Purification efficace et LC-MS/MS-based test développement pour dix-onze Translocation-2 5-méthylcytosine Dioxygenase

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour une purification efficace seule étape de l’humain sans balise active dix-onze translocation-2 (TET2) 5-méthylcytosine dioxygénase utilisant la chromatographie échangeuse d’ions et son dosage à l’aide d’une masse en tandem par chromatographie liquide spectrométrie (LC-MS/MS)-approche de base.

Résumé

La régulation de la transcription épigénétique médiée par la 5-méthylcytosine (5mC) a joué un rôle essentiel dans le développement eucaryote. La déméthylation de ces marques épigénétiques s’effectue par oxydation séquentielle de dix-onze translocation dioxygénases (TET1-3), suivie par la thymine-DNA glycosylase dépendant base excision de réparation. L’inactivation du gène TET2 due à des mutations génétiques ou par d’autres mécanismes épigénétiques est associée à un mauvais pronostic chez les patients atteints de divers cancers, surtout des malignités hématopoïétiques. Nous décrivons ici une purification efficace seule étape d’enzymatiquement actif non balisés humaine TET2 dioxygénase chromatographie échangeuse de cations. Nous fournissons également une approche liquid chromatography-spectrométrie de masse (LC-MS/MS) qui peut séparer et quantifier les quatre bases normales de l’ADN (A, T, G et C), ainsi que les quatre bases de cytosine mis à jour le (méthyl-5, 5-hydroxyméthyle, formyl-5 et 5-carboxylique). Ce test peut être utilisé pour évaluer l’activité de type sauvage et mutant TET2 dioxygénases.

Introduction

La position de C5 des bases cytosine dans dinucléotides est le site de méthylation prédominant (5mCpG) dans les génomes de mammifères,¹. En outre, un certain nombre d’études récentes ont mis au jour une vaste méthylation de cytosine C5 (5mC) dans des sites non-CpG (5mCpH, où H = A, T, ou C)^2,3. modification de 5MC sert un silencieux transcriptionnel rétrotransposons endogènes et gènes promoteurs^3,4,5. Méthylation de l’ADN à 5mC joue également un rôle important dans l’inactivation du chromosome X, l’empreinte génétique, reprogrammation nucléaire et expression de gène de tissu-spécifique^5,6,7. La méthylation de la cytosine postées sur la C5 est réalisée par ADN méthyltransférases, et mutations de ces enzymes causent des défauts importants de développement⁸. L’enlèvement des marques 5mC commencent par TET1-3 5mC oxydases^9,10. Ces dioxygénases TET-famille convertissent 5mC 5-hydroxyméthylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5FC) et 5-carboxylcytosine (5caC) par oxydation séquentielle étapes^11,12,13. Enfin, thymine-DNA glycosylase remplace 5FC ou 5caC de cytosine non modifiée à l’aide de la base excision repair voie¹¹.

Le gène humain de la TET2 a été identifié comme un gène muté fréquemment dans diverses malignités hématopoïétiques dont myelodysplastic syndromes (MDS)^14,15,16, MDS-syndromes myéloprolifératifs () néoplasmes MDS-MPN) et la leucémie myéloïde aiguë (AML) originaires du MDS et MDS-NPP¹⁶. Les niveaux de modification 5hmC dans la moelle osseuse ADN sont plus faibles chez les patients présentant des mutations de TET2 par rapport à ceux qui ont le type sauvage (wt)-TET2¹⁴. Un certain nombre de groupes ont développé des modèles de souris de TET2-knockout pour élucider leur rôle dans l’hématopoïèse normale et transformation myéloïde^17,18,19,20. Ces souris avec des mutations dans le gène de TET2 ont été initialement normale et viable, mais qui se manifeste de diverses malignités hématopoïétiques comme ils âgés causant leur mort prématurée. Ces études ont montré le rôle important joué par la wt-TET2 dans la différenciation hématopoïétique normale. Dans ces modèles de souris hétérozygotes de cellules souches hématopoïétiques (TET2^+/- CSH) et l’homozygote TET2^{- / -} CSH avait un avantage concurrentiel sur les homozygotes wt-TET2 CSH à repeupler les lignées hématopoïétiques comme les deux TET2^+/- et TET2^{- / -} CSH développé diverses malignités hématopoïétiques^17,18. Ces études démontrent que Sim1 de TET2 dioxygénase altère le développement des CSH et se traduit par des malignités hématopoïétiques.

