Modelo de rata de desmielinización cortical cerebral generalizada inducida por una inyección intracerebral de citoquinas proinflamatorias

Resumen

El protocolo presentado aquí permite la reproducción de una desmielinización generalizada de la materia gris de ambos hemisferios corticales en ratas agouti oscuras macho adultas. El método consiste en la implantación intracerebral de un catéter, la inmunización subclínica contra la glicoproteína de oligodendrocitos de mielina y la inyección intracerebral de una mezcla de citoquinas proinflamatorias a través del catéter implantado.

Resumen

La esclerosis múltiple (EM) es la enfermedad inmunomedida más común del sistema nervioso central (SNC) y conduce progresivamente a la discapacidad física y la muerte, causada por lesiones de la materia blanca en la médula espinal y el cerebelo, así como por la desmielinización en la materia gris. Si bien los modelos convencionales de encefalomielitis alérgica experimental son adecuados para la investigación de la inflamación mediada por células en la materia blanca espinal y cerebelosa, no abordan las patologías de la materia gris. Aquí, presentamos el protocolo experimental para un nuevo modelo de rata de desmielinización cortical que permite la investigación de los mecanismos patológicos y moleculares que conducen a lesiones corticales. La desmielinización es inducida por una inmunización con dosis bajas de glicoproteína de oligodendrocitos de mielina (MOG) en un adyuvante de Freund incompleto seguido de una administración intracerebral mediada por catéter de citoquinas proinflamatorias. El catéter, además, permite múltiples rondas de desmielinización sin causar trauma inducido por inyección, así como la administración intracerebral de posibles fármacos terapéuticos sometidos a una investigación preclínica. El método también es éticamente favorable ya que el dolor animal y la angustia o discapacidad están controlados y son relativamente mínimos. El plazo previsto para la implementación de todo el protocolo es de alrededor de 8 a 10 semanas.

Introducción

La EM es una enfermedad inflamatoria del SNC inmunomedida, que daña principalmente las hojas de mielina, pero eventualmente conduce a la pérdida axonal y al daño neuronal permanente. La EM es la enfermedad inmunomedida más común del SNC con una prevalencia estimada de alrededor de 2,3 millones de personas en todo el mundo, según la Sociedad Nacional de EM^1,y representa una importante carga personal y socioeconómica. La edad promedio de inicio de la enfermedad es de 30 años y conduce a la pérdida de años productivos al causar una discapacidad severa. La EM es actualmente incurable, y las modalidades de tratamiento actuales tienen como objetivo controlar los síntomas durante una recaída aguda en la EM remitente-recurrente y modificar el curso de la enfermedad para disminuir la frecuencia de recaída mediante terapia inmunomoduladora^2,3. Ninguna opción de tratamiento ha demostrado ser eficaz para los tipos progresivos^4,con la excepción de un ensayo clínico reciente de terapia de agotamiento de células B, que demostró ser eficaz en un subgrupo de pacientes con EM progresiva primaria (EMPP) con inflamación activa⁵. Si bien se han identificado varios factores de riesgo genéticos potenciales⁶ y ambientales^7, la etiología de la EM, sin embargo, sigue siendo desconocida.

La EM se caracteriza por grandes placas inflamatorias desmielinizantes en, y lesiones difusas a, la materia blanca^8,9. Las lesiones focales se han asociado con un ataque extenso mediado por células T, destrucción de oligodendrocitos, astrogliosis reactiva y degeneración axonal, lo que lleva a una disminución de la neurona motora. La desmielinización y la atrofia de la materia gris han ganado reconocimiento como características histopatológicas adicionales de la enfermedad^9,10,11. Se ha sugerido que este último contribuye a la disfunción neurológica y al deterioro cognitivo en pacientes^12,13. Se han distinguido tres patrones de desmielinización cortical, a saber: i) leucocortical, contiguo con las lesiones de la materia blanca (34%), ii) pequeña, perivascular (16%) y iii) subpial (50%). A diferencia de las lesiones focales de la materia blanca, se ha informado que estas lesiones de materia gris carecen de un ataque mediado por células T y, en cambio, se caracterizan por una activación microglial mejorada, apoptosis y pérdida neuronal¹².

Hasta la fecha, no ha sido posible recapitular la EM humana en un solo modelo animal, en gran parte debido a la complejidad de la enfermedad. En cambio, se han desarrollado una variedad de modelos animales de EM, cada uno simulando diferentes aspectos de la patogénesis y progresión de la enfermedad^14,15. Los modelos animales actuales imitan tres procesos de enfermedad diferentes: i) lesiones inflamatorias focales, ii) lesión difusa de la materia blanca y iii) patología difusa de la materia gris.

Los estudios en animales de las placas de materia blanca de la EM se han realizado principalmente en modelos de encefalomielitis en roedores (EAE). Los animales de prueba están inmunizados activamente con una emulsión que contiene un antígeno de mielina [generalmente glicoproteína de oligodendrocitos de mielina (MOG)^16,17, proteína básica de mielina (MBP)¹⁸o proteína proteolípida (PLP)¹⁹], junto con un adyuvante de Freund completo (CFA)²⁰. La enfermedad también puede ser inducida pasivamente por una transferencia adoptiva de células T específicas de mielina²¹. El curso de la enfermedad depende de la combinación de antígeno / cepa de ratón que se utiliza. MOG_35-55 en C57BL/6, por ejemplo, da como resultado una enfermedad crónica monofásica²², mientras que PLP_139-151 en ratones suizos Jim Lambert (SJL) conduce a un curso de enfermedad remitente-recurrente²³ de una manera específica de género²⁴. Rat MOG_35-55, además, induce una respuesta encefalitogénica de células T, mientras que MOG_{humano 35-55} induce inflamación dependiente de células B en ratones C57BL / 6²⁵. Varios modelos de EAE proporcionan una excelente herramienta para estudiar la inflamación mediada por células principalmente en la médula espinal y el cerebelo, pero las estructuras del cerebro anterior como la corteza, el cuerpo calloso y las estructuras subcorticales permanecen en gran medida salvadas²⁶. Ni la lesión difusa de la materia blanca ni la desmielinización de la materia gris se replican, además, adecuadamente en los modelos^{EAE 26,27}. Se ha notificado desmielinización cortical asociada a la inducción activa de EAE en titíes^28,29 y en ciertas subtensiones de ratas Lewis, en este último caso atribuida a las combinaciones predominantes de isotipos y alelos MHC clase I y clase II³⁰.

