효율적인 정화와 10-11 전-2 5-Methylcytosine Dioxygenase에 대 한 LC-MS/MS 기반 분석 결과 개발

요약

여기, 우리는 활성 태그 인간의 효율적인 단일 단계 정화에 대 한 프로토콜 10-11 전 2 (TET2) 제시 5-methylcytosine dioxygenase 이온-교환 크로마토그래피와 액체 크로마토그래피 탠덤 질량을 사용 하 여 그 분석 결과 사용 하 여 분석 (LC-MS/MS)-기반 접근.

초록

5-methylcytosine (5mC)에 의해 중재 후 전사 조절 핵 개발에 중요 한 역할을 담당해 왔습니다. 이 후 성적인 표의 demethylation thymine DNA glycosylase 종속 기본 절단 복구 뒤 10-11 전 dioxygenases (TET1-3)에 의해 계속적인 산화에 의해 수행 됩니다. 유전 돌연변이 또는 다른 후 성적인 기계 장치에 의해 TET2 유전자의 비활성화 다양 한 암, 특히 조 혈 악성 종양을 가진 환자에 있는 빈약한 예 지와 연결 됩니다. 여기, 양이온 교환 크로마토그래피를 사용 하 여 태그 한 인간 효소 활성 TET2 dioxygenase의 효율적인 단일 단계 정화를 설명 합니다. 우리는 더 분리 하 고 4 개의 수정된 시 토 신 기초 (5-메 틸, 5-hydroxymethyl 일까 지, 5 formyl 그리고 5-carboxyl) 뿐만 아니라 (A, T, G와 C), 4 개의 정상적인 DNA 기초를 정할 수 있는 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석 (LC-MS/MS) 접근을 제공 합니다. 이 분석 결과 야생 유형 및 돌연변이 TET2 dioxygenases의 활동을 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다.

서문

CpG 디 내에서 시 토 신 기지의 C5 위치는 포유류 유전자¹에 주된 메 틸 화 사이트 (5mCpG)입니다. 또한, 최근 연구 된 광범위 한 C5 시 토 신 메 틸 화 (5mC) 비 CpG 사이트에서 발견 (5mCpH, 어디 H = A, T, 또는 C)^2,3. 5mC 수정 생 retrotransposons 및 유전자 발기인^3,,45에 transcriptional 소음 기 역할을 합니다. 5mC에서 DNA 메 틸 화는 또한 X 염색체 비활성화, 유전자 각 인, 핵 프로그래밍 및 조직 관련 유전자 식^5,,67에 중요 한 역할을 재생합니다. C5 위치에서 시 토 신 메 틸 화 DNA methyltransferases에 의해 수행 됩니다 그리고이 효소에 돌연변이 발생할 상당한 발달 결함⁸. 5mC 표시의 제거는 TET1 3 5mC oxidases^9,10에서 시작 됩니다. 이러한 TET 가족 dioxygenases 변환 5mC 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5 fC)와 5-carboxylcytosine (5caC) 순차 산화 단계^11,,1213. 마지막으로, thymine DNA glycosylase 5 fC 또는 기본 절단 복구 통로¹¹를 사용 하 여 수정 되지 않은 시 토 신을 5caC 대체 합니다.

인간 TET2 유전자 형성 증후군 (MDS)^14,,1516, MDS myeloproliferative 신생 (를 포함 하 여 다양 한 조 혈 악성 종양에서 자주 돌연변이 유전자로 확인 됐다 MDS-MPN), 및 MDS와 MDS MPN¹⁶에서 발생 하는 급성 골수성 백혈병 (AML). 5hmC 수정 골 DNA에서에서의 레벨은 야생 타입 (wt)와 그에 비해 TET2 돌연변이와 환자에서 더 낮은-TET2¹⁴. 그룹 수 일반 조 및 골수성 변환^17,18,,1920에서 역할을 명료 하 게 TET2 녹아웃 마우스 모델을 개발 했습니다. TET2 유전자에 있는 돌연변이와이 쥐 되었고 처음 정상 가능한, 하지만 그들은 그들의 이른 죽음을 일으키는 노인으로 다양 한 조 혈 악성을 각 성. 이러한 연구는 정상적인 조 혈 차별화에서 wt-TET2에 의해 재생 중요 한 역할을 보여주었다. 이 마우스 모델, heterozygous 조 혈 줄기 세포 (TET2⁺ HSCs) 및에서 homozygous TET2^-/- HSCs homozygous wt-TET2 HSCs 두 TET2⁺ 로 조 혈 계보를 다시 채우기에 비해 경쟁 우위를 했다 그리고 TET2^-/- HSCs 개발 다양 한 조 혈 악성 종양^17,18. 이러한 연구는 haploinsufficiency TET2 dioxygenase HSCs의 개발을 변경 하 고 조 혈 악성의 보여 줍니다.