Semblables à des souris présentant des mutations dans le gène TET2, la plupart des patients de leucémie manifestent Sim1 TET2 dioxygénase dactivité. Ces mutations somatiques hétérozygotes pour la plupart comprennent mutations cadre-Maj et non-sens dispersées dans tout le corps de gène de TET2 tandis que des mutations faux-sens qui sont les plus groupés dans le domaine de dioxygénase¹². A ce jour, peu caractérisation de wt - et mutant-TET2 est rapportée dans la littérature principalement en raison de difficultés liées à la production de TET2 dioxygénase et son dosage²¹. Nous rapportons ici une simple purification seule étape de native TET2 dioxygénase chromatographie échangeuse d’ions. En outre, un test quantitatif de la LC-MS/MS a été optimisé et utilisé pour mesurer l’activité enzymatique de native TET2 dioxygénase.

Protocole

1. le clonage et la Purification de TET2 humaine non balisés Dioxygenase

1. Clonage humain TET2 dioxygénase (1129-1936, TET2 Δ1481-1843) dans le vecteur de destination de pDEST14 à l’aide de la technique de recombinaison site-spécifique comme décrit précédemment²².
   Remarque : Les études antérieures ont démontré que le domaine C-terminal TET2 dioxygénase (1129-1936, TET2 Δ1481-1843) est les minimes domaine catalytiquement active^21,23. Afin d’exprimer le domaine de dioxygénase TET2 non balisé à l’aide du vecteur pDONR221, séquences Shine Dalgarno et Kozak ont été incorporées dans l’amorce vers l’avant pendant l’ACP (tableau 1).
2. Pour la transformation bactérienne, ajouter 1 µL de vecteur d’expression pDEST14 recombinant contenant non balisés humaine TET2 dioxygénase (1129-1936, TET2 Δ1481-1843) à 100 µL de chimiquement compétent e. coli BL21 (DE3) de cellules dans un tube de 1,7 mL. Garder le mélange sur la glace pendant au moins 15 minutes suivi d’un choc thermique à 42 ° C pendant 30 s dans un bain d’eau.
   1. Immédiatement après un choc thermique, garder les cellules retour sur la glace pendant au moins 2 min. Suite à cela, ajouter 250 µL de bouillon super optimal avec la répression catabolique (S.O.C médias) aux cellules. Incuber les cellules bactériennes pendant 1 h à 37 ° C dans un agitateur.
   2. Après incubation, tournez en bas les cellules par centrifugation du tube à 9 000 x g pendant 1 min. jetez 70 % surnageant de pipetage et dissoudre le culot à gauche sur les médias.
   3. Étendre la suspension de cellules sur une gélose de bouillon (LB) de Luria contenant 100 ampicilline µg/mL. Incuber les plaques pendant 16 h à 37 ° C.
3. Choisir une colonie isolée et il inoculer dans 10 mL de médias LB-ampicilline dans un tube de 50 mL. Incuber les tubes à 37 ° C dans un agitateur pour la nuit. Par la suite, utiliser 100 µL de la culture du tube de 50 mL pour ensemencer 100 mL de médias LB-ampicilline. Incuber le ballon à 37 ° C dans un agitateur à 180 tr/min et l’utiliser comme culture primaire. Lendemain, permet d’ensemencer 15 flacons, chaque média 600 mL LB-ampicilline contenant 6 mL de chaque culture primaire. Maintenant, Incuber 15 flacons à 37 ° C dans un agitateur à 180 tr/min.
   Remarque : Pour la vérification des clones transformées, effectuez digestion de séquençage ou de restriction de l’ADN avec l’ADN de plasmide isolé.
4. La densité de culture bactérienne, mesurez son OD₆₀₀ à l’aide d’un spectrophotomètre. Lorsque la culture atteint une densité de 0,8 à OD₆₀₀, induit l’expression de la protéine TET2 avec 300 µL de 1 M (concentration finale de 0,5 mM de 600 mL) IPTG dans chaque fiole et accroître davantage la culture pendant 16 h à 17 ° C.
5. Après 16 h, transférer la culture bactérienne à la centrifugeuse bouteilles. Centrifuger la culture bactérienne exprimant l’enzyme TET2 à 5 250 g pendant 45 min. utilisation le culot bactérien pour la purification de TET2.
   Remarque : Effectuez toutes les étapes de purification des protéines restantes sur la glace ou à 4 ° C.
6. Resuspendre le culot bactérien dans 100 mL de 50 mM MES (2-(N-morpholino) ethanesulfonic acide) buffer, pH 6 et laisser agir pendant 5 x 30 s à la puissance 20 avec refroidissement intervalles de 60 s.
7. Spin le lysat à 5 250 g pendant 45 min. récupérer le surnageant contenant l’enzyme TET2 soluble et traverse de 0,45 µm filtre avant du charger sur un système FPLC.
   Remarque : Dans ces expériences, l’enzyme TET2 était très stable, mais si nécessaire une protéase inhibiteur cocktail contenant 1 mM benzamidine-HCl, fluorure de sulfonyle de 1 mM (PMSF) et 0,5 mM 1,10 -o- phénanthroline peut être ajouté à la cellule lysate de prévenir la dégradation des enzymes TET2. Évitez d’utiliser des EDTA ou EGTA dans l’inhibiteur cocktail car ceux-ci peuvent interférer avec la chromatographie échangeuse de cations suivantes.
8. Pack de 30 mL de résine échangeuse de cations forts dans une colonne FPLC. Equilibrer la colonne avec 10 volumes de lit du tampon de lavage (tampon MES 50 mM, pH 6) au débit constant de 0,3 mL/min à l’aide d’un système FPLC.
9. Charger le clarifié lysat sur la colonne préalablement équilibré et lavage avec des volumes de lit ∼10 de tampon de lavage jusqu'à ce que le débit devient clair.
10. Éluer les TET2 à l’aide d’un 0-100 % dégradé de la mémoire tampon de lavage dans la mémoire tampon d’élution (tampon MES 50 mM, pH 6, 1 M NaCl) en 15 volumes de lit suivie d’exploitation au tampon d’élution de 100 % pour les volumes de deux lits.
    NOTE : Prélever des échantillons (100 µL) de cellule lysat avant et après la colonne de chargement ainsi que toutes les fractions d’élution et analyser sur 10 % solution SDS-PAGE.
11. Mettre en commun les fractions contenant des protéines TET2, geler sec, dissoudre la palette d’enzyme dans 10 mL d’eau et conserver à-80 ° C.

