Purificação eficiente e desenvolvimento de ensaio baseado no LC-MS/MS para dez-onze translocação-2 5-metilcitosina dioxigenase

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para uma purificação eficiente passo a passo do ativo humano sem marcas de formatação a translocação de 10-11-2 (TET2) 5-metilcitosina dioxigenase usando cromatografia de permuta iónica e seu ensaio usando uma massa em tandem-cromatografia líquida espectrometria (LC-MS/MS)-com base em abordagem.

Resumo

O Regulamento epigenéticas transcrição mediado por 5-metilcitosina (5mC) tem desempenhado um papel crítico no desenvolvimento de eucariota. Desmetilação destas marcas epigenéticas é realizada pela oxidação sequencial por dez-onze translocação dioxygenases (TET1-3), seguida-se o reparo de excisão de base glycosylase-dependente de timina-DNA. Inativação do gene TET2 devido a mutações genéticas ou por outros mecanismos epigenéticos está associada um mau prognóstico em pacientes com diversos tipos de câncer, especialmente malignidades hematopoiéticas. Aqui, descrevemos uma purificação eficiente passo a passo de dioxigenase TET2 enzimaticamente ativo não marcado humano usando a cromatografia de permuta catiónica. Nós fornecemos mais uma abordagem de líquido espectrometria de massa em tandem-cromatografia (LC-MS/MS) que pode separar e quantificar as quatro bases de DNA normais (A, T, G e C), bem como as quatro bases citosina modificado (5-metil, 5-hidroximetil, formil-5 e 5-carboxila). Este ensaio pode ser usado para avaliar a atividade de tipo selvagem e mutante TET2 dioxygenases.

Introdução

A posição de C5 de bases citosina dentro dinucleotídeos CpG é o site de metilação predominante (5mCpG) em genomas de mamíferos¹. Além disso, uma série de estudos recentes revelaram extensa C5 methylation do cytosine (5mC) em sites não-CpG (5mCpH, onde H = A, T, ou C)^2,3. modificação de 5mC serve como um silenciador transcriptional em retrotransposons endógena e gene promotores^3,4,5. Metilação do DNA no 5mC também tem um papel importante na inactivação do cromossoma X, impressão de gene, reprogramação nuclear e expressão de genes tecido-específica a^5,6,7. Metilação de citosina na posição C5 é efectuada pelas metiltransferases do DNA e mutações nestas enzimas causam defeitos significativos do desenvolvimento⁸. A remoção de marcas de 5mC são iniciadas por TET1-3 5mC oxidases^9,10. Estes dioxygenases TET-família converter 5mC em 5-Hidroximetilcitosina (5hmC), 5-formylcytosine (5-fC) e 5-carboxylcytosine (5caC) por oxidação sequencial passos^11,12,13. Finalmente, a timina-DNA glycosylase substitui 5fC ou 5caC de citosina não modificada usando o reparo de excisão de base via¹¹.

O gene humano que TET2 foi identificado como um gene frequentemente mutado em diversas malignidades hematopoiéticas incluindo mielodisplásica síndromes (MDS)^14,15,16, MDS-mieloproliferativa (Neoplasias MDS-MPN) e a leucemia mieloide aguda (LMA) provenientes de MDS e MDS-MPN¹⁶. Os níveis de 5hmC modificação na medula óssea DNA são mais baixos em pacientes com mutações TET2 em comparação com aqueles com tipo selvagem (wt)-TET2¹⁴. Um número de grupos desenvolveram modelos de rato TET2-nocaute para elucidar seu papel na hematopoiese normal e transformação mieloide^17,18,19,20. Estes ratos com mutações no gene TET2 foram inicialmente normal e viável, mas se manifesta diversas malignidades hematopoiéticas, medida que envelheciam, causando sua morte precoce. Estes estudos mostraram o importante papel desempenhado pelo wt-TET2 na diferenciação hematopoiética normal. Estes modelos de rato, heterozigotos as células-tronco hematopoiéticas (TET2^{+ /-} linfócitos) e homozigotos TET2^{- / -} linfócitos tinham uma vantagem competitiva sobre linfócitos homozigotos wt-TET2 no repovoamento linhagens hematopoiéticas como ambos TET2^{+ /-} e TET2^{- / -} linfócitos desenvolveu diversas malignidades hematopoiéticas^17,18. Estes estudos demonstram essa haploinsuficiência do TET2 dioxigenase altera o desenvolvimento dos linfócitos e resulta em malignidades hematopoiéticas.