El modelo de cuprizona³¹ es una herramienta útil para estudiar la desmielinización difusa de la materia blanca y la patología de la materia gris con una desmielinización extensa de las regiones cortical, subcortical³²e hipocampal^33, así como del cuerpo calloso³⁴ y el putamen caudado^35. La intoxicación por cuprizona, que, en principio, resulta en apoptosis inducida por el estrés metabólico de los oligodendrocitos, imita algunas características de las lesiones desmielinizantes corticales de los cerebros de la EM, como la activación de la microglía, la astrogliosis y una relativa falta de células inmunes periféricas infiltrantes. La falta de apoptosis neuronal y atrofia talámica, así como la resolución completa de la desmielinización con una robusta remielinización observada al cesar la suplementación con cuprizona en la dieta^32,sin embargo, limitan el uso de la intoxicación por cuprizona como modelo preclínico de EM. La desmielinización tóxica también puede ser inducida por una inyección focal de lisolecitina o bromuro de etidio en los tractos de materia blanca^36,37, pero estos métodos rara vez se utilizan. Los modelos de desmielinización tóxica son especialmente adecuados para el análisis de los complejos mecanismos de remielinización, como la necesidad de células progenitoras de oligodendrocitos y astrocitos^38,39. La información detallada sobre EAE y los modelos de intoxicación se proporcionan en dos revisiones recientes^15,40.

La desmielinización inducida por citoquinas se desarrolló inicialmente para estudiar las lesiones de la materia blanca espinal en EAE^41. Más tarde, se modificó para estudiar patologías corticales de materia gris en MS. Las ratas Dark Agouti (DA) o Lewis se preparan primero mediante una inmunización subclínica con MOG_1-125^42,43 o MOG_1-116⁴⁴ en un adyuvante de Freund incompleto (IFA). A diferencia de los modelos clásicos de EAE, estos animales preparados no presentan síntomas clínicos de lesiones inflamatorias focales en la médula espinal. En cambio, una respuesta inflamatoria y desmielinización en el cerebro se logran posteriormente mediante una administración intracerebral de una mezcla de citoquinas proinflamatorias [factor de necrosis tumoral alfa (TNFα) e interferón gamma (IFNγ)] una vez que los animales han alcanzado un título estable de anticuerpos anti-MOG en la sangre.

Estudios de Merkler et al. ⁴² y Gardner et al. ⁴⁴ han demostrado la eficacia de una inducción de desmielinización cortical subpial mediante una inmunización MOG subclínica y una inyección de citoquinas intracerebrales o subaracnoidales. Sin embargo, la duración informada de la desmielinización fue demasiado corta: una remielinización completa ocurrió en 14 días o menos, lo que limitó la ventana para cualquier prueba de intervención farmacológica. Ambos modelos, además, utilizan un modo de inyección traumático, que podría causar per se un trauma de inyección y una ruptura de la barrera hematoencefálica (BBB) y, por lo tanto, conducir a un reclutamiento incontrolado de células inflamatorias en el parénquima. Ambos estudios, además, demostraron una desmielinización que está restringida a un área limitada, en la corteza ipsilateral o en las cercanías del sitio de la inyección de citoquinas.

Para superar estas limitaciones, implantamos un catéter en la corteza parietal derecha de ratas DA, con la punta del catéter ubicada justo encima del cuerpo calloso. Para permitir una recuperación completa de la integridad de BBB, a los animales se les permitió un período de descanso de 2 semanas después de la implantación del catéter. Posteriormente, las ratas fueron inmunizadas subclínicamente con 5 μg de MOG_1-125 recombinante en IFA. Tras la obtención de un título estable de anticuerpos anti-MOG después de aproximadamente 4 semanas, se inyectaron 2 μL de mezcla de citoquinas a través del catéter en 10 minutos utilizando una bomba de jeringa programable. Este procedimiento provocó una desmielinización cortical generalizada de los hemisferios cerebrales ipsi y contralateral en 15 días, con una remielinización parcial alrededor de 30 días después de la inyección de citoquinas⁴³. Múltiples fases de desmielinización podrían, además, ser inducidas por la administración repetida de citoquinas proinflamatorias a través del catéter, y la atrofia cerebral global, una característica común de los subtipos de EM progresiva^45,podría inducirse tan pronto como después de la segunda fase de desmielinización^43. Es importante destacar que el catéter implantado también podría usarse para probar intervenciones farmacológicas.

El protocolo descrito a continuación proporciona una explicación detallada de los pasos experimentales para una generación reproducible de desmielinización cortical generalizada en ambos hemisferios cerebrales de ratas DA utilizando un catéter intracerebral.

Protocolo

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por las autoridades locales (Bundesministerium für Wissenschaft und Forschung (Ministerio de Ciencia e Investigación de Austria); Número de licencia: 66.010/0132-WF/V/3b/2014). Las ratas DA macho adultas (10 - 12 semanas de edad) fueron alojadas en un ciclo de luz / oscuridad de 12/12 h con acceso gratuito a alimentos y agua.

1. Preparación del material
NOTA: La cirugía se realiza en condiciones asépticas. Antes de comenzar, asegúrese de que todos los instrumentos quirúrgicos, incluidas las brocas, se limpien con un desinfectante adecuado.