TET2 유전자에 있는 돌연변이와 마우스와 마찬가지로, 대부분의 백혈병 환자 haploinsufficiency TET2 dioxygenase 활동의 명단. 이 주로 heterozygous 체세포 돌연변이 포함 가장 missense 돌연변이 동안 TET2 유전자 신체에 걸쳐 분산 프레임 시프트와 넌센스 돌연변이 dioxygenase 도메인¹²클러스터. 날짜 하려면, 작은 특성의 wt 및 돌연변이 TET2 TET2 dioxygenase 및 그것의 분석 결과²¹의 생산 어려움 때문에 주로 문학에 보고 됩니다. 여기, 우리는 이온 교환 크로마토그래피를 사용 하 여 네이티브 TET2 dioxygenase의 간단한 단일 단계 정화를 보고 합니다. 또한, 양적 LC-MS/MS 분석 결과 최적화 되었고 네이티브 TET2 dioxygenase의 효소 활동을 측정 하는 데 사용.

프로토콜

1. 복제 및 태그 인간 TET2 Dioxygenase의 정화

1. 앞에서 설명한²²으로 사이트별 재조합 기술을 사용 하 여 pDEST14 대상 벡터에 인간 TET2 dioxygenase (TET2 1129-1936 년, Δ1481-1843) 복제.
   참고: 이전 연구 C 터미널 TET2 dioxygenase (TET2 1129-1936 년, Δ1481-1843) 도메인은 최소한의 촉매로 활성 도메인^21,23증명 하고있다. PDONR221 벡터를 사용 하 여 태그 TET2 dioxygenase 도메인을 표현 하기 위하여 빛나는 Dalgarno 및 Kozak 시퀀스는 PCR (표 1) 중 앞으로 뇌관에 통합 했다.
2. 세균성 변환에 대 한 추가 태그가 인간 TET2 dioxygenase (TET2 1129-1936 년, Δ1481-1843)의 화학적으로 유능한 대장균 100 µ L 포함 하는 재조합 pDEST14 식 벡터의 1 µ L BL21 (DE3) 셀 1.7 mL 튜브에. 30 42 ° C에서 열 충격 이어서 적어도 15 분 동안 얼음에 혼합물을 계속 물 욕조에 s.
   1. 열 충격 후 즉시 다시 최소 2 분의 얼음에 셀을 계속. 이것 다음, 셀에 catabolite 억압 (S.O.C 미디어) 슈퍼 최적의 국물의 250 µ L를 추가 합니다. 통에 37 ° C에서 1 시간에 대 한 세균 세포를 품 어.
   2. 부 화, 후 pipetting으로 1 분 취소 70% 상쾌한 9000 x g에서 튜브 centrifuging 여 셀 아래로 회전 하 고 미디어를 통해 왼쪽에 펠 릿을 녹.
   3. Luria 국물 (파운드) 한 천 배지 100 µ g/mL 암 피 실린 포함 하에 세포 현 탁 액을 확산. 16 h 37 ° c.에 대 한 접시를 품 어
3. 하나의 고립 된 식민지를 선택 하 고 50 mL 튜브에 파운드-암 피 실린 미디어의 10 mL에 접종. 하룻밤을 위해 통에 37 ° C에서 튜브를 품 어. 이 어 50 mL 튜브에서 문화의 100 µ L를 사용 하 여 미디어 파운드-암 피 실린의 100 mL를 접종 하. 기본 문화권으로 사용 하 여 180 rpm에서 통에 37 ° C에서 플라스 크를 품 어. 다음 날, 주 문화의 각 6 mL를 사용 하 여 접종 15 플라스 크, 각 포함 600 mL 파운드-암 피 실린 미디어. 자, 180 rpm에서 통에 37 ° C에서 15 플라스 크를 품 어.
