Purificazione efficiente e sviluppo di analisi LC-MS/MS-based per dieci-undici traslocazione-2 5-metilcitosina diossigenasi

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per una purificazione efficiente unico passaggio dell'essere umano senza tag attivo dieci-undici traslocazione-2 (TET2) 5-metilcitosina diossigenasi usando la cromatografia a scambio ionico e sua analisi utilizzando una massa liquida di cromatografia-tandem spettrometria (LC-MS/MS)-approccio basato.

Abstract

La regolazione della trascrizione epigenetica mediata da 5-metilcitosina (5mC) ha svolto un ruolo critico nello sviluppo eucariotico. Demetilazione di questi segni epigenetici avviene mediante ossidazione sequenza di dieci-undici traslocazione diossigenasi (TET1-3), seguita dalla riparazione bassa di asportazione glicosilasi-dipendente timina-DNA. Inattivazione del gene TET2 a causa di mutazioni genetiche o da altri meccanismi epigenetici è associato con una prognosi difficile in pazienti con diversi tipi di cancro, specialmente malignità ematopoietiche. Qui, descriviamo una purificazione efficiente singolo passaggio di enzimaticamente attivo dioxygenase di TET2 umana senza tag mediante cromatografia a scambio cationico. Forniamo inoltre un approccio liquido cromatografia-spettrometria di massa (LC-MS/MS) che può separare e quantificare le quattro basi di DNA normale (A, T, G e C), così come le quattro basi modificate citosina (5-metil, 5-idrossimetil, 5-formil e 5-carbossilico). Questa analisi può essere usata per valutare l'attività del wild type e mutanti TET2 diossigenasi.

Introduzione

La posizione di C5 della citosina basi all'interno di dinucleotidi CpG è il sito di metilazione predominante (5mCpG) nel genoma di mammiferi¹. Inoltre, una serie di studi recenti hanno scoperto vasta metilazione della citosina C5 (5mC) in siti non-CpG (5mCpH, dove H = A, T, o C)^2,3. modifica di 5mc serve come un silenziatore trascrizionale retrotrasposoni endogeno e gene promotori^3,4,5. La metilazione del DNA a 5mC inoltre svolge ruoli importanti nell'inattivazione del cromosoma X, gene imprinting, riprogrammazione nucleare e genica tessuto-specifica espressione^5,6,7. La metilazione della citosina nella posizione C5 è svolta da methyltransferases del DNA e le mutazioni in questi enzimi causano difetti inerenti allo sviluppo significativo⁸. La rimozione di segni di 5mC vengono avviate da TET1-3 5mC ossidasi^9,10. Questi diossigenasi TET-famiglia convertono 5mC in 5-idrossimetilcitosina (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) e 5-carboxylcytosine (5caC) di ossidazione sequenziale passaggi^11,12,13. Infine, timina-DNA glicosilasi sostituiscono 5fC o 5caC a citosina non modificato utilizzando riparazione bassa di asportazione percorso¹¹.

Il gene TET2 umano è stato identificato come un gene mutato frequentemente in varie malignità ematopoietiche compreso myelodysplastic (MDS) le sindromi^14,15,16, neoplasie mieloproliferative MDS ( MDS-MPN) e leucemia mieloide acuta (AML) provenienti da MDS e MDS-MPN¹⁶. I livelli di modificazione di 5hmC nel midollo osseo del DNA sono più bassi nei pazienti con mutazioni di TET2 rispetto a quelli con wild type (wt)-TET2¹⁴. Alcuni gruppi hanno sviluppato modelli murini TET2 knock-out per delucidare il suo ruolo nell'ematopoiesi normale e trasformazione mieloide^17,18,19,20. Questi topi con mutazioni del gene TET2 erano inizialmente normale e praticabile, ma manifesta varie malignità ematopoietiche come età causando la loro morte prematura. Questi studi hanno dimostrato il ruolo importante svolto da wt-TET2 nel differenziamento ematopoietico normale. In questi modelli di topo, cellule staminali ematopoietiche eterozigoti (TET2^{+ /-} HSCs) e omozigotica TET2^{- / -} HSCs aveva un vantaggio competitivo rispetto omozigoti wt-TET2 HSCs a ripopolare filiere emopoietiche come entrambi TET2^{+ /-} e TET2^{- / -} HSCs sviluppato varie malignità ematopoietiche^17,18. Questi studi dimostrano che il haploinsufficiency di TET2 diossigenasi altera lo sviluppo di HSCs e risultati nelle malignità ematopoietiche.