1. Preparar una mezcla anestésica: 0,02 mg/ml de fentanilo, 0,4 mg/ml de midazolam y 0,2 mg/ml de medetomidina (concentraciones finales en la mezcla).
   NOTA: Consulte la sección de discusión respectiva para obtener anestésicos alternativos.
2. Preparar una mezcla de antídoto: 0,07 mg/ml de flumazenil y 0,42 mg/ml de atipamezol (concentraciones finales en la mezcla).
3. Ensamble el catéter y la tapa del catéter con la entrada y el tornillo. Cortar el catéter a una longitud de 2 mm con un bisturí (Figura 1).
   NOTA: No use tijeras para esto, ya que aprietan y distorsionan la forma circular transversal de la punta del catéter.

2. Preparación quirúrgica

1. Anestesiar a la rata mediante una administración intraperitoneal (i.p.) de la mezcla anestésica (1,5 ml/kg de peso corporal).
2. Afeite la cabeza de la rata entre las orejas usando la afeitadora eléctrica. Coloque una manta homeotérmica en el marco estereotáctico antes de colocar al animal, para evitar la hipotermia durante toda la cirugía.
3. Inmovilice la cabeza de la rata en el marco estereotáctico utilizando las barras para los oídos y la placa de mordida, asegurando que la cabeza esté horizontal y estable. Compruebe la estabilidad aplicando presión al cráneo con el dedo o las pórceps.
   NOTA: Una fijación suelta y un posicionamiento no horizontal dentro del marco estereotáctico pueden causar una desviación de las coordenadas previstas.
4. Aplique gotas lubricantes para los ojos para prevenir la sequedad de la córnea durante la cirugía. Cubra los ojos con un material opaco para evitar cualquier exposición quirúrgica a la luz.
5. Limpie el área afeitada alternando la aplicación de 70% de etanol y 10% de complejo povidona-yodo.
   NOTA: Siga todas las medidas de precaución durante la cirugía para evitar la infección. La cirugía se realiza en condiciones asépticas. Si la asepsia se rompe, entonces el material contaminado tiene que ser reemplazado.

3. Implantación del catéter

1. Haga una incisión longitudinal de aproximadamente 2 cm de longitud en el medio de la piel de la cabeza. Use abrazaderas de bulldog para mantener la piel hacia los lados. Para obtener información general sobre estos pasos, consulte la Figura 2.
2. Retire la sangre con un aplicador con punta de algodón.
3. Retire el periostio del cráneo. Limpie el tejido con el aplicador de punta de algodón y exponga el hueso del cráneo. Deje que el cráneo se seque durante aproximadamente 1 minuto.
4. Identifique los puntos de referencia anatómicos, Lambda, Bregma y sutura medial. Con el taladro instalado en el marco estereotáctico, coloque la punta del taladro en el Bregma como punto de partida. Mueva 2 mm más atrás desde el Bregma y mueva ~ 2,4 mm lateralmente a la sutura medial.
5. Perfore un orificio de 0,5 mm de diámetro para el catéter en esta posición. Sople suavemente cualquier polvo de hueso.
   NOTA: Es importante que la duramadre permanezca intacta durante la perforación. Para garantizar esto, 1) use un taladro que se pueda instalar en el marco estereotáctico, 2) inspeccione el orificio con frecuencia durante la perforación y 3) profundice en pequeños pasos: si se aplica demasiada presión al cráneo, la punta del taladro continuará y dañará el cerebro cuando el cráneo esté completamente penetrado.
6. Perfore 3 orificios adicionales (~ 1,3 mm de diámetro) para los tornillos de anclaje a unos pocos milímetros del primer orificio. Sople suavemente el polvo de hueso.
   NOTA: Seleccione las ubicaciones de los tornillos de anclaje que proporcionen suficiente espacio para la parte superior del catéter (~ 2 mm de diámetro) y las tapas del tornillo de anclaje (~ 1 mm).
7. Retire el polvo óseo mediante irrigación con alrededor de 1 a 2 ml de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) o solución salina fisiológica con una jeringa. Limpie el cráneo. Apriete los tornillos de anclaje de 2 a 3 vueltas completas.
   NOTA: Los tornillos de anclaje son necesarios para estabilizar la configuración manteniendo el cemento dental y, por lo tanto, el catéter, en su lugar. Mientras aprieta un tornillo de anclaje, asegúrese de que no sea fácilmente extraíble levantándolo suavemente hacia arriba con forrceps. Dado que la implantación del catéter en sí misma causa un traumatismo tisular, una lesión adicional durante la perforación o el apriete de los tornillos de anclaje conducirá a múltiples lesiones traumáticas y posiblemente dificultará la comparabilidad dentro de un grupo. Apriete primero los tornillos de anclaje e inserte el catéter en último lugar.
8. Inserte el catéter de 2 mm de longitud a través del primer orificio, perpendicular a la superficie del cráneo. Mientras mantiene el catéter, aplique un poco de cemento dental y déjelo polimerizar con una breve exposición (~ 5 s) a la luz de curado dental para estabilizar el catéter, permitiendo el uso de ambas manos en el siguiente paso.
   PRECAUCIÓN: Mientras trabaje con una luz de curado dental, evite mirar directamente a la punta o a la luz reflejada desde el área de aplicación, ya que la alta intensidad de esta luz puede causar daño en la retina. Use gafas protectoras adecuadas.
9. Aplique más cemento dental alrededor del catéter, ancle los tornillos y solidifique el cemento dental con la luz de curado dental (~ 15 - 30 s). Confirme el endurecimiento del cemento con la punta de unas fuerceps.

4. Cierre de la herida y antagonización de la anestesia

1. Cierre la piel de la cabeza con suturas reabsorbibles, anteriores y posteriores al catéter.
   NOTA: Dado que habrá una configuración irregular sobre el cráneo al final de la implantación, cierre la herida en consecuencia. Levantar demasiado la piel resultará en incomodidad para el animal.
2. Inyecte la mezcla de antídoto por vía subcutánea (1,5 ml/kg de peso corporal) utilizando una jeringa de 1 ml con una aguja de 26 G.
3. Administrar enrofloxacina (2,5%) mediante inyección subcutánea (7,5 mg/kg de peso corporal) para el tratamiento antibiótico profiláctico. Administrar carprofeno (1 mg/ml; 5 mg/kg de peso corporal) y buprenorfina (1,2 mg/kg) para aliviar el dolor mediante inyección subcutánea.

