Effiziente Reinigung und LC-MS/MS-basierten Assay-Entwicklung für zehn-elf Translokation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll für eine effiziente Einzelschritt-Reinigung des aktiven unmarkierten Menschen zehn-elf Translokation-2 (TET2) 5 Methylcytosine Dioxygenase mit Ionenaustausch Chromatographie und seine Assay mit eine flüssige Chromatographie-Tandem-Masse Massenspektrometrie (LC-MS/MS)-Ansatz.

Zusammenfassung

Die epigenetische Transkription Verordnung vermittelt durch 5-Methylcytosine (5mC) hat in eukaryotischen Entwicklung eine entscheidende Rolle gespielt. Demethylierung dieser epigenetischen Markierungen geschieht durch sequentielle Oxidation durch zehn-elf Translokation Dioxygenases (TET1-3), gefolgt von Thymin-DNA-Glycosylase-abhängige base Excision Repair. Inaktivierung des Gens TET2 aufgrund von genetischen Mutationen oder durch andere epigenetischen Mechanismen ist verbunden mit einer schlechten Prognose bei Patienten mit verschiedenen Krebsarten, vor allem hämatopoetischen Malignome. Hier beschreiben wir eine effiziente Einzelschritt-Reinigung des enzymatisch aktive unmarkierten menschlichen TET2 Dioxygenase mit KATIONENAUSTAUSCH-Chromatographie. Weiter bieten wir einen flüssige Chromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) Ansatz, der trennen und die vier normale DNA-Basen (A, T, G und C), sowie die vier modifizierte Cytosin-Basen (5-Methyl, 5-Hydroxymethyl, 5-Formyl und 5-Carboxylgruppen) zu quantifizieren. Dieser Test kann verwendet werden, um die Aktivität der Wildtyp und Mutanten TET2 Dioxygenases zu bewerten.

Einleitung

Die C5-Position von Cytosin-Basen innerhalb von CpG dinucleotid ist die vorherrschende Methylierung-Website (5mCpG) in Säugetier-Genome¹. Eine Reihe neuerer Studien haben darüber hinaus umfangreiche C5 Cytosin Methylierung (5mC) in nicht-CpG Websites entdeckt (5mCpH, wo H = A, T, oder C)^2,3. 5mC Änderung dient als transkriptioneller Schalldämpfer bei endogenen Retrotransposons und Gen Promotoren^3,4,5. DNA-Methylierung bei 5mC spielt auch eine wichtige Rolle im x-Chromosom Inaktivierung, gen Prägung, nukleare Neuprogrammierung und gewebespezifische Gen Ausdruck^5,6,7. Methylierung von Cytosin an der C5-Position erfolgt durch DNA-Methyltransferasen und Mutationen in diesen Enzymen verursachen erhebliche Entwicklungsschäden⁸. Die Entfernung von 5mC Marken werden von TET1-3 5mC oxidasen^9,10initiiert. Diese Dioxygenases TET-Familie wandeln 5mC in 5-Hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-Formylcytosine (5-FU) und 5-Carboxylcytosine (5caC) durch sequentielle Oxidation Schritte^11,12,13. Schließlich ersetzt Thymin-DNA-Glycosylase 5fC oder 5caC zu unveränderten Cytosin mit base Excision Repair Weg¹¹.

Das menschliche Gen TET2 wurde als ein häufig mutierte Gen in vielfältigen hämatopoetischen Malignome einschließlich myelodysplastischen Syndromen (MDS)^14,15,16, MDS-myeloproliferative Neoplasmen (identifiziert. MDS-MPN), und akute myeloische Leukämie (AML) aus MDS und MDS-MPN¹⁶. Die Höhe der 5hmC Änderung im Knochenmark DNA sind niedriger bei Patienten mit TET2 Mutationen im Vergleich zu denen mit Wildtyp (wt)-TET2¹⁴. Eine Anzahl von Gruppen entwickelten TET2-Knockout-Maus-Modellen um ihre Rolle bei der normalen Hämatopoese und myeloischer Transformation^17,18,19,20zu erhellen. Diese Mäuse mit Mutationen im TET2-gen wurden zunächst normal und lebensfähig, aber vielfältige hämatopoetischen Malignome manifestiert, als sie im Alter von ihrem frühen Tod verursacht. Diese Studien zeigten die wichtige Rolle der wt-TET2 in normaler Hämatopoetischer Differenzierung. Diese Maus-Modellen, die heterozygot Hämatopoetischen Stammzellen (TET2^{+ /} HSCs) und homozygot TET2^{- / -} hatte HSCs einen Wettbewerbsvorteil gegenüber homozygot wt-TET2 HSCs in repopulating hämatopoetische Linien als beide TET2^{+ /-} und TET2^{- / -} Hsz entwickelt vielfältige hämatopoetischen Malignome^17,18. Diese Studien zeigen, dass Haploinsufficiency von TET2 Dioxygenase verändert die Entwicklung von Hsz und hämatopoetische Tumoren führt.