Semelhante a camundongos com mutações no gene TET2, a maioria dos pacientes de leucemia manifesto haploinsuficiência TET2 dioxigenase atividade. Estas mutações somáticas principalmente heterozigotas incluem mutações quadro-shift e absurdo, dispersadas por todo o corpo de gene TET2 enquanto mutações missense que são mais agrupado no domínio dioxigenase¹². Até à data, pouco caracterização de wt - e mutante-TET2 é relatada na literatura principalmente devido às dificuldades com a produção de dioxigenase TET2 e seu ensaio²¹. Aqui, nós relatamos uma simples purificação de etapa única de nativo TET2 dioxigenase usando cromatografia de troca iónica. Além disso, um ensaio quantitativo de LC-MS/MS foi otimizado e usado para medir a atividade enzimática de nativo TET2 dioxigenase.

Protocolo

1. clonagem e purificação de dioxigenase TET2 humana sem marcas de formatação

1. Clonagem humana TET2 dioxigenase (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) para o vetor de destino de pDEST14 usando a técnica de recombinação site-specific como descrito anteriormente,²².
   Nota: Estudos anteriores demonstraram que o domínio C-terminal TET2 dioxigenase (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) é o mínimo domínio cataliticamente ativo^21,23. Para expressar o domínio de dioxigenase TET2 não marcado usando o vetor de pDONR221, Shine Dalgarno e Kozak sequências foram incorporadas no primer para a frente durante PCR (tabela 1).
2. Para a transformação bacteriana, adicionar 1 µ l de vetor de expressão pDEST14 recombinante contendo formatação humana TET2 dioxigenase (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) para 100 µ l de quimicamente competentes de Escherichia coli BL21 (DE3) células em um tubo de 1,7 mL. Manter a mistura no gelo pelo menos 15 minutos, seguido de choque térmico a 42 ° C por 30 s num banho de água.
   1. Imediatamente após o choque térmico, manter as células no gelo por período mínimo de 2 min. Em seguida, adicione 250 µ l de caldo super ideal com repressão catabolite (S.O.C mídia) às células. Incube as células bacterianas para 1 h a 37 ° C em uma coqueteleira.
   2. Após a incubação, spin para baixo as células por centrifugação do tubo a 9.000 x g por 1 min. Discard 70% sobrenadante pipetando e dissolva a pelota na esquerda sobre meios de comunicação.
   3. Espalhe a suspensão de células numa placa de ágar Luria caldo (LB) contendo 100 ampicilina µ g/mL. Incubar a placa para 16 h a 37 ° C.
3. Selecione uma colônia isolada e inoculá-lo em 10 mL de mídia LB-ampicilina em um tubo de 50 mL. Incube o tubo a 37 ° C em uma coqueteleira para pernoite. Em seguida, use 100 µ l de cultura do tubo de 50 mL para inocular 100ml de mídia LB-ampicilina. Incubar o frasco a 37 ° C, um agitador a 180 rpm e usá-lo como cultura primária. No dia seguinte, use 6 mL cada de principal cultura para inocular 15 frascos, cada contendo mídia 600ml LB-ampicilina. Agora, Incube 15 frascos a 37 ° C, um agitador a 180 rpm.
   Nota: Para verificar clones transformados, realize digestão de sequenciamento ou restrição de DNA com o ADN do plasmídeo isolado.
4. Para verificar a densidade de cultura bacteriana, medir sua OD₆₀₀ usando um espectrofotômetro. Depois que a cultura atinge uma densidade de 0,8 em OD₆₀₀, induzir a expressão da proteína de TET2 com 300 µ l de 1 M (concentração final de 0,5 mM de 600ml) IPTG em cada balão e crescer ainda mais a cultura para 16 h a 17 ° C.
5. Após 16 h, transferi a cultura bacteriana para garrafas de centrífuga. Centrifugar a cultura bacteriana, expressando a enzima TET2 a 5.250 x g durante 45 min. uso a pelota bacteriana para a purificação de TET2.
   Nota: Executar todas as etapas de purificação de proteínas restantes no gelo ou a 4 ° C.
6. Resuspenda o pellet bacteriano em 100 mL de MES de 50 mM (2-(N-Morpholinos) ácido etanesulfónico) buffer, pH 6 e proceda à sonicação por 5 × 30 s, a potência 20 com 60 intervalos de resfriamento s.
7. Girar o lisado a 5.250 x g durante 45 min. recolher o sobrenadante contendo a enzima TET2 solúvel e passa por 0,45 µm filtros antes de carregar um sistema FPLC.
   Nota: Nestas experiências, a enzima TET2 era muito estável, mas se for necessário um protease inibidor cocktail contendo 1 mM benzamidina-HCl, fluoreto de fenilmetilsulfonil de 1 mM (PMSF) e 0,5 mM 1,10 -o- fenantrolina podem ser adicionado à célula de lisado de prevenir a degradação da enzima TET2. Evite usar EDTA ou EGTA o inibidor cocktail como estes podem interferir com a cromatografia de permuta catiónica a seguir.
8. Juntar 30 mL de uma resina de troca de cátion forte em uma coluna FPLC. Equilibrar a coluna com 10 volumes de cama de tampão de lavagem (tampão MES de 50 mM, pH 6) à taxa de fluxo constante de 0,3 mL/min, usando um sistema FPLC.
9. Carregar o esclareceu lisado na coluna pre-equilibrada e lavagem com volumes de cama ∼10 de tampão de lavagem até que o fluxo através de torna-se claro.
10. Eluir TET2 usando um 0-100% gradiente do tampão de lavagem para o buffer de eluição (tampão MES de 50 mM, pH 6, 1 M NaCl), em 15 volumes de cama seguido de exploração no tampão de eluição de 100% para volumes de duas camas.
    Nota: Coletar amostras (100 µ l cada) de célula lisada antes e depois da coluna carregando juntamente com todas as frações de eluição e analisar em 10%, solução de SDS-PAGE.
11. As frações que contêm a proteína TET2 do pool, congelar-seco, dissolver pálete de enzima em 10 mL de água e loja a-80 ° C.