5. Cuidados postoperatorios y medicación

1. Devolver al animal a la jaula modificada y mantenerlo en observación durante 1 - 3 h, con una aplicación de luz infrarroja para evitar la hipotermia. Observar y reposicionar constantemente al animal cada 5 a 10 minutos hasta la recuperación postoperatoria. Tenga especial cuidado para evitar la exposición constante a la luz de los ojos hasta la recuperación.
2. Repetir las administraciones de enrofloxacina (7,5 mg/kg de peso corporal) y carprofeno (1 mg/ml; 5 mg/kg de peso corporal) mediante inyecciones subcutáneas el día después de la cirugía. La buprenorfina no es necesaria para ser refrescada ya que el tratamiento anterior es efectivo durante 72 horas.

6. Preparación de la mezcla de inmunización (como muy pronto 14 días después de la implantación del catéter)

Nota: Coloque las jeringas sobre hielo durante el procedimiento de preparación.

1. Conecte dos jeringas de vidrio luer de punta de bloqueo Luer de 10 ml a los brazos cortos de una llave de paso de 3 vías y cierre la tercera salida con el brazo largo.
2. Asegúrese de que las conexiones sean seguras y sin fugas: agregue aproximadamente 4 ml de PBS estéril a la jeringa abierta mientras sostiene el pistón 2. Inserte el pistón 1 y empuje ambos pistones hacia adelante y hacia atrás mientras comprueba si hay fugas. Si no se produce ninguna fuga, deseche el PBS y retire el pistón 1 de nuevo.
3. Pipetear 1 ml de IFA y 50 μg de rMOG_1-125 juntos y ajustar la mezcla a un volumen final de 2 ml con PBS estéril (pH 7.4) en un tubo adecuado.
   NOTA: Debido a pérdidas de emulsión en las puntas o paredes de las jeringas durante la preparación, prepare un volumen mayor que el previsto para la administración. Es igualmente más práctico prepararse para más de 1 animal a la vez.
4. Coloque la mezcla diluida de IFA y rMOG_1-125 en la jeringa abierta. Inserte el pistón suavemente mientras mantiene una presión suelta sobre el pistón opuesto (Figura 3A).
5. Emulsionar el inóculo conduciendo de una jeringa a la otra empujando los pistones hacia adelante y hacia atrás, hasta que quede blanco y viscoso (Figura 3B).
6. Fije una jeringa de bloqueo Luer de 1 ml en el brazo corto abierto de la llave de paso de 3 vías y llénelo con inóculo (Figura 3C). Distribuya todo el inóculo a jeringas de 1 ml. Manténgalo en hielo hasta la inyección. Administre la mezcla el día de la preparación.

7. Inmunización

1. Anestesiar a la rata con isofluorano en una cámara (~ 2 min, mezclado con oxígeno 2 L / min) y luego mantener la anestesia a través de una máscara (mezclado con oxígeno 1.5 L / min).
2. Inyecte 200 μL de inóculo por vía subcutánea en la base de la cola con una aguja de 21 G.
   NOTA: Administre la inyección lentamente ya que la solución es viscosa.

8. Determinación de títulos de anticuerpos

1. Retire ~ 200 μL de sangre 4 semanas después de la inmunización para determinar los títulos de anticuerpos anti-MOG.
2. Cubra los pozos de una placa de 96 pozos con MOG (5 μg/mL en PBS) e incube durante 1 h a 37 °C.
3. Bloquee la placa con albúmina sérica bovina (BSA) al 1% en PBS durante 1 h a temperatura ambiente.
4. Incubar la placa con suero de rata (1:50) y estandarizarla durante 2 h a 37 °C. Lavar la placa 3x con 200 μL de PBS/Polisorbato 20.
5. Incubar la placa con anticuerpo secundario IgG antirata conjugado con peroxidasa de rábano picante (1:10.000). Lavar la placa 3x con 200 μL de PBS/Polisorbato 20.
6. Agregue 100 μL de solución de sustrato de peroxidasa por pozo e incube durante 20 a 30 min en la oscuridad a temperatura ambiente.
7. Mida la densidad óptica a una longitud de onda de 405 nm y calcule el título de anticuerpos a partir de la densidad óptica utilizando una curva estándar.

9. Inyección de citoquinas intracerebrales

1. Ajuste la longitud de la cánula del conector (2 mm). (Consulte la Figura 4 para conocer los pasos de preparación).
2. Llene una jeringa de 1 ml con la mezcla de citoquinas (500 ng/μL de TNF-alfa, 300 U/μL de IFN-gamma recombinante de rata en PBS estéril). Conecte la jeringa a una cánula conectora. Llene la cánula con la mezcla de citoquinas. Evite las burbujas.
3. Monte la jeringa en la bomba de jeringa programable y programe para inyectar 0,2 μL/min (Figura 5A). Encienda la bomba y manténgala funcionando para evitar la formación de burbujas de aire en la punta de la cánula.
   NOTA: La velocidad de inyección debe tener en cuenta el diámetro interior de la jeringa específica utilizada; por lo tanto, el diámetro de la jeringa debe registrarse durante la configuración de la bomba.
4. Anestesiar a la rata con isoflurano en una cámara (~2 min, mezclado con 2 L/min de oxígeno) y luego sostener la anestesia a través de una máscara (mezclada con 1.5 L/min de oxígeno)(Figuras 5B y 5C). Aplique gotas lubricantes para los ojos ya que el animal será anestesiado durante al menos 30 minutos.
5. Retire la tapa del catéter con la entrada. Inserte la cánula del conector en el catéter y atornille y apriete (Figuras 5D y 5E).
   NOTA: No lo ataque demasiado, ya que esto destruirá la punta superior del catéter.
6. Deje que la inyección continúe durante 10 minutos (el volumen total de inyección es de 2 μL). Detenga la bomba. Deje la cánula dentro del catéter durante 20 minutos para permitir que el volumen inyectado se difunda por completo.
7. Desenrosque la cánula del conector y retírela lentamente para evitar un efecto de vacío.
8. Vuelva a colocar la tapa del catéter con la entrada y atornille. Permita que el animal se recupere de la anestesia en una jaula.