Ähnlich wie Mäuse mit Mutationen im TET2-gen, die meisten Leukämie-Patienten manifestieren Haploinsufficiency TET2 Dioxygenase Aktivität. Diese meist heterozygoten somatischen Mutationen sind Frame-Shift und Unsinn Mutationen, die verstreut im ganzen TET2 gen Körper während Missense-Mutationen, die meisten sind gruppiert in der Dioxygenase Domäne¹². Bisher ist wenig Charakterisierung des wt und Mutant-TET2 in der Literatur vor allem aufgrund von Schwierigkeiten mit der Produktion von TET2-Dioxygenase und seine Assay²¹beschrieben. Hier berichten wir über einer einfachen einstufigen Läuterung der native TET2 Dioxygenase mit Ionenaustausch-Chromatographie. Darüber hinaus wurde eine quantitative LC-MS/MS-Assay optimiert und verwendet, um die enzymatische Aktivität von native TET2 Dioxygenase messen.

Protokoll

1. Klonen und Reinigung des unmarkierten menschlichen TET2 Dioxygenase

1. Klonen Sie menschlichen TET2 Dioxygenase (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) in den pDEST14-Ziel-Vektor mit der ortsspezifische Rekombination Technik wie zuvor beschrieben²².
   Hinweis: Frühere Studien haben gezeigt, dass die C-terminale TET2 Dioxygenase (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) Domäne der minimalen katalytisch aktiven Domain^21,23. Um die unmarkierten TET2 Dioxygenase Domäne mithilfe des pDONR221-Vektors auszudrücken, Flossen Shine-Dalgarno und Kozak-Sequenzen in der forward Primer während der PCR (Tabelle 1).
2. Für bakterielle Transformation hinzufügen 1 µL des rekombinanten pDEST14 Expressionsvektor mit unmarkierten menschlichen TET2 Dioxygenase (TET2 1129-1936, Δ1481-1843), 100 µL chemisch kompetenten E. Coli BL21 (DE3) Zellen in einer 1,7 mL Tube. Halten Sie die Mischung auf dem Eis für mindestens 15 Minuten, gefolgt durch einen Hitzeschock bei 42 ° C für 30 s in einem Wasserbad.
   1. Sofort nach der Hitzeschock halten Sie die Zellen wieder auf Eis für mindestens 2 Minuten. Im Anschluss daran fügen Sie 250 µL super optimale Brühe mit Catabolite Repression (S.O.C Medien ein) in Zellen Inkubieren Sie die Bakterienzellen für 1 h bei 37 ° C in einen Shaker geben.
   2. Nach der Inkubation spin-down der Zellen durch Zentrifugieren der Röhre bei 9.000 x g für 1 min. verwerfen 70 % Überstand durch pipettieren und das Pellet in Links über Medien zu lösen.
   3. Die Zellsuspension auf eine Luria Brühe (LB) Agarplatte mit 100 µg/mL Ampicillin zu verbreiten. Inkubieren Sie die Platte für 16 h bei 37 ° c