2. 5mC oxydation par TET2 Dioxygenase

1. Effectuer toutes les réactions de déméthylation en triple avec 3 µg de substrat (ADN bicaténaire 25-mer, tableau 2).
   1. Ajouter 100 µg d’enzyme purifiée de TET2 dans 50 µL de tampon de réaction totale contenant 50 mM HEPES (pH 8,0), 200 µM FeSO₄, 2 mM 2OG (2-oxoglutarate/α-cétoglutarate) et l’ascorbate de 2 mM et incuber à 37 ° C pendant 1 h²¹.
   2. Étancher TET2 catalysé les réactions d’oxydation 5 µl de 500 mM EDTA.
2. Après la trempe des réactions TET2, préparer les échantillons pour analyse LC-MS/MS en séparant l’ADN du mélange réactionnel de TET2 à l’aide de colonnes de purification oligo.
   1. Ajouter 100 µL de tampon de liaison oligo à 55 µL de réaction trempée.
   2. Suite à cela, ajouter 400 µL d’éthanol à 100 % au mélange. Passez ce mélange à travers une colonne de liaison oligo.
   3. Lavez l’ADN lié avec 750 µL de tampon de lavage et éluer dans 20 µL d’eau.
3. Digérer l’ADN isolé avec 2 unités de DNase I et 60 unités de nucléase S1 à 37 ° C pendant 12 h pour produire des nucléosides-monophosphates individuels.
4. Après digestion, ajoutez 2 unités de la phosphatase alcaline intestinale de veau (CIAP) dans les échantillons et incuber pendant plus de 12 h à 37 ° C, à supprimer les groupes de phosphate terminal de nucléoside-monophosphates d’obtenir des nucléosides.
5. Quantifier tous les nucléosides, surtout mis à jour le cytosines, en utilisant la méthode CL-SM/SM décrite ci-dessous.