Resultados

La desmielinización cortical podría evaluarse en diferentes puntos temporales después de una inyección de citoquinas por inmunohistoquímica para la proteína proteolipídica (PLP) (Figura 6). La Figura 6A muestra inmunorreactividad PLP intacta en el día 15 en un animal de control inmunizado con MOG que recibió solo PBS estéril a través del catéter implantado. El día 1 después de la inyección de citoquinas, la desmielinización ya se pudo detectar en animales preparados con MOG, aunque solo en las inmediaciones del área cateterizada(Figura 6B). La inmunorreactividad PLP permanece intacta en la corteza contralateral 1 día después de la inyección de citoquinas. En el día 3, se pudo observar un aumento gradual en la pérdida de la inmunorreactividad PLP, que se propaga en la corteza ipsilateral(Figura 6C). La desmielinización cortical contralateral también podría detectarse en el día 3(Figura 6D),pero está bastante restringida al área debajo de los tornillos de anclaje, posiblemente debido a un área de bajo flujo de líquido intersticial causada por los tornillos de anclaje⁴³. La ausencia de una observación similar en los animales de control inyectados por PBS excluye la posibilidad de desmielinización inducida por traumatismo derivada del tornillo de anclaje.

Entre los días 9 y 15, la desmielinización afecta a grandes partes de la corteza de ambos hemisferios(Figuras 6E, 6Fy 6G). Esto coincide con una observación de comportamiento lento, aunque sin una disminución estadísticamente significativa de las habilidades motoras en una prueba de rotarod⁴³. La desmielinización cortical se mantiene hasta 30 días después de la inyección de citoquinas en ambos hemisferios(Figuras 6H y 6I)con solo una remielinización parcial. La Figura 6J muestra una cuantificación de la pérdida de PLP en la materia gris cortical después de la inyección de citoquinas intracerebrales. Cabe señalar que la inmunorreactividad de PLP aún no se ha evaluado después de períodos superiores a 30 días; por lo tanto, la resolución instantánea de la remielinización, si la hay, aún no se evaluará mediante una mayor experimentación. Una segunda administración de mezcla de citoquinas a través del catéter implantado 30 días después de la primera inyección da como resultado una marcada atrofia cerebral en el día 15(Figura 7).