   참고: 변환 된 클론을 확인에 대 한 격리 된 플라스 미드 DNA와 DNA 시퀀싱 또는 제한 소화를 수행 합니다.
4. 세균성 문화의 밀도 확인 하는 분 광 광도 계를 사용 하 여 그것의 OD₆₀₀ 을 측정 합니다. 문화에는 OD₆₀₀에서 0.8의 밀도 도달 하면, 각 플라스 크에 1 M (600 mL에 0.5 m m의 최종 농도) IPTG의 300 µ L와 TET2 단백질의 표현을 유도 하 고 16 h 17 ° c.에 대 한 문화를 더욱 성장
5. 16 h 후 원심 분리기 병 세균성 문화를 전송 합니다. 원심 45 분 사용에 대 한 5250 x g에 TET2 효소를 표현 하는 세균성 문화 TET2 정화에 대 한 세균 펠 릿.
   얼음 또는 4 ° c.에 모든 나머지 단백질 정화 단계를 수행 하는 참고:
6. 50mm MES의 100 mL에서 세균 펠 릿 resuspend (2-(N-morpholino) ethanesulfonic 산) 버퍼, pH 6 및 전력 20 60 s 냉각 간격에서 5 × 30 s sonicate.
7. 회전 45 분에 대 한 5250 x g에서 lysate 수용 성 TET2 효소를 포함 하는 상쾌한을 수집 하 고 0.45 μ m 통과 FPLC 시스템에 로드 하기 전에 필터링 합니다.
   참고:이 실험에서 TET2 효소 매우 안정 하지만 필요한 프로 테아 제 억제 물 칵테일 포함 1 mM benzamidine-HCl, 1 mM phenylmethylsulphonyl 불 (PMSF), 그리고 0.5 m m 1,10-o-phenanthroline lysate를 셀에 추가할 수 있습니다. TET2 효소의 저하를 방지 합니다. 로이 다음 양이온 교환 크로마토그래피를 방해할 수 있습니다 칵테일 억제제에 EDTA 또는 EGTA를 사용 하지 마십시오.
8. FPLC 열에 강한 양이온 교환 수 지의 30 mL 팩. 10 침대 양의 워시 버퍼 (50mm MES 버퍼, pH 6) 0.3 mL/min FPLC 시스템을 사용 하 여 일정 한 유량으로 열 equilibrate
9. 로드는 명확히 미리 equilibrated 열에 ∼10 침대 양의 워시 버퍼를 통해 흐름 취소 될 때까지 세척 lysate.
10. TET2 elute 0-100을 사용 하 여 15 침대 볼륨에서 차입 버퍼 (50mm MES 버퍼, pH 6, 1 M NaCl) 워시 버퍼에서 그라데이션 % 다음 2 침대 볼륨 100% 차입 버퍼에서 개최.
    참고: 셀 열 모든 차입 분수와 함께 로드 전후 lysate의 샘플 (100 µ L 각)를 수집 하 고 10 %SDS-PAGE 해결에 분석.
11. 포함 하는 TET2 단백질 분수 풀, 동결 건조, 분해 효소 팔레트 10 mL 물에-80 ° c.에 게