2. 5mC oxidação por TET2 dioxigenase

1. Execute todas as reações de desmetilação em triplicado com 3 µ g de substrato (25-mer ADN encalhado dobro, tabela 2).
   1. Adicione 100 µ g de enzima purificada de TET2 em 50 µ l de tampão de reação total contendo 50 mM HEPES (pH 8.0), 200 µM Filipa₄, 2mm 2OG (2-do oxoglutarate/α-cetoglutarato) e ascorbato de 2mm e incubar a 37 ° C, durante 1 h²¹.
   2. Saciar TET2 catalisada por reações de oxidação com 5 µ l de 500 mM de EDTA.
2. Após têmpera TET2 reações, prepare amostras para análise de LC-MS/MS, separando o DNA da mistura de reação TET2 usando colunas de purificação oligo.
   1. Adicione 100 µ l de tampão de ligação oligo a 55 µ l de reação extinta.
   2. Em seguida, adicione 400 µ l de etanol 100% à mistura. Passe esta mistura por meio de uma coluna de ligação de oligo.
   3. Lave o DNA acoplado com tampão de lavagem 750 µ l e eluir em 20 água µ l.
3. Digerir o DNA isolado com 2 unidades de DNase eu e 60 unidades de nuclease S1 a 37 ° C, durante 12 h para produzir nucleosídeo-monophosphates individual.
4. Após digestão, acrescente 2 unidades de bezerro intestinal da fosfatase alcalina (CIAP) nas amostras e incube por adição de 12 h a 37 ° C para remover os grupos fosfato terminal do nucleoside-monophosphates para obter nucleosídeos.
5. Quantificar todos os nucleosídeos, especialmente modificados metiladas, usando o método de LC-MS/MS descrito abaixo.