Figura 1: Preparación del catéter. (A y B) La cánula guía y la cánula ficticia (tapa del catéter con entrada) se ensamblan y atornillan. (C) Luego el catéter se corta a 2 mm de tamaño con la ayuda de un bisturí. La observación microscópica mostró que el uso de tijeras para ese propósito distorsiona la forma circular de la punta de la cánula y, por lo tanto, debe evitarse. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: La implantación del catéter. (A) La cirugía comienza con una incisión longitudinal y la extracción del periostio. (B, C) Este panel muestra el marcado del lugar para el catéter a 2 mm posterior de Bregma y 2,4 mm lateral a la derecha de la sutura sagital; así como los lugares para los orificios destinados a los tres tornillos de anclaje con una distancia adecuada del catéter y Lambda. (D) Después de perforar el orificio del catéter (un diámetro de 0,5 mm, con una punta de taladro redonda) y los orificios para los tornillos de anclaje (1,3 mm de diámetro con una punta de taladro trenzada), los tornillos de anclaje se aprietan. (E, F) Luego se inserta el catéter y se estabiliza toda la configuración con cemento dental polimerizante. (G) La herida se sutura con dos o tres nudos anteriores y posteriores al catéter. B = Bregma; L = Lambda; C = Catéter; S1, S2 y S3 = lugares para los orificios de los tres tornillos de anclaje. Las barras de escala = 1 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Preparación de la emulsión rMOG/IFA. (A) La mezcla de rMOG, PBS e IFA se emulsiona presionando el inóculo de una jeringa a otra empujando los pistones hacia adelante y hacia atrás, (B) hasta que esté blanco y viscoso. (C) Posteriormente, el inóculo se distribuye a jeringas de 1 ml para la inyección. 5 μg de rMOG se utiliza en 200 μL de mezcla de PBS/IFA para inmunizar subclínicamente a una rata; sin embargo, debido a las pérdidas en las puntas y paredes de las jeringas durante la preparación, se debe preparar un volumen mayor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Preparación de la cánula del conector. (A - D) Estos paneles muestran cómo se ensamblan un conector y un interno con una cánula guía de plantilla de tamaño 2 mm. (E) El interior se corta al mismo tamaño que la cánula guía con la ayuda de un bisturí (F) y la guía de la plantilla se desenrosque. (G) El otro extremo de la cánula del conector se fija a una jeringa de 1 ml, que contiene la mezcla de inyección, con una aguja de 20 G. Las barras de escala = 3 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Inyección intracerebral. (A) Se ajusta una bomba de jeringa programable para una velocidad de inyección de 2 μL/min, y la jeringa de 1 ml llena de mezcla de citoquinas (o PBS estéril para los controles) se monta en la bomba. (B) El animal es anestesiado primero en la cámara usando isoflurano al 5% con un flujo de oxígeno de 2 L/min y luego (C) la anestesia se sostiene a través de la máscara usando isoflurano al 2.5% con un flujo de oxígeno de 1.5 L/min. (D) La tapa del catéter con la entrada (la cánula ficticia) se atornilla y la cánula de inyección se inserta a través del catéter implantado. Dado que el volumen de la inyección es muy pequeño, el investigador debe tener cuidado para evitar burbujas de aire en la punta de la cánula. Por esa razón, es importante iniciar la inserción mientras la bomba está en funcionamiento y solo cuando hay una burbuja líquida creciente en la punta. El volumen adicional no entrará en el cerebro de todos modos, ya que se descompone en la parte superior del catéter antes de la inserción. (E) Luego se aprieta la cánula del conector y se deja que la bomba funcione durante 10 minutos. Después de 10 minutos de inyección, la bomba se detiene y la cánula se deja en el interior durante 15 a 20 minutos para permitir la difusión del volumen inyectado al líquido intersticial. Las barras de escala = 5 cm, a menos que se indique lo contrario. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Inmunorreactividad PLP en secciones cerebrales coronales. (A) Este panel muestra un cerebro de control (MOG-primed) con una inyección de PBS (día 15), que no resulta en una desmielinización cortical. (B) Ya en el día 1 después de la inyección de citoquinas, la desmielinización es evidente en el área del catéter. (C) Se observa una pérdida más amplia de inmunorreactividad de PLP en la corteza ipsilateral en el día 3, (D), así como en el lado contralateral. Se observa una pérdida generalizada de inmunorreactividad PLP en ambos hemisferios en el día 15, ya que (E) este panel muestra la corteza ipsilateral y (F) este panel muestra la corteza contralateral. (G) Se da una visión general de ambos hemisferios para mostrar la pérdida generalizada de PLP en el día 15. En el día 30, como (H) este panel muestra la corteza ipsilateral y (I) este panel muestra para la corteza contralateral, todavía hay una notable desmielinización, pero también se podrían observar algunas áreas remielinizadas. (J) Este panel muestra la cuantificación de la desmielinización (pérdida de PLP en mm²/hemisferio). Se utilizaron secciones cerebrales coronales de 1,5 - 2 μm para la detección de PLP con MS anti-PLP con un factor de dilución de 1:500. Las secciones fueron contrateñidas con hematoxilina para los núcleos celulares. Para obtener información detallada sobre la inmunohistoquímica, ver Ucal et al. ⁴³. Los paneles G y J fueron modificados de Ucal et al. ⁴³. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Atrofia cerebral después de la segunda inyección de citoquinas. (A) Este panel muestra un cerebro de control (MOG-preparado) con una inyección de PBS (día 15). (B) En el día 15 después de la primera inyección de citoquinas, una segunda inyección conduce a la atrofia cerebral dentro de los 15 días. Se utilizaron secciones cerebrales coronales de 1,5 - 2 μm para la detección de PLP con MS anti-PLP con un factor de dilución de 1:500. Las secciones fueron contrateñidas con hematoxilina para los núcleos celulares. Para obtener información detallada sobre inmunohistoquímica, ver Blakemore³⁷. Las barras de escala = 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Jaulas modificadas para evitar la extracción del catéter por parte del animal. En las jaulas estándar, el espacio del soporte de alimentos en la rejilla se encuentra más cerca del fondo de la jaula, creando un espacio estrecho y arriesgado que aumenta la posibilidad de que el catéter se enrede con la rejilla y, por lo tanto, su eliminación. Para evitar esto, la jaula tiene que ser modificada. Este espacio estrecho estaba bloqueado con un plano transparente, lo que permitía la observancia del animal. La comida tiene que ser dada dentro de la jaula en estas jaulas modificadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Nuestro método utiliza ratas DA. La adaptación a ratones probablemente requerirá el uso de un catéter y tornillos más pequeños. También debe tenerse en cuenta que el curso de la enfermedad, la respuesta inflamatoria y el grado de desmielinización pueden diferir de lo que se presenta aquí si se utiliza una especie / cepa diferente. Tales diferencias se han observado con modelos clásicos de EAE utilizando diferentes cepas de ratones. MOG_92-106 de origen rata, por ejemplo, dio lugar a EAE progresiva primaria o secundaria progresiva en ratones A.SW, mientras que indujo EAE remitente-recurrente en ratones SJL/J⁴⁶. Por lo tanto, deben utilizarse animales de la misma cepa. Las diferencias de género en la manifestación de EAE también han sido reportadas en diversos estudios previos²⁴. La ocurrencia de tales efectos de género bien podría esperarse para el protocolo descrito aquí, pero aún no se ha validado en experimentos posteriores.

Para la intervención quirúrgica se utiliza la administración intraperitoneal (IP) de una mezcla de anestésicos que comprende 0,02 mg/ml de fentanilo, 0,4 mg/ml de midazolam y 0,2 mg/ml de medetomidina. Las ratas DA macho adultas que pesan 270 - 300 g requieren alrededor de 0.4 - 0.6 mL de esta mezcla(es decir,~ 1.5 mL / kg) para inducir una anestesia que dura de 60 a 90 min. Después de la cirugía, la anestesia se antagoniza mediante una inyección subcutánea de un antídoto que comprende 0,07 mg/ml de flumazenil y 0,42 mg/ml de atipamezole en solución salina fisiológica (NaCl al 0,9%). Una dosis de 1 - 1,5 ml/kg antagoniza la anestesia en 5 min. Alternativamente, se puede permitir que los animales se despierten espontáneamente después de un lavado fisiológico de los anestésicos, pero en ese caso, los animales tendrían que mantenerse bajo observación hasta que estén completamente conscientes.

Otras opciones de anestesia utilizadas con frecuencia para cirugías en animales, como una inyección IP de ketamina y xilazina⁴⁷ o pentobarbital^{de sodio 48,}o una inhalación de anestésicos volátiles como isofluorano⁴⁹ y halotano^50,también se pueden considerar para la cirugía presentada aquí. Sin embargo, es fundamental elegir un agente anestésico que no interfiera con la(s) intervención(es) posterior(es) prevista(s).