Simili ai topi con mutazioni del gene TET2, maggior parte dei pazienti affetti da leucemia manifestano haploinsufficiency di TET2 diossigenasi attività. Queste mutazioni somatiche principalmente eterozigoti comprendono mutazioni frame-shift e sciocchezze dislocate in tutto il corpo del gene TET2 mentre mutazioni missenso che sono la maggior parte dei cluster nel dominio diossigenasi¹². Fin qui, poco caratterizzazione di TET2 wt e mutante è segnalato nella letteratura principalmente a causa di difficoltà con la produzione di TET2 diossigenasi e relativi test²¹. Qui, segnaliamo un semplice singolo passaggio di purificazione del nativo dioxygenase di TET2 mediante cromatografia a scambio ionico. Ulteriormente, un dosaggio quantitativo di LC-MS/MS è stato ottimizzato e utilizzato per misurare l'attività enzimatica di nativo TET2 diossigenasi.

Protocollo

1. clonazione e purificazione di TET2 umana senza tag diossigenasi

1. Clone umano TET2 diossigenasi (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) nel vettore pDEST14 destinazione usando la tecnica di ricombinazione site-specific come descritto in precedenza²².
   Nota: Gli studi precedenti hanno dimostrato che il dominio C-terminale TET2 diossigenasi (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) è il minimo cataliticamente attiva dominio^21,23. Per poter esprimere senza tag TET2 diossigenasi dominio utilizzando il vettore pDONR221, sequenze di Shine Dalgarno e Kozak sono state incorporate nell'iniettore in avanti durante la PCR (tabella 1).
2. Per trasformazione batterica, aggiungere 1 µ l di vettore di espressione pDEST14 ricombinante contenente diossigenasi TET2 umana senza tag (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) a 100 µ l di chimicamente competente e. coli BL21 (DE3) cellule in un tubo di 1,7 mL. Mantenere la miscela sul ghiaccio per almeno 15 minuti, seguita da shock termico a 42 ° C per 30 s in un bagno d'acqua.
   1. Immediatamente dopo la scossa di calore, mantenere le cellule torna sul ghiaccio per minimo di 2 min. In seguito, aggiungere 250 µ l di brodo super ottima con la repressione dei cataboliti (S.O.C media) alle celle. Incubare le cellule batteriche per 1h a 37 ° C in un agitatore.
   2. Dopo l'incubazione, rotazione verso il basso le cellule mediante centrifugazione il tubo a 9.000 x g per 1 min. Discard 70% surnatante pipettando e dissolva la pallina a sinistra sopra la media.
   3. Diffondere la sospensione cellulare su una piastra di agar di brodo (LB) di Luria contenente ampicillina di 100 µ g/mL. Incubare la piastra per 16 h a 37 ° C.
3. Selezionare una colonia isolata e inoculare esso in 10 mL di terreno LB-ampicillina in una provetta da 50 mL. Incubare la provetta a 37 ° C in un agitatore per il pernottamento. In seguito, è possibile utilizzare 100 µ l di cultura dal tubo 50 mL per inoculare 100 mL di terreno LB-ampicillina. Incubare la beuta a 37 ° C in un agitatore a 180 giri/min e usarlo come coltura primaria. Giorno successivo, utilizzare 6 mL ciascuno di coltura primaria per inoculare 15 boccette, ciascuna contenente media mL 600 LB-ampicillina. Ora, Incubare 15 matracci a 37 ° C in un agitatore a 180 giri/min.
   Nota: Per la verifica di cloni trasformati, eseguire la digestione di restrizione o sequenziamento del DNA con il DNA del plasmide isolato.
4. Per controllare la densità di coltura batterica, misurare sua OD₆₀₀ utilizzando uno spettrofotometro. Dopo la cultura raggiunge una densità di 0,8 a OD₆₀₀, indurre l'espressione della proteina TET2 con 300 µ l di 1 M (concentrazione finale di 0,5 mM in 600 mL) IPTG in ciascuna beuta e crescere ulteriormente la cultura per 16 h a 17 ° C.
5. Dopo le 16h, trasferire la coltura batterica a centrifuga bottiglie. Centrifugare la coltura batterica che esprimono l'enzima TET2 a 5.250 x g per 45 min. uso il pellet batterico per TET2 purificazione.
   Nota: Eseguire tutti i passaggi di purificazione della proteina rimanenti sul ghiaccio o a 4 ° C.
6. Risospendere il pellet batterico in 100 mL di 50mm MES (2-(N-morfolino) ethanesulfonic acido) tampone, pH 6 e Sonicare per 5 × 30 s a potenza 20 con intervalli di raffreddamento di 60 s.
7. Spin il lisato a 5.250 x g per 45 min. raccolta il surnatante contenente l'enzima TET2 solubile e passa attraverso 0,45 µm filtri prima di caricarla su un sistema FPLC.
   Nota: In questi esperimenti, l'enzima di TET2 era molto stabile, ma se necessario una proteasi inibitore cocktail contenenti 1 mM benzamidine-HCl, fenilmetilsolfonilfluoruro 1 mM (PMSF) e 0,5 mM 1,10 -o- fenantrolina può essere aggiunto alla cella lysata per prevenire il degrado di TET2 enzima. Evitare di utilizzare EDTA o EGTA nell'inibitore cocktail in quanto questi potrebbero interferire con la cromatografia di scambio cationico seguente.
8. Confezione da 30 mL di una resina a scambio cationico forte in una colonna FPLC. Equilibrare la colonna con 10 volumi di letto di tampone di lavaggio (tampone MES 50 mM, pH 6) presso il tasso di flusso costante di 0,3 mL/min utilizzando un sistema FPLC.
9. Caricare il chiarificato lisato nella colonna pre-equilibrato e lavare con ∼10 il volume del letto del tampone di lavaggio fino a quando il flusso attraverso diventa chiaro.
10. Eluire TET2 usando un 0-100% di pendenza dal tampone di lavaggio per il buffer di eluizione (tampone MES 50 mM, pH 6, NaCl di 1m) in 15 volumi di letto seguita da holding al tampone di eluizione di 100% per i volumi di due letti.
    Nota: Raccogliere campioni (100 µ l) di cella lysata prima e dopo la colonna di carico insieme a tutte le frazioni di eluizione e analizzare il 10% SDS-PAGE di risoluzione.
11. Piscina le frazioni contenenti proteina TET2, congelare asciutto, sciogliere pallet di enzima in 10 mL di acqua e conservare a-80 ° C.