3. desenvolvimento de ensaio quantitativo de LC-MS/MS-baseado

1. Preparar a solução estoque de 100 µM de todos os nucleosídeos modificados citosina [5-metil-2 '-deoxycytidine (5mdC), 5-hidroximetil-2 '-deoxycytidine (5hmdC), 5-formil-2 '-deoxycytidine (5fdC) e 5-carboxi-2 '-deoxycytidine (5cadC)] e DNA normal bases (adenina, timina, citosina e guanina) em água de qualidade para HPLC para o desenvolvimento do método LC-MS/MS.
2. Otimizar parâmetros de MS/MS nucleosídeo dependentes através da infusão de soluções estoque, um de cada vez, no espectrômetro de massa a uma taxa de fluxo de 10 µ l/min em EMS modo scan. Otimizar seguindo parâmetros: Declustering potencial (DP), entrada potencial (EP), colisão célula entrada potencial (CEP), energia de colisão (CE) e colisão célula saída potencial (CXP) para cada nucleosídeo de DNA usando automatizada otimização quantitativa característica do software.
3. Otimize parâmetros de MS/MS fonte dependente por injectar 10 µ l de solução-mãe usando um gradiente com 25% de solvente B em uma taxa de fluxo de 0,3 mL/min, onde solvente A é acetato de amônio 10 mM (pH 4.0) e solvente B é 20% acetonitrila com acetato de amônio 10 mM (pH 4.0). Otimizar seguindo parâmetros: cortina de gás (CUR): 10-50, temperatura: 0-600 ° C, 1 fluxo do gás (GS1): 0-50, 2 de fluxo de gás (GS2): 0-50, Collisionally ativado dissociação (CAD): baixa-média-alta, íon pulverizar tensão (IS): 4000-5500 para cada nucleosídeo do ADN usando manual recurso de otimização quantitativa do software no modo FIA (análise de injeção de fluxo).
4. Para separar todas as oito nucleosídeos de DNA, realizar cromatografia líquida, usando o seguinte gradiente: 0% solvente B (0-2 min), 0-20% de solvente B (2-5 min), 20-60% solvente B (5-9 min), solvente de 0-60% B (9-10 min) e então equilibrar com solvente A por 5 min com um caudal de 0.3 mL/min em uma coluna C18 (tamanho de partícula: 5 µm, Pore tamanho: 120 Å).
5. Usando os parâmetros ideais MS/MS (passo 3.2 e 3.3), juntamente com o gradiente de cromatografia líquida acima mencionados (passo 3.4), determinar a linearidade de resposta, limite de detecção (LOD) e limite inferior de quantificação (LLOQ) usando um dupla diluição serial de uma mistura padrão de 100 µM, contendo todos os oito nucleosídeos. Desenhe curvas padrão para todos os oito nucleosídeos de DNA.
6. Detectar e quantificar todos os nucleosídeos, especialmente modificados metiladas, produzidos na etapa 2.4 usando o método de LC-MS/MS e curvas padrão.

Resultados

Modificação dinâmica de 5mC em DNA por TET-família dioxygenases tem um papel importante no Regulamento transcriptional epigenético. TET2 dioxigenase é frequentemente mutado em diversas malignidades hematopoiéticas¹². Para investigar o papel da enzima TET2 no desenvolvimento normal e a doença, nós temos clonado seu domínio mínimo cataliticamente ativo sem qualquer marca de afinidade para o vetor de pDEST14²². A dioxigenase TET2 nã...

Discussão

Mutações no gene TET2 são algumas das alterações genéticas mais frequentemente detectadas em pacientes com diversas malignidades hematopoiéticas. Até à data centenas de mutações TET2 diferentes, que incluem o absurdo, deslocamento de quadro e mutações missense, foram identificados em pacientes¹². Pacientes com mutações TET2 mostram níveis baixos de 5hmC genômica na medula óssea, em comparação com aqueles com wt-TET2¹⁴. TET2 mutantes bat...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEPES	Carbosynth	FH31182
Iron(II) sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	F8633
α-Ketoglutaric acid (2-Oxoglutaric acid)	Sigma-Aldrich	K1750
L-Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4544
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate	Sigma-Aldrich	E5134
Ammonium acetate	Sigma-Aldrich	A1542
Acetonitrile	Fisher Scientific	75-05-8
HPLC grade water	Fisher Scientific	7732-18-5
Oligo clean and concentrator	Zymo Research	D4061
DNAse I	New England Biolabs	M0303S
S1 Nuclease	Thermo Scientific	ENO321
CIAP (Calf intestinal alkaline phosphatase)	New England Biolabs	M0290S
LB Media	Affymetrix	J75852
IPTG	Carbosynth	EI05931
MES [2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate]	Carbosynth	FM37015
Sodium chloride	Fisher Scientific	7647-14-5
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7893
SP Sepharose	Fisher Scientific	45-002-934
2'-Deoxy-5-methylcytidine	TCI	D3610
2'-Deoxy-5-hydroxymethyalcytidine	TCI	D4220
2'-Deoxycytidine-5-carboxylic acid, sodium salt	Berry & Associates	PY 7593
5-Formyl-2'-deoxycytidine	Berry & Associates	PY 7589
2'-Deoxycytidine	Berry & Associates	PY 7216
2'-Deoxyadenosine	Carbosynth	ND04011
2'-Deoxyguanosine	Carbosynth	ND06306
2'-Deoxythymidine	VWR Life Science	97061-764
Gateway technology	Thermo Fisher	11801016
Beckman Allegra X-15R centrifuge	Beckman Coulter	392932
Sonic Dismembrator 550	Fisher Scientific	XL2020
ÄKTA FPLC system	Pharmacia (GE Healthcare)	18116468
FreeZone 4.5 freeze dry system	Labconco	7750020
Zymo Oligo purification columns	Zymo Research	D4061
BDS Hypersil C18 column	Keystone Scientific, INC	105-46-3
3200 Q-Trap mass spectrometer	AB Sciex
HPLC	Shimadzu HPLC
XK16/20 FPLC column	Pharmacia (GE Healthcare)	28988937