3. Wählen Sie eine einzelne Kolonie und in 10 mL LB-Ampicillin Medien in ein 50 mL-Tube zu impfen. Über Nacht inkubieren Sie die Röhrchen bei 37 ° C in einem Shaker. Im Anschluss daran verwenden Sie 100 µL der Kultur aus der 50 mL Tube 100 mL LB Ampicillin Medien zu impfen. Inkubieren Sie den Kolben bei 37 ° C auf einem Boston-Shaker mit 180 u/min und verwenden Sie es als Primärkultur. Verwenden Sie am nächsten Tag 6 mL Primärkultur impfen 15 Flaschen, jede mit 600 mL LB Ampicillin-Medien. Jetzt, inkubieren Sie 15 Flaschen bei 37 ° C auf einem Boston-Shaker mit 180 u/min.
   Hinweis: Führen Sie für die Überprüfung der transformierten Klone, DNA-Sequenzierung oder Einschränkung Verdauung mit isolierter Plasmid DNA.
4. Prüfen Sie die Dichte der Bakterienkultur, Messen Sie die OD₆₀₀ mit einem Spektralphotometer. Nachdem die Kultur eine Dichte von 0,8 bei OD₆₀₀erreicht, induzieren die Expression von TET2-Protein mit 300 µL 1 M (Endkonzentration von 0,5 mM in 600 mL) IPTG in jedem Kolben und weiteres Wachstum der Kultur für 16 h bei 17 ° C.
5. Übertragen Sie nach 16 h die Bakterienkultur auf Zentrifuge Flaschen. Zentrifugieren Sie der Bakterienkultur mit dem Ausdruck TET2 Enzym bei 5.250 x g für 45 min. Einsatz der bakteriellen Pellets für TET2 Reinigung.
   Hinweis: Führen Sie alle verbleibenden Protein Reinigungsschritte auf dem Eis oder bei 4 ° C.
6. Aufschwemmen der bakterielle Pellet in 100 mL 50 mM MES (2-(N-Morpholino) Ethanesulfonic Säure)-Puffer, pH 6 und 5 × 30 s bei Leistung 20 mit 60 s Kühlung Abständen beschallen.
7. Spin lysate 5.250 x g für 45 min. sammeln den überstand enthält lösliche TET2 Enzym und durchlaufen 0,45-µm Filter vor dem Verladen auf einem FPLC-System.
   Hinweis: In diesen Experimenten wurde die TET2 Enzym sehr stabil, aber ggf. eine Protease Inhibitor cocktail mit 1 mM Benzamidine-HCl, 1 mM Phenylmethylsulphonyl Fluorid (PMSF) und 0,5 mM 1,10 -o- Phenanthroline zugesetzt werden, um die Zelle lysate Abbau von TET2 Enzym verhindert. Vermeiden Sie die Verwendung von EDTA oder EGTA in der Inhibitor cocktail, als diese die folgenden KATIONENAUSTAUSCH Chromatographie stören können.
8. 30 mL Pack von einem starken kationenaustauschermembran Harz in einem FPLC Spalte. Equilibrate der Spalte mit 10 bettvolumen von Waschpuffer (50 mM-MES-Puffer, pH 6) bei konstantem Volumenstrom von 0,3 mL/min mit einem FPLC-System.
9. Laden Sie die geklärte lysate auf Pre äquilibriert Spalte und Waschen mit ∼10 bettvolumen von Waschpuffer bis der Durchfluss deutlich wird.
10. TET2 eluieren mit einem 0-100 % Steigung aus den Waschpuffer auf den Puffer, Elution (50 mM-MES-Puffer, pH 6, 1 M NaCl) in 15 bettvolumen gefolgt von zu 100 % Elution Buffer für zwei bettvolumen Betrieb.
    Hinweis: Proben (100 µL) Zelle lysate, vor und nach der Spalte laden zusammen mit allen Fraktionen der Elution sammeln und analysieren auf 10 % Lösung von SDS-PAGE.
11. Pool mit TET2 Protein Fraktionen, Einfrieren trocken, Auflösen von Enzym-Palette in 10 mL Wasser und speichern bei-80 ° C.