3. quantitative analyse LC-MS/MS-based Development

1. Préparer la solution mère de 100 µM de tous les nucléosides modifiés cytosine [5-méthyl-2′-désoxycytidine (5mdC), 5-hydroxyméthyl-2′-désoxycytidine (5hmdC), 5-formyl-2′-désoxycytidine (5fdC) et 5-carboxy-2′-désoxycytidine (5cadC)] et ADN normal des bases (adénine, thymine, cytosine et guanine) en eau de qualité CLHP pour l’élaboration de la méthode CL-SM/SM.
2. Optimiser les paramètres de MS/MS de nucléoside dépendant en infusant des solutions mères, un à la fois, dans le spectromètre de masse à un débit de 10 µL/min en EMS mode de balayage. Optimiser les paramètres suivants : Declustering de potentiel (DP), entrée potentielle (EP), Collision cellule entrée potentielle (CEP), l’énergie de Collision (EC) et Collision cellule sortie potentielle (CXP) pour chaque nucléoside d’ADN en utilisant automatisé optimisation quantitative fonction du logiciel.
3. Optimiser les paramètres MS/MS dépend de la source en injecter 10 µL de solution utilisant un gradient avec 25 % de solvant B à un débit de 0,3 mL/min où solvant A est l’acétate d’ammonium de 10 mM (pH 4,0) et solvant B est de 20 % d’acétonitrile avec de l’acétate d’ammonium 10 mM (pH 4,0). Optimiser les paramètres suivants : rideau de gaz (ACTU) : 10-50, température : 0-600 ° C, débit de gaz 1 (GS1) : 0-50, débit de gaz 2 (GS2) : 0-50, Dissociation activée par collision (CAD) : basse-moyenne-haute, Ion pulvérisateur tension (IS) : 4000-5500 pour chaque nucléoside d’ADN à l’aide de manuel fonction d’optimisation quantitative du logiciel en mode FIA (Flow Injection Analysis).
4. Pour séparer tous les nucléosides d’ADN huit, effectuer la chromatographie en phase liquide en utilisant le gradient suivant : 0 % solvant B (0-2 min), 0-20 % de solvant B (2-5 min), 20-60 % de solvant B (5-9 min), solvant de 60-0 % B (9-10 min) et ensuite équilibrer avec solvant A pendant 5 min pour un débit de 0,3 mL/min sur une colonne C18 (granulométrie : 5 µm, taille des pores : 120 Å).
5. En utilisant les paramètres de MS/MS optimales (étape 3.2 et 3.3) couplés avec le gradient susmentionné de chromatographie en phase liquide (étape 3.4), déterminer la linéarité de la réponse, limite de détection (LD) et le seuil de quantification (PPQM) en utilisant un double dilution en série d’un mélange standard de 100 µM, contenant tous les huit nucléosides. Dessiner des courbes standard pour tous les huit nucléosides de l’ADN.
6. Détecter et quantifier tous les nucléosides, surtout mis à jour le cytosines, produites à l' étape 2.4 à l’aide de la méthode LC-MS/MS et les courbes d’étalonnage.

Résultats

Modification dynamique de 5mC dans l’ADN par TET-famille dioxygénases joue un rôle important dans les règlements transcriptionnelles épigénétiques. TET2 dioxygénase est fréquemment muté dans diverses malignités hématopoïétiques¹². Afin d’étudier le rôle de l’enzyme de TET2 dans le développement normal et la maladie, nous avons cloné son domaine catalytiquement actif minimal sans n’importe quelle balise d’affinité dans le vecteur de pDEST...

Discussion

Des mutations du gène TET2 sont quelques-uns des changements génétiques plus souvent détectés chez les patients atteints de divers cancers hématopoïétiques. À ce jour des centaines de différentes mutations TET2, incluent un non-sens, cadre-Maj et mutations faux-sens, ont été identifiées dans les patients de¹². Les patients présentant des mutations de TET2 montrent des niveaux faibles de génomique 5hmC dans la moelle osseuse, comparée à ceux qui wt-TET2^14...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEPES	Carbosynth	FH31182
Iron(II) sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	F8633
α-Ketoglutaric acid (2-Oxoglutaric acid)	Sigma-Aldrich	K1750
L-Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4544
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate	Sigma-Aldrich	E5134
Ammonium acetate	Sigma-Aldrich	A1542
Acetonitrile	Fisher Scientific	75-05-8
HPLC grade water	Fisher Scientific	7732-18-5
Oligo clean and concentrator	Zymo Research	D4061
DNAse I	New England Biolabs	M0303S
S1 Nuclease	Thermo Scientific	ENO321
CIAP (Calf intestinal alkaline phosphatase)	New England Biolabs	M0290S
LB Media	Affymetrix	J75852
IPTG	Carbosynth	EI05931
MES [2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate]	Carbosynth	FM37015
Sodium chloride	Fisher Scientific	7647-14-5
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7893
SP Sepharose	Fisher Scientific	45-002-934
2'-Deoxy-5-methylcytidine	TCI	D3610
2'-Deoxy-5-hydroxymethyalcytidine	TCI	D4220
2'-Deoxycytidine-5-carboxylic acid, sodium salt	Berry & Associates	PY 7593
5-Formyl-2'-deoxycytidine	Berry & Associates	PY 7589
2'-Deoxycytidine	Berry & Associates	PY 7216
2'-Deoxyadenosine	Carbosynth	ND04011
2'-Deoxyguanosine	Carbosynth	ND06306
2'-Deoxythymidine	VWR Life Science	97061-764
Gateway technology	Thermo Fisher	11801016
Beckman Allegra X-15R centrifuge	Beckman Coulter	392932
Sonic Dismembrator 550	Fisher Scientific	XL2020
ÄKTA FPLC system	Pharmacia (GE Healthcare)	18116468
FreeZone 4.5 freeze dry system	Labconco	7750020
Zymo Oligo purification columns	Zymo Research	D4061
BDS Hypersil C18 column	Keystone Scientific, INC	105-46-3
3200 Q-Trap mass spectrometer	AB Sciex
HPLC	Shimadzu HPLC
XK16/20 FPLC column	Pharmacia (GE Healthcare)	28988937