Durante la inmunización y la inyección de citoquinas intracerebrales, se utiliza isoflurano al 5% para la anestesia. El modelo descrito aquí se estableció utilizando ratas, y los detalles experimentales enumerados son, por lo tanto, específicamente aplicables a la rata. Se seleccionaron las coordenadas de implantación del catéter para permitir el análisis simultáneo de posibles cambios en la materia blanca (la punta del catéter en el cuerpo calloso). Si bien el sitio de inserción del catéter se puede variar con respecto a la posición anteroposterior y lateral, la selección del surco central requiere evitar daños en el seno sagital superior.

Otra característica del método descrito es la desmielinización equivalente de los hemisferios ipsi y contralateral, posiblemente resultante del transporte de la mezcla de citoquinas inyectada al espacio subaracnoideo por el flujo fisiológico del líquido intersticial desde las regiones corticales⁵¹. El modo de inyección, y no la ubicación del catéter, por lo tanto, causa desmielinización en toda la corteza cerebral, y la elección de la corteza parietal derecha o izquierda debería, por lo tanto, ser irrelevante a este respecto.

El protocolo utiliza un catéter de 26 G, que es lo suficientemente pequeño como para evitar una lesión traumática extensa y lo suficientemente grande como para evitar una mayor tasa de obstrucción de la punta del catéter durante el largo curso del experimento. Ciertamente, la implantación y la presencia del catéter en sí causan una activación astrocítica y microglial, también en los animales de control que reciben solo la implantación del catéter; sin embargo, esto es menor en comparación con los animales inyectados con citoquinas. ⁴³ Para evitar cualquier interferencia con los análisis posteriores, se utilizaron catéteres compatibles con IRM hechos de poli-éter-éter-cetona (PEEK).

Una profundidad similar de desmielinización se crea, de hecho, tanto en las regiones ipsi- como en las contralaterales con el método presentado. Esto implica que la profundidad / longitud del catéter podría no desempeñar un papel importante en el patrón y la extensión de la desmielinización en la corteza. Por lo tanto, se podría considerar una modificación de la longitud del catéter para reducir el tamaño de la lesión inducida por el catéter. Sin embargo, una longitud de catéter significativamente más corta podría causar una desmielinización cortical ligeramente menos pronunciada, mientras que una respuesta concluyente solo se obtendría mediante experimentos que prueben específicamente la longitud del catéter.

Una ventaja del modelo es que el catéter implantado permite la prueba de posibles terapias administradas a la corteza a través del catéter para permitir la remielinización en o después del pico de desmielinización cortical histológicamente detectable (día 15 o posterior), mientras que en un entorno previo al tratamiento esto sería después de la inmunización pero antes de la inyección de citoquinas. La decisión sobre el marco de tiempo en el que se administrarían las terapias, por lo tanto, dependerá de la pregunta de investigación particular y del medicamento de interés.

Después de la implantación del catéter, es importante alojar a los animales individuales en las jaulas modificadas (preferiblemente de arriba alta) para evitar la extracción del catéter hasta el final del estudio (Figura 8). Los animales también pueden desenroscar la tapa del catéter con la entrada, aunque esto rara vez sucede. Los animales deben ser observados diariamente y las tapas retiradas deben reemplazarse por otras nuevas, para evitar la obstrucción de la punta del catéter en ausencia de una entrada y para garantizar una entrega precisa en el parénquima después de la inyección intracerebral. Los animales son inmunizados a las 2 semanas más tempranas después de la implantación del catéter para permitir la curación y el cierre de la barrera hematoencefálica.

Los títulos de anticuerpos anti-MOG séricos deben medirse después de la inmunización. Un experimento de dosis-respuesta mostró que 5 μg de MOG_1-125 (en IFA) proporcionaron suficiente inmunización dentro de las 4 semanas en ratas DA macho adultas. Un título de 5.000 μg/mL o superior sería suficiente, pero sin duda dependerá de varios factores, incluida la preparación de MOG y la cepa animal y, por lo tanto, tendrá que determinarse individualmente. Es importante evitar dosis excesivamente altas de antígeno que potencialmente resulten en un fenotipo clásico de EAE con extremidades posteriores paralizadas incluso antes de la inyección de citoquinas.

Cada animal está inmunizado con 5 μg de glicoproteína oligodendrocitos de mielina recombinante (rMOG_1-125)emulsionada en 200 μL de adyuvante de Freund incompleto (IFA). Dado que parte de la emulsión se pierde dentro de la jeringa durante la preparación, es aconsejable preparar más de esta cantidad para cada animal. Se utilizó MOG recombinante (1-125 del N-terminal de MOG de rata), que se expresó en Escherichia coli y luego se purificó hasta la homogeneidad mediante cromatografía de quelato, se disolvió en 6 M de urea y se dializó contra PBS para obtener una preparación fisiológica^52,53. Sin embargo, también se puede utilizar MOG disponible comercialmente.

Otras preparaciones de antígenos, como MOG_1-116,MOG_35-55 o PLP_139-151 se utilizan en varios modelos eaE, y se sabe que las diferencias de antígenos y cepas animales inducen fenotipos de enfermedades distintos en estos modelos²⁰. Estas preparaciones de antígenos no se probaron en ratas DA y, si se usan con preferencia a rMOG_1-125,podrían inducir un fenotipo de enfermedad o resultados histológicos diferentes de lo que se presenta aquí.