2. 5mC Oxidation von TET2-Dioxygenase

1. Führen Sie alle Demethylierung Reaktionen in dreifacher Ausführung mit 3 µg des Substrats (25-Mer Doppel stranded DNA, Tabelle 2).
   1. Fügen Sie 100 µg des gereinigten TET2 Enzym in 50 µL der gesamten Reaktion Puffer mit 50 mM HEPES (pH 8,0), 200 µM FeSO₄, 2 mM 2OG (2-Oxoglutarate/α-Ketoglutarate), und 2 mM Ascorbat und Inkubation bei 37 ° C für 1 h²¹.
   2. TET2 katalysierte Oxidationsreaktionen mit 5 µL von 500 mM EDTA zu stillen.
2. Nach dem abschrecken TET2 Reaktionen bereiten Sie Proben für LC-MS/MS-Analyse durch die Trennung der DNS von TET2 Reaktionsgemisch Oligo Reinigung Spalten verwenden vor.
   1. 100 µL der Oligo Bindung Puffer zu 55 µL abgeschreckt Reaktion hinzufügen.
   2. Im Anschluss daran fügen Sie 400 µL 100 % Ethanol zu der Mischung hinzu. Übergeben Sie diese Mischung durch eine Oligo-Bindung-Spalte.
   3. Waschen der gebundenen DNA mit 750 µL Waschpuffer und eluieren in 20 µL Wasser.
3. Verdauen die isolierte DNA mit 2 Einheiten der DNase I und 60 Einheiten der S1 Nuklease bei 37 ° C für 12 h, individuelle Nukleosid-Monophosphates zu produzieren.
4. Fügen Sie nach Verdauung 2 Einheiten von Kalb Darm alkalische Phosphatase (CIAP) in den Proben und inkubieren Sie Ergänzung 12 h bei 37 ° C zu terminal Phosphatgruppen von Nukleosid-Monophosphates Nukleoside zu entfernen.
5. Alle Nukleoside, speziell modifizierte Cytosines, unter Verwendung der unten beschriebenen LC-MS/MS-Methode zu quantifizieren.

3. quantitative LC-MS/MS-basierten Assay-Entwicklung

1. Bereiten Sie 100 µM-Stammlösung von allen geänderten Cytosin Nukleoside [5-Methyl-2 '-Deoxycytidine (5mdC), 5-Hydroxymethyl-2 '-Deoxycytidine (5hmdC), 5-Formyl-2 '-Deoxycytidine (5fdC) und 5-Carboxy-2 '-Deoxycytidine (5cadC)] und normale DNA Basen (Adenin, Thymin, Cytosin und Guanin) in HPLC-Grade Wasser für die Entwicklung der LC-MS/MS-Methode.
2. Optimierung von Nukleosid-MS/MS Parameter durch Infusion Stammlösungen, einzeln nacheinander, im Massenspektrometer mit einer Durchflussrate von 10 µL/min in EMS scan-Modus. Nach Parametern optimieren: Declustering potenzielle (DP), potenzielle Eingang (EP) Kollision Zelle Eingang potenzielle (CEP), Kollision Energie (CE) und Kollision Zelle Ausfahrt potenzielle (CXP) für jede DNA-Nukleosid mit quantitative Optimierung automatisierte Funktion der Software.
3. Quelle-MS/MS Parameter durch Injektion 10 µL der Stammlösung mit einem Farbverlauf mit 25 % Lösungsmittel B mit einer Durchflussrate von 0,3 mL/min wo Lösungsmittel A 10 mM Ammoniumacetat (pH 4,0) und Lösungsmittel B ist 20 % Acetonitril mit 10 mM Ammoniumacetat (pH 4,0) zu optimieren. Optimierung nach Parametern: Vorhang Gas (CUR): 10-50, Temperatur: 0-600 ° C, Gas Flow 1 (GS1): 0-50, Gas Flow 2 (GS2): 0-50, Collisionally aktiviert Dissoziation (CAD): niedrig, Mittel, hoch, Ion Sprühen Spannung (IS): 4000-5500 für jede DNA-Nukleosid mit Handbuch quantitative Optimierungsfunktion der Software im FIA (Injektion Strömungsanalyse) Modus.
4. Um alle acht DNA Nukleoside zu trennen, führen Flüssigchromatographie mit folgenden Farbverlauf: 0 % Lösungsmittel B (0-2 min), 0-20 % Lösungsmittel B (2-5 min), 20-60 % Lösungsmittel B (5-9 min), 60-0 % Lösungsmittel B (9-10 min) und dann mit Lösungsmittel A für 5 min bei einer Durchflussmenge von 0,3 equilibrate mL/min auf einer C18-Säule (Partikelgröße: 5 µm, Pore Größe: 120 Å).
5. Mit der optimalen Parameter der MS/MS (Schritt 3.2 und 3.3) in Verbindung mit den oben genannten Flüssigkeitschromatographie Farbverlauf (Schritt 3.4), bestimmen die Antwort Linearität der Nachweisgrenze (LOD) und untere Grenze der Quantifizierung (LLOQ) mit einem zweifach serielle Verdünnung einer 100 µM standard Mischung enthält alle acht Nukleoside. Standardkurven für alle acht DNA Nukleoside zu zeichnen.
6. Erkennung und Quantifizierung der alle Nukleoside, speziell modifizierte Cytosines in Schritt 2.4 mit der LC-MS/MS-Methode und Standardkurven produziert.