2. TET2 Dioxygenase에 의해 5mC 산화

1. 3 µ g (25-메 르 이중 좌초 DNA, 표 2) 기판의와 3 중에서 모든 demethylation 반응을 수행 합니다.
   1. 순화 TET2 효소의 100 µ g 50 mM HEPES (pH 8.0), 200 µ M FeSO₄, 2mm 2OG 포함 하는 전체 반응 버퍼의 50 µ L에 추가 (2-oxoglutarate/α-ketoglutarate), 그리고 2 mM 하는데 1 h²¹37 ° C에서 품 어와.
   2. 500 mM EDTA의 5 µ L와 TET2 촉매 산화 반응을 끄다.
2. TET2 반응, 냉각 후 올리고 정화 열을 사용 하 여 TET2 반응 혼합물에서 DNA를 분리 하 여 LC-MS/MS 분석에 대 한 샘플을 준비 합니다.
   1. 침묵과 반응의 55 µ L를 올리고 바인딩 버퍼의 100 µ L를 추가 합니다.
   2. 이 따라 400 µ L 100% 에탄올의 혼합물에 추가 합니다. 이 혼합 올리고 바인딩 열을 통해 전달 합니다.
   3. 750 µ L 워시 버퍼와 바운드 DNA를 세척 하 고 20 µ L 물에 elute.
3. 소화 DNase의 2 대와 고립 된 DNA 나 고 S1 nuclease 12 h 37 ° C에서 60 단위 개별 nucleoside monophosphates를 생산 하.
4. 소화, 다음 샘플에서 종 아리 장 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (CIAP)의 2 대를 추가 하 고 또한 nucleosides를 nucleoside monophosphates에서 터미널 인산 염 그룹을 제거 하려면 37 ° C에 12 h에 대 한 품 어.
5. 모든 nucleosides, 아래에 설명 된 LC-MS/MS 방법을 사용 하 여 특히 수정 된 cytosines 계량.

3. 양적 LC-MS/MS 기반 분석 결과 개발

1. [5-메 틸-2-deoxycytidine (5mdC), 5-hydroxymethyl-2-deoxycytidine (5hmdC), 5-formyl-2-deoxycytidine (5fdC), 및 5-카-2-deoxycytidine (5cadC)] 모든 수정된 시 토 신 nucleosides의 100 µ M 재고 솔루션을 준비 하 고 정상적인 DNA 기초 (아데닌, thymine, 구 아닌, 시 토 신) LC-MS/MS 방법의 개발을 위한 HPLC 급 물.
2. 재고 솔루션을 한 번에 하나씩 일으키는 nucleoside 종속 MS/MS 매개 변수 최적화, EMS에 10 µ L/min 흐름 속도에 질량 분석기에서 스캔 모드. 다음 매개 변수 최적화: 양적 최적화 자동 각 DNA nucleoside 사용에 대 한 잠재적인 (DP), 입구 잠재력 (EP), 충돌 셀 입구 잠재적인 (CEP), 충돌 에너지 (CE), 및 충돌 셀 출구 잠재적인 (CXP) Declustering 소프트웨어의 기능입니다.
3. 25% 용 매 B 용 매 A는 10 m m 염화 아세테이트 (pH 4.0) 및 용 매 B는 10 m m 염화 아세테이트 (pH 4.0)와 20% 이기 0.3 mL/min의 유량과 그라디언트를 사용 하 여 재고 솔루션의 주입 10 µ L 여 소스 종속 MS/MS 매개 변수를 최적화 합니다. 다음 매개 변수 최적화: 커튼 가스 (CUR): 10-50, 온도: 0-600 ° C, 가스 흐름 1 (GS1): 0-50, 가스 흐름 2 (GS2): 0-50, Collisionally 활성화 분리 (CAD): 낮은-중간-높은, 이온 스프레이 전압 (IS): 4000-5500 설명서를 사용 하 여 각 DNA nucleoside에 대 한 FIA (흐름 주입 분석) 모드에서 소프트웨어의 양적 최적화 기능.
4. 모든 8 개의 DNA nucleosides, 별도로 수행 다음 그라디언트를 사용 하 여 액체 착 색 인쇄기: 0% 용 매 B (0-2 분), 0-20% 용 매 B (2-5 분), 20-60% 용 매 B (5-9 분), 60-0% 용 매 B (9-10 분)와 다음 0.3의 흐름 율에 5 분에 대 한 용 매 A와 equilibrate C18 열에 mL/min (입자 크기: 5 µ m, 기 공 크기: 120 Å).
5. 위에서 언급 한 액체 크로마토그래피 그라데이션 (단계 3.4)와 결합 하 여 최적의 MS/MS 매개 (3.2 및 3.3 단계)를 사용 하 여 확인 응답 선형성, 탐지 (LOD)의 제한 및 정량화 (LLOQ)를 사용 하 여 낮은 두 배 모두 8 개의 nucleosides를 포함 하는 100 µ M 표준 혼합 직렬 희석 모든 8 개의 DNA nucleosides에 대 한 표준 곡선을 그립니다.
6. 검색 및 모든 nucleosides, 특히 수정 된 cytosines 단계 2.4 LC-MS/MS 방법 및 표준 곡선을 사용 하 여에서 생산 계량.

