3 dimensiones (3D)-impreso la plantilla para alto rendimiento embrión de pez cebra matriz

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para diseñar y fabricar un embrión de pez cebra colocar plantilla, seguido de un procedimiento detallado sobre el uso de dicha plantilla para alto rendimiento embrión de pez cebra colocar en una placa de 96 pocillos.

Resumen

El pez cebra es que un organismo reconocido a nivel mundial de agua dulce utilizadas en Biología del desarrollo, toxicología ambiental y enfermedades humanas campos de investigación relacionados. Gracias a sus características únicas, incluyendo gran fecundidad, translucidez del embrión, desarrollo rápido y simultáneo, etc., embriones de pez cebra se suelen utilizar para la evaluación de la toxicidad de gran escala de sustancias químicas y drogas/compuesto proyección. Un procedimiento típico de proyección implica el desove del pez cebra adulto, la selección de embriones y colocar los embriones en placas de varios pocillos. A partir de ahí, los embriones son sometidos a la exposición y la toxicidad del producto químico, o puede evaluar la eficacia de los compuestos de drogas relativamente rápidamente en base a observaciones fenotípicas. Entre estos procesos, colocar los embriones es uno de los pasos más desperdiciador de tiempo y mano de obra intensiva que limita el nivel de rendimiento. En este protocolo, presentamos un enfoque innovador que hace uso de una plantilla de arraying impreso en 3D junto con vacío manipulación para acelerar este paso laborioso. El protocolo en el presente documento describe el diseño general de la plantilla arraying, una configuración experimental detallada y paso a paso, procedimiento por resultados representativos. Cuando se implementa, este enfoque resulta beneficioso en una variedad de aplicaciones de la investigación con embriones de pez cebra como sujetos de prueba.

Introducción

Como un organismo modelo popular, el pez cebra es ampliamente utilizado en los campos de la medicina y toxicología^1,2,3,4. Comparado con plataformas en vitro , pez cebra ofrecen mucho mayor complejidad biológica que uno o dos tipos de la célula no podrían ofrecer. Además de ser un organismo modelo de pez cebra gran fecundidad, desarrollo embrionario rápido y simultáneo y órgano alta translucidez han dado este ventajas únicas del modelo a utilizar para toxicidad de gran escala o detección de⁵drogas/compuesto. Los cientos de embriones producidos por un par de pez cebra adulto cada semana superan otros modelos todo animales y han hecho conveniente para el cribado de alto rendimiento.

Un procedimiento típico de proyección utilizando el pez cebra implica una cantidad significativa de trabajo manual, como el pez cebra adulto desove, selección de embriones y colocar los embriones en recipientes adecuados donde son sometidos a la exposición a través de la inmersión en agua. Se monitorea el desarrollo de los embriones y extremos observables como anormalidad, incubabilidad y mortalidad a menudo son evaluados manualmente y utilizados como la identificación preliminar de la toxicidad de productos químicos o las indicaciones de la efectividad de drogas o compuestos. Para acelerar el procedimiento de investigación, enfoques como la proyección de imagen automatizada y análisis de imagen asistida por computador han sido explorados previamente. Por ejemplo, microscopios con alto contenido de capacidades de la proyección de imagen han sido adaptados para realizar automatizado campo brillante o proyección de imagen de fluorescencia en embriones de pez cebra en las distintas etapas del desarrollo de placas de 96/384 pozos⁶. Dispositivos microfluídicos juntados con microscopios fueron utilizados para colocar las larvas de pez cebra a través de la manipulación actual de proyección de imagen de cerebro neuronas⁷. Estos enfoques podrían mejorar significativamente la eficiencia de adquisición de imagen en comparación con la tradicional operación manual. Por otra parte, con gran cantidad de imágenes generadas, herramientas de análisis de imagen también se han desarrollado para acelerar el procesamiento de datos, según lo demostrado por Liu et al. y Tu et al. ^{8 , 9}.