2. 5mC ossidazione di TET2 diossigenasi

1. Eseguire tutte le reazioni di demetilazione in triplice copia con 3 µ g del substrato (25-mer DNA a doppio filamento, tabella 2).
   1. Aggiungere 100 µ g di enzima purificato di TET2 in 50 µ l di tampone di reazione totale contenente 50 mM HEPES (pH 8.0), 200 µM FeSO₄, 2mm 2OG (2-ossoglutarato/α-chetoglutarato) e 2 mM l'ascorbato e incubare a 37 ° C per 1 h²¹.
   2. Placare le reazioni di ossidazione di TET2 catalizzata con 5 µ l di 500 mM EDTA.
2. Dopo tempra reazioni di TET2, preparare i campioni per analisi LC-MS/MS separando il DNA dalla miscela di reazione di TET2 utilizzando colonne di purificazione di oligo.
   1. Aggiungere 100 µ l di tampone di associazione di oligo a 55 µ l di reazione estiguuto.
   2. In seguito, aggiungere 400 µ l di etanolo al 100% per la miscela. Passare questa miscela attraverso una colonna di associazione oligo.
   3. Lavare il DNA associato con 750 µ l di tampone di lavaggio ed eluire in acqua di 20 µ l.
3. Digerire il DNA isolato con 2 unità di dnasi I e 60 unità di nucleasi S1 a 37 ° C per 12 h per produrre singoli nucleosidici-monofosfati.
4. A seguito di digestione, aggiungere 2 unità della fosfatasi alcalina intestinale di vitello (CIAP) nei campioni e incubare per oltre 12 ore a 37 ° C per rimuovere i gruppi fosfato terminale da nucleosidici-monofosfati ottenere nucleosidi.
5. Quantificare tutti i nucleosidi, specialmente modificate cytosines, utilizzando il metodo di LC-MS/MS descritto di seguito.