결과

TET 가족 dioxygenases에 의해 DNA에 5mC의 동적 수정 epigenetic transcriptional 규칙에 중요 한 역할을 담당합니다. TET2 dioxygenase는 다양 한 조 혈 악성 종양¹²자주 변경 됩니다. 일반 개발 및 질병 TET2 효소의 역할을 조사, 우리 pDEST14 벡터²²에 어떤 선호도 태그를 하지 않고 최소한의 촉매로 활성 도메인을 복제 있다. 태그 TET2 dioxygenase 총 수용 성 단백...

토론

TET2 유전자에 있는 돌연변이 다양 한 조 혈 악성 종양 환자에서 가장 많이 검색 된 유전자 변화입니다. 말도, 프레임 이동 및 missense 돌연변이 포함 하는 다른 TET2 돌연변이의 수백까지 환자¹²에서 확인 되었습니다. TET2 돌연변이 가진 환자 wt-TET2¹⁴와 그에 비해 골에서 게놈 5hmC의 낮은 레벨을 표시 합니다. 실험 노크에서 돌연변이 TET2 transfected 세포

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEPES	Carbosynth	FH31182
Iron(II) sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	F8633
α-Ketoglutaric acid (2-Oxoglutaric acid)	Sigma-Aldrich	K1750
L-Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4544
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate	Sigma-Aldrich	E5134
Ammonium acetate	Sigma-Aldrich	A1542
Acetonitrile	Fisher Scientific	75-05-8
HPLC grade water	Fisher Scientific	7732-18-5
Oligo clean and concentrator	Zymo Research	D4061
DNAse I	New England Biolabs	M0303S
S1 Nuclease	Thermo Scientific	ENO321
CIAP (Calf intestinal alkaline phosphatase)	New England Biolabs	M0290S
LB Media	Affymetrix	J75852
IPTG	Carbosynth	EI05931
MES [2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate]	Carbosynth	FM37015
Sodium chloride	Fisher Scientific	7647-14-5
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7893
SP Sepharose	Fisher Scientific	45-002-934
2'-Deoxy-5-methylcytidine	TCI	D3610
2'-Deoxy-5-hydroxymethyalcytidine	TCI	D4220
2'-Deoxycytidine-5-carboxylic acid, sodium salt	Berry & Associates	PY 7593
5-Formyl-2'-deoxycytidine	Berry & Associates	PY 7589
2'-Deoxycytidine	Berry & Associates	PY 7216
2'-Deoxyadenosine	Carbosynth	ND04011
2'-Deoxyguanosine	Carbosynth	ND06306
2'-Deoxythymidine	VWR Life Science	97061-764
Gateway technology	Thermo Fisher	11801016
Beckman Allegra X-15R centrifuge	Beckman Coulter	392932
Sonic Dismembrator 550	Fisher Scientific	XL2020
ÄKTA FPLC system	Pharmacia (GE Healthcare)	18116468
FreeZone 4.5 freeze dry system	Labconco	7750020
Zymo Oligo purification columns	Zymo Research	D4061
BDS Hypersil C18 column	Keystone Scientific, INC	105-46-3
3200 Q-Trap mass spectrometer	AB Sciex
HPLC	Shimadzu HPLC
XK16/20 FPLC column	Pharmacia (GE Healthcare)	28988937