Ergebnisse

Dynamisierung der 5mC in der DNA durch Dioxygenases TET-Familie spielt eine wichtige Rolle in epigenetische transkriptionelle Verordnungen. TET2 Dioxygenase ist häufig in diversen hämatopoetischen Tumoren¹²mutiert. Um die Rolle des Enzyms TET2 in der normalen Entwicklung und Krankheit zu untersuchen, haben wir seine minimale katalytisch aktiven Domain ohne jede Affinität-Tag in pDEST14 Vector²²geklont. Die unmarkierten TET2 Dioxygenase en...

Diskussion

Mutationen im TET2-gen sind einige der am häufigsten gefundenen genetischen Veränderungen bei Patienten mit unterschiedlichen hämatopoetischen Malignome. Bis heute hunderte von verschiedenen TET2 Mutationen, darunter Unsinn, Frame-Shift und Missense-Mutationen wurden in Patienten¹²identifiziert. Patienten mit TET2 Mutationen zeigen niedrige Konzentrationen von genomischen 5hmC im Knochenmark, im Vergleich zu denen mit wt-TET2¹⁴. Mutierte TET2 Knock-in E...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEPES	Carbosynth	FH31182
Iron(II) sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	F8633
α-Ketoglutaric acid (2-Oxoglutaric acid)	Sigma-Aldrich	K1750
L-Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4544
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate	Sigma-Aldrich	E5134
Ammonium acetate	Sigma-Aldrich	A1542
Acetonitrile	Fisher Scientific	75-05-8
HPLC grade water	Fisher Scientific	7732-18-5
Oligo clean and concentrator	Zymo Research	D4061
DNAse I	New England Biolabs	M0303S
S1 Nuclease	Thermo Scientific	ENO321
CIAP (Calf intestinal alkaline phosphatase)	New England Biolabs	M0290S
LB Media	Affymetrix	J75852
IPTG	Carbosynth	EI05931
MES [2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate]	Carbosynth	FM37015
Sodium chloride	Fisher Scientific	7647-14-5
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7893
SP Sepharose	Fisher Scientific	45-002-934
2'-Deoxy-5-methylcytidine	TCI	D3610
2'-Deoxy-5-hydroxymethyalcytidine	TCI	D4220
2'-Deoxycytidine-5-carboxylic acid, sodium salt	Berry & Associates	PY 7593
5-Formyl-2'-deoxycytidine	Berry & Associates	PY 7589
2'-Deoxycytidine	Berry & Associates	PY 7216
2'-Deoxyadenosine	Carbosynth	ND04011
2'-Deoxyguanosine	Carbosynth	ND06306
2'-Deoxythymidine	VWR Life Science	97061-764
Gateway technology	Thermo Fisher	11801016
Beckman Allegra X-15R centrifuge	Beckman Coulter	392932
Sonic Dismembrator 550	Fisher Scientific	XL2020
ÄKTA FPLC system	Pharmacia (GE Healthcare)	18116468
FreeZone 4.5 freeze dry system	Labconco	7750020
Zymo Oligo purification columns	Zymo Research	D4061
BDS Hypersil C18 column	Keystone Scientific, INC	105-46-3
3200 Q-Trap mass spectrometer	AB Sciex
HPLC	Shimadzu HPLC
XK16/20 FPLC column	Pharmacia (GE Healthcare)	28988937