Se prepara una cánula conectora de la misma longitud que el catéter antes de la inyección intracerebral. Esto se puede hacer ensamblándolo con un catéter modelo y cortándolo al mismo tamaño (2 mm de longitud) (Figura 4). Es importante que la cánula del conector esté libre de burbujas de aire durante la inyección de citoquinas, debido a que el volumen de inyección es de solo 2 μL, incluso una pequeña burbuja de aire en la punta de la cánula reducirá significativamente el volumen del líquido entregado con éxito al cerebro. Esto se logra manteniendo la bomba en funcionamiento e insertando la cánula solo cuando hay una gota creciente de líquido de inyección presente en la punta. Después de la inserción de la cánula, el conector se atornilla al catéter evitando el endurecimiento excesivo para no dañar la punta superior del catéter, lo que dificultará la recapitulación después de la inyección. Se utiliza una velocidad de inyección de 0,2 μL/min para evitar traumatismos inducidos por inyección. Además, una inyección lenta, combinada con un período de espera de 20 minutos después de la inyección, asegura la difusión del líquido inyectado en el líquido intersticial y un drenaje efectivo en el LÍQUIDO CEFA. La cánula se retira lentamente para evitar un efecto de vacío.

El método informado incluye intervención quirúrgica y, por lo tanto, requiere personal capaz de realizar cirugía estereotáctica de supervivencia. El personal en contacto directo con los animales debe haber tomado los cursos de experimentación animal apropiados. El resto del protocolo puede ser llevado a cabo por miembros competentes del laboratorio.

El método está destinado a producir desmielinización desencadenada por la inflamación de la corteza cerebral y no reproduce todas las características de la EM humana(por ejemplo,la aparición de lesiones inflamatorias focales de la materia blanca, que es un sello distintivo de la EM humana).

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adult male Dark Agouti rats (300 ±25 g)
Fentanyl	Hameln pharma plus, Germany		as Fentanyl-Citrate, 50 µg/ml
Midazolam	ERWO Pharma, Austria	50039017	5 mg/ml
Medetomidin	Orion Pharma, Finland		as Medetomidin hydrochloride, 1mg/ml
Flumazenil	Roche, Switzerland		0.1 mg/ml
Atipamezol	Orion Pharma, Finland		as Atipamezol hydrochloride, 5 mg/ml
10% povidone-iodine complex	Mundipharma, Austria
Dental cement	Heraeus Kulzer, Germany	6603 7633
Physiological saline solution	Fresenius Kabi, Austria		0.9% NaCl
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich, Germany	P3813
Isofluorane	AbbVie, Austria
Lubricating eye drops	Thea Pharma, Austria
70% EtOH	Merck, Germany	1070172511	Absolute ethanol was diluted in ddH2O for preparation of 70% v/v
2.5% enrofloxacin	Bayer, Germany		Prophylactic antibiotics
carprofen	Pfizer, USA		Painkillers, 50 mg/ml
Tween-20	Sigma-Aldrich, Germany	P9416
Pentobarbital	Richter Pharma, Austria		pentobarbital sodium, 400 mg/ml
Interferon gamma	PeproTech, USA	400-20
Tumor necrosis factor alfa	R&D Systems, USA	510-RT-050/CF
rMOG1-125	own product at the Centre of Molecular Medicine, Karolinska Institute, Sweden		Recombinant rat myelin oligodendrocyte glycoprotein, amino acids 1-125 from the N-terminus, also commercially available: AnaSpec, AS-55152-500, USA
Anti-MOG antibody	Ana Spec/Kaneka Corporation, Japan	AS-555157	Standard from ELISA-Kit; Ana Spec/Kaneka
Incomplete Freund’s adjuvant	Sigma-Aldrich, Germany	F5506
Horse radish peroxidase conjugated anti-rat IgG secondary antibody	Ana Spec/Kaneka Corporation, Japan	AS-555157	Secondary Antibody from ELISA-Kit; Ana Spec/Kaneka Corporation
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich, Germany	A9576
Peroxidase substrate solution	Vector Laboratories, USA	SK-45000
Stereotactic frame	David Kopf Instruments, USA
Catheters, MRI suitable	PlasticsOne, USA	8IC315GPKXXC
Dummy cannulas	PlasticsOne, USA	8IC315DCNSPC
Plastic screws, MRI suitable	PlasticsOne, USA	8L080X093N01
Connector cannula	PlasticsOne, USA	8IC313CXSPCC
Screw driver with 2mm tip-size
Drill with flexible shaft extension	Proxxon, Germany	NO 28 472, NO 28 706, NO 28 620,
Drill bit, round, 0.5 mm	Hager & Meisinger, Germany	REF310 104 001 001 009
Drill bit, twisted, 1.3 mm	Hager & Meisinger, Germany	REF350 104 417 364 013
Scalpel	Braun, Germany	BB510
Scalpel handle	Fine Science Tools, Germany	91003-12
Cotton tip applicator	Henry Schein Medical, Austria	900-3155
Surgical scissors	Fine Science Tools, Germany	14101-14, 14088-10
Surgical forceps	Fine Science Tools, Germany	11002-12, 11251-35
Bulldog clamps	Fine Science Tools, Germany	18050-35
Homoeothermic blanket	TSE systems, Germany
Infrared Lamp	Beurer, Germany	616.51
Dental curing light	Guilin Woodpecker Medical, China
Absorbable suture	Johnson & Johnson, Belgium	V792E
Programmable syringe pump	World Precision Instruments, USA	AL-1000
Exam gloves
Surgical gown
Electric Shaver	Aesculap, Germany	GT420
Volatile anesthetic vaporizer	Rothacher Medical, Switzerland	CV 30-301-D
Oxygen source for volatile anesthetic vaporizer	Air Liquide, Austria	19,113
Volatile anesthesia chamber	Rothacher Medical, Switzerland	PS-0347
Anesthesia mask for rats	Rothacher Medical, Switzerland	PS-0307-A
1 ml syringe	Codan, Denmark	REF 62.1612
26 Gauge needle for injection	Braun, Germany	4657683
20 Gauge needle for cytokine injection and immunization	Braun, Germany	4657519
Luer lock tip glass syringes	Poulten & Graf, Germany	7.140-37
3 way stopcock	Becton Dickinson, Sweden	394600
96-well plate	Thermo Fisher Scientific, USA	442404
Plate reader	Cole-Parmer, USA	EW-1396-00
37°C incubator	Kendro, Germany	50042301
Micropipettes	Gilson, USA	F167350