los grupos fosfato terminales de nucleósido-Unión para la obtención de nucleósidos.
5. Cuantificar los nucleósidos, especialmente modificados cytosines, utilizando el método LC-MS/MS que se describe a continuación.

3. cuantitativa análisis LC-MS/MS-based desarrollo

1. Preparar solución stock de 100 μm de los nucleósidos modificados citosina [5-metil-2 '-desoxicitidina (5mdC), 5-hidroximetil-2 '-desoxicitidina (5hmdC), 5-formil-2 '-desoxicitidina (5fdC) y el 5-carboxi-2 '-desoxicitidina (5cadC)] y ADN normal bases (adenina, timina, citosina y guanina) en agua grado HPLC durante el desarrollo del método LC-MS/MS.
2. Optimizar parámetros de MS/MS de nucleósido-dependiente por infusión de soluciones, uno a la vez, modo de exploración en el espectrómetro de masas a un flujo de 10 μl/min en EMS. Optimizar siguiendo parámetros: desclusterización potencial (DP), entrada potencial (EP), colisión celda entrada potencial (CEP), colisión de energía (CE) y colisión célula salida potencial (CXP) para cada uso de nucleósidos del ADN automatizado optimización cuantitativa característica del software.
3. Optimizar parámetros de MS/MS Fuente dependiente inyectan 10 μl de la solución madre con una pendiente de 25% solvente B a una velocidad de flujo de 0,3 mL/min., donde A es acetato de amonio 10 mM (pH 4.0) y B es acetonitrilo 20% con acetato de amonio 10 mM (pH 4.0). Optimizar siguiendo parámetros: cortina de Gas (CUR): 10-50, temperatura: 0-600 ° C, flujo de Gas 1 (GS1): 0-50, Gas Flow 2 (GS2): 0-50, disociación Collisionally activado (CAD): baja-media-alta, Ion spray tensión (es): 4000-5500 para cada nucleósido de ADN utilizando el manual de función de optimización cuantitativos del software en modo de FIA (análisis por inyección en flujo).
4. Para separar los ocho nucleósidos del ADN, realizar cromatografía líquida utilizando el siguiente gradiente: 0% de disolvente B (0-2 min), 0-20% disolvente B (2-5 min), 20-60% de disolvente B (5-9 min), disolvente de 60-0% B (9-10 min) y luego equilibrar con solvente A durante 5 minutos a un caudal de 0,3 mL/min en una columna C18 (tamaño de partícula: 5 μm, tamaño de poro: 120 Å).
5. Utilizando los parámetros óptimos de MS/MS (paso 3.2 y 3.3) juntados con el gradiente de cromatografía líquido antes mencionado (paso 3.4), determinar la linealidad de la respuesta, límite de detección (LOD) y límite inferior de cuantificación (LLOQ) utilizando un doble dilución seriada de una mezcla estándar de 100 μm, que contiene todos los ocho nucleósidos. Dibujar curvas estándar para los ocho nucleósidos del ADN.
6. Detectar y cuantificar los nucleósidos, especialmente modificados cytosines, producidos en el paso 2.4 usando el método LC-MS/MS y curvas estándar.

Resultados

Modificación dinámica de 5mC en ADN por TET-familia dioxygenases juega un papel importante en las regulaciones transcripcionales epigenéticas. Dioxygenase TET2 es transformado con frecuencia en diversas malignidades hematopoyéticas¹². Para investigar el papel de la enzima TET2 en desarrollo normal y la enfermedad, hemos clonado su dominio catalítico activo mínimo sin ninguna etiqueta de afinidad en el vector de pDEST14²². El dioxygenas...

Discusión

Las mutaciones en el gen TET2 son algunos de los cambios genéticos más frecuentemente detectados en pacientes con malignidades hematopoyéticas diversos. Hasta la fecha cientos de mutaciones diferentes de TET2, que incluyen el cambio del marco y absurdo y mutaciones sin sentido, se han identificado en pacientes¹². Pacientes con mutaciones TET2 muestran niveles bajos de 5hmC genómica en la médula ósea en comparación con aquellos con TET2 wt¹⁴. TET2 mu...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEPES	Carbosynth	FH31182
Iron(II) sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	F8633
α-Ketoglutaric acid (2-Oxoglutaric acid)	Sigma-Aldrich	K1750
L-Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4544
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate	Sigma-Aldrich	E5134
Ammonium acetate	Sigma-Aldrich	A1542
Acetonitrile	Fisher Scientific	75-05-8
HPLC grade water	Fisher Scientific	7732-18-5
Oligo clean and concentrator	Zymo Research	D4061
DNAse I	New England Biolabs	M0303S
S1 Nuclease	Thermo Scientific	ENO321
CIAP (Calf intestinal alkaline phosphatase)	New England Biolabs	M0290S
LB Media	Affymetrix	J75852
IPTG	Carbosynth	EI05931
MES [2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate]	Carbosynth	FM37015
Sodium chloride	Fisher Scientific	7647-14-5
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7893
SP Sepharose	Fisher Scientific	45-002-934
2'-Deoxy-5-methylcytidine	TCI	D3610
2'-Deoxy-5-hydroxymethyalcytidine	TCI	D4220
2'-Deoxycytidine-5-carboxylic acid, sodium salt	Berry & Associates	PY 7593
5-Formyl-2'-deoxycytidine	Berry & Associates	PY 7589
2'-Deoxycytidine	Berry & Associates	PY 7216
2'-Deoxyadenosine	Carbosynth	ND04011
2'-Deoxyguanosine	Carbosynth	ND06306
2'-Deoxythymidine	VWR Life Science	97061-764
Gateway technology	Thermo Fisher	11801016
Beckman Allegra X-15R centrifuge	Beckman Coulter	392932
Sonic Dismembrator 550	Fisher Scientific	XL2020
ÄKTA FPLC system	Pharmacia (GE Healthcare)	18116468
FreeZone 4.5 freeze dry system	Labconco	7750020
Zymo Oligo purification columns	Zymo Research	D4061
BDS Hypersil C18 column	Keystone Scientific, INC	105-46-3
3200 Q-Trap mass spectrometer	AB Sciex
HPLC	Shimadzu HPLC
XK16/20 FPLC column	Pharmacia (GE Healthcare)	28988937