A medida que aumenta el nivel de rendimiento de análisis de imagen y proyección de imagen, se hizo evidente que el paso de limitación de velocidad para la investigación se encuentra en el proceso de preparación de embriones de pez cebra para la exposición, que por lo general significa colocar en placas de 96 o 384 pocillos. Para resolver este paso cuello de botella, guiada por la visión robótica fueron desarrollados por Mandrell et al. ¹⁰ y nos¹¹ anteriormente para reemplazar la manipulación manual pero los instrumentos eran bastante sofisticados y hay una profunda curva de aprendizaje para implementar dichas técnicas. Por lo tanto, para proporcionar un enfoque de fácil uso se convierte en un factor importante para mejorar el nivel de rendimiento de la detección de pez cebra y es el principal objetivo de este trabajo.

En este trabajo, hemos diseñado y había fabricado un embrión colocar plantilla de impresión 3D. Una plantilla así de arraying fue diseñada para atrapar el embrión de pez cebra en pozos que se ajustan a una estándar placa de 96 pocillos. En lugar de embriones para seleccionar y colocar en cada pozo uno por uno, uno podría realizar matriz y atrapamiento de embrión 96 todos los embriones en una placa multicapa a la vez. Utilizando esta plantilla y el protocolo siguiente, uno podría aumentar significativamente la eficacia de colocar los embriones en placas multicapa, que en término de impulso por lo menos diez veces, la capacidad de detección en comparación con operación manual. El protocolo que se describe a continuación incluye un diseño global para colocar la plantilla, el desove del pez cebra, colección embrionaria y matriz. La figura 1 muestra el diseño general de la plantilla arraying. La figura 2 muestra un resumen del protocolo paso a paso sobre el uso de la plantilla descrita en las partes 3 y 4.

Protocolo

1. diseño y fabricación de un embriones de pez cebra colocar plantilla

1. Diseño de la plantilla de arraying con un 12 por 8, diseño de 96 pocillos que se ajusta a una estándar placa de 96 pocillos. Uso las dimensiones listadas en la figura 1A para la cámara de captura superior del embrión (véase también el archivo suplementario).
   1. Utilice las dimensiones que se muestra en la figura 1B y 1D para la captura del bien.
   2. Utilice las dimensiones en la figura 1 para la cámara de vacío de fondo.
   3. Utilizar las dimensiones en la figura 1B para el aire / salida.
2. Utilice una impresora 3D (con precisión de 0,1 mm) para imprimir la plantilla; Véase Tabla de materiales para resina recomendada para ser utilizado para la impresión.
   Nota: las impresoras 3D con una precisión de 0,1 mm se recomiendan para la fabricación de la plantilla arraying (véase Tabla de materiales). El color sugerido para la superficie de la plantilla es gris oscuro o negro.

2. pez cebra embrión de desove

1. Colocar dos pares de peces machos y hembras por apareamiento caja un día antes del desove. Separados machos y hembras por un divisor de plástico transparente.
2. Sacar los separadores en la mañana para mezclar peces macho y hembra.
3. Quite los pescados masculinos y femeninos y recolectar embriones de pez cebra con un colador de malla fina. Lave los embriones con huevo 250 mL de agua (véase Tabla de materiales).
4. Transferencia de los embriones colectados a cajas Petri (90 mm de diámetro) con solución de Holtfreter (véase Tabla de materiales) y eliminar embriones muertos y no fecundados con un estereomicroscopio.
5. Coloque los embriones en una incubadora de 28,5 ° C. A las 4 h post fertilización (hpf), observar los embriones y eliminar cualquier embriones muertos e insalubres. Los embriones están listos para el siguiente paso.

3. preparación de colocar plantilla

1. Lave la plantilla de 2 a 3 veces con 500 mL de agua desionizada y ponerlo en el horno de secado (45 ° C) durante 5 minutos.
2. Cinta de la cámara inferior con un trozo de película (figura 2paso 1).
3. Conecte una bomba de vacío a través de la salida de aire en la parte inferior de la plantilla.
   Nota: El vacío máximo recomendado para la bomba de vacío es de 0,1 Mpa. Ser conscientes de la fuerza del vacío utilizado. Si la presión negativa es demasiado fuerte, cortar un agujero en forma de Cruz en la película para bajar la presión.