3. sviluppo di analisi LC-MS/MS-based quantitativa

1. DNA normale basi (adenina, e preparare la soluzione di riserva 100 µM di tutti i nucleosidi modificati citosina [5-metil-2 '-deoxycytidine (5mdC), 5-idrossimetil-2 '-deoxycytidine (5hmdC), 5-formil-2 '-deoxycytidine (5fdC) e 5-carbossi-2 '-deoxycytidine (5cadC)] timina, citosina e guanina) in acqua di grado HPLC per lo sviluppo del metodo LC-MS/MS.
2. Ottimizzare i parametri di MS/MS di nucleosidici-dipendente mediante infusione di soluzioni di riserva, uno alla volta, in uno spettrometro di massa ad una portata di 10 µ l/min a EMS modalità di scansione. Ottimizzare i seguenti parametri: Declustering potenziale (DP), ingresso potenziale (EP), collisione cella ingresso potenziale (CEP), energia di collisione (CE) e collisione cella uscita potenziale (CXP) per ogni utilizzo di analoghi nucleosidici DNA automatizzato ottimizzazione quantitativa funzionalità del software.
3. Ottimizzare i parametri di MS/MS di origine-dipendente da iniettare 10 µ l di soluzione madre utilizzando un gradiente con solvente B al 25% ad una portata di 0,3 mL/min dove solvente A è 10 mM ammonio acetato (pH 4.0) e solvente B è 20% acetonitrile con acetato di ammonio 10 mM (pH 4.0). Ottimizzare i seguenti parametri: tenda Gas (CUR): 10-50, temperatura: 0-600 ° C, Gas Flow 1 (GS1): 0-50, Gas Flow 2 (GS2): 0-50, dissociazione collisioni attivato (CAD): bassa-media-alta, Ion spruzzo tensione (IS): 4000-5500 per ogni nucleosidici DNA facendo uso del manuale funzionalità di ottimizzazione quantitativa del software in modalità FIA (Flow Injection Analysis).
4. Per separare tutti i nucleosidi di DNA otto, eseguire cromatografia liquida utilizzando il seguente gradiente: solvente B 0% (0-2 min), 0-20% di solvente B (2-5 min.), 20-60% di solvente B (5-9 min.), solvente di 60-0% B (9-10 min) e poi equilibrare con solvente A per 5 min ad una portata di 0,3 mL/min su una colonna C18 (dimensione delle particelle: 5 µm, dimensione dei pori: 120 Å).
5. Utilizzando i parametri ottimali di MS/MS (passo 3.2 e 3.3) accoppiati con il gradiente di cromatografia liquida di cui sopra (punto 3.4), determinare la linearità di risposta, limite di rilevabilità (LOD) e limite inferiore di quantificazione (LLOQ) utilizzando un duplice diluizione seriale di una miscela standard di 100 µM contenenti tutti i otto nucleosidi. Disegnare curve standard per tutte le otto nucleosidi di DNA.
6. Rilevare e quantificare tutti i nucleosidi, specialmente modificate cytosines, prodotte nel passaggio 2.4 utilizzando il metodo di LC-MS/MS e curve standard.

Risultati

Modifica dinamica di 5mC nel DNA di diossigenasi TET-famiglia svolge i ruoli importanti nel regolamento trascrizionale epigenetica. Dioxygenase di TET2 è frequentemente mutato in varie malignità ematopoietiche¹². Per studiare il ruolo dell'enzima TET2 nello sviluppo normale e nella malattia, abbiamo clonato il suo dominio cataliticamente attivo minimo senza qualsiasi tag di affinità nel vettore pDEST14²². Il dioxygenase di TET2 senza tag ...

Discussione

Mutazioni nel gene TET2 sono alcuni dei cambiamenti genetici più frequentemente rilevati in pazienti con malignità ematopoietiche diversificata. Ad oggi centinaia di diverse mutazioni di TET2, sono sciocchezze, frame-shift e mutazioni di senso sbagliato, sono state identificate in pazienti¹². Pazienti con mutazioni di TET2 mostrano bassi livelli di genomica 5hmC nel midollo osseo rispetto a quelli con wt-TET2¹⁴. TET2 mutante knock-in esperimenti hanno ri...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEPES	Carbosynth	FH31182
Iron(II) sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	F8633
α-Ketoglutaric acid (2-Oxoglutaric acid)	Sigma-Aldrich	K1750
L-Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4544
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate	Sigma-Aldrich	E5134
Ammonium acetate	Sigma-Aldrich	A1542
Acetonitrile	Fisher Scientific	75-05-8
HPLC grade water	Fisher Scientific	7732-18-5
Oligo clean and concentrator	Zymo Research	D4061
DNAse I	New England Biolabs	M0303S
S1 Nuclease	Thermo Scientific	ENO321
CIAP (Calf intestinal alkaline phosphatase)	New England Biolabs	M0290S
LB Media	Affymetrix	J75852
IPTG	Carbosynth	EI05931
MES [2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate]	Carbosynth	FM37015
Sodium chloride	Fisher Scientific	7647-14-5
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7893
SP Sepharose	Fisher Scientific	45-002-934
2'-Deoxy-5-methylcytidine	TCI	D3610
2'-Deoxy-5-hydroxymethyalcytidine	TCI	D4220
2'-Deoxycytidine-5-carboxylic acid, sodium salt	Berry & Associates	PY 7593
5-Formyl-2'-deoxycytidine	Berry & Associates	PY 7589
2'-Deoxycytidine	Berry & Associates	PY 7216
2'-Deoxyadenosine	Carbosynth	ND04011
2'-Deoxyguanosine	Carbosynth	ND06306
2'-Deoxythymidine	VWR Life Science	97061-764
Gateway technology	Thermo Fisher	11801016
Beckman Allegra X-15R centrifuge	Beckman Coulter	392932
Sonic Dismembrator 550	Fisher Scientific	XL2020
ÄKTA FPLC system	Pharmacia (GE Healthcare)	18116468
FreeZone 4.5 freeze dry system	Labconco	7750020
Zymo Oligo purification columns	Zymo Research	D4061
BDS Hypersil C18 column	Keystone Scientific, INC	105-46-3
3200 Q-Trap mass spectrometer	AB Sciex
HPLC	Shimadzu HPLC
XK16/20 FPLC column	Pharmacia (GE Healthcare)	28988937