4. colocar embriones de pez cebra en una placa de 96 pocillos

1. Usando una pipeta de transferencia plástica, coloque aproximadamente 150 embriones en la plantilla, como se muestra en la figura 2, paso 2.
2. Conecte la bomba de vacío a la salida de aire para generar presión negativa en la cámara de sellado de la película en el paso 3.3.
3. Agite horizontalmente toda la plantilla hasta que cada uno tiene bien atrapado de un embrión (figura 2, paso 3).
   Nota: Si solución de Holtfreter se agota antes de que los embriones se encuentran atrapados en cada pocillo, añadir solución de Holtfreter adicional en la cámara de captura y repita este paso.
4. Deseche la solución extra Holtfreter y embriones que no son atrapados en los pozos (figura 2, paso 4).
5. Apague y desconecte la bomba de vacío.
6. Coloque una placa estándar de 96 pocillos boca abajo contra la plantilla (figura 2, paso 5) y gire a ambos al mismo tiempo (figura 2, paso 6).
7. Toque en la parte inferior de la plantilla o conectar el aire toma a una cantidad de gas comprimido puede para transferir embriones todos atrapados de la plantilla a la placa de 96 pocillos (figura 2, paso 6).
8. Repita los pasos 4.1 a 4.8 para preparar placas de múltiples pozos adicionales.
9. Quitar la película y lavar la plantilla 3 veces de arriba a abajo con 500 mL de agua desionizada para uso futuro.
   Nota: No utilice solventes orgánicos como etanol, para limpiar la plantilla.

Resultados

La figura 3 muestra una plantilla típica de arraying impreso en 3D. Esta plantilla utiliza resina fotosensible como materia prima y fue hecha por una impresora 3D; se aplicó una capa de pintura negra para proporcionar un mejor contraste con el color de los embriones. La posición de 96 pocillos (12 por 8) fue diseñada para encajar con una placa estándar de 96 pocillos. Del mismo modo, una plantilla bien de 384 (24 por 16) también podría ser diseñado y ...

Discusión

Hay dos pasos críticos en este protocolo que requieren especial atención para una exitosa implementación de plantilla 3D impresa para colocar los embriones de pez cebra.

El factor más importante en el diseño de la plantilla arraying es la captura. A hace que hay solamente un embrión en cada pocillo, uno debe prestar mucha atención al diámetro y la profundidad del pozo de atrapamiento y el diámetro del agujero a través. El diámetro recomendado es de 1.5 a 2 veces del diámetro de un ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zebrafish Facility	Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd.	Z-A-S5
Mating box	Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd.
Wash Bottle, 500 ml	Sangon Biotech	F505001-0001
Sodium chloride	Vetec	V900058-500G
Potassium Chloride	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10016318
Calcium chloride	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	20011160
Sodium bicarbonate	Vetec	v900182-500G
Methylene Blue Hydrate	TCI	M0501
Hydrochloric acid	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10011008
Sea Salts	Instant Ocean	SS15-10
Pipetter	Fisherbrand	13-675M
Controlled Drop Pasteur Pipet	Fisherbrand	13-678-30
Microscope	OLYMPUS	SZ61
Biochemical incubator	Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd.	LRH-250
3D printer	UnionTech	Lite600
Photosensitive resin	UnionTech	UTR9000
Vacuum pump	Shanghai Yukang Scientific Instrument Co., Ltd.	SHB-IIIA
Adhesive PCR Plate Seals	Solarbio	YA0245
96 well plate	Costar	3599
Multi 8-channel pipette 30 - 300 μl	Eppendorf	3122000.051
Compressed Gas Duster	Shanghai Zhantu Chemical Co., Ltd.	ST1005
DI Water	Thermo	GenPure Pro UV/UF
Drying oven	Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd.	BPG-9106A
System water			Water out of the facility’s water system
Egg water			Dilute 60mg “Instant Ocean” sea salts and 0.25 mg/L methylene blue in 1 L DI water
Holtfreter’s solution			Dissolve 7.0 g Sodium chloride (NaCl), 0.4 g Sodium bicarbonate (NaHCO3), 0.1 g Potassium Chloride (KCl), 0.235 g Calcium chloride (CaCl2.2H2O) in 1.9 L DI water. Adjust pH to 7 using HCl and adjust volume to 2 L using Di water