Трехмерный (3D)-напечатан шаблон для высокой пропускной способности Zebrafish эмбриона одевающ

Резюме

Здесь мы представляем протокол для проектирования и изготовления zebrafish эмбриона, одевающ шаблон, следуют подробные процедуры на использование такой шаблон для высокой пропускной способности zebrafish эмбриона одевающ в 96-луночных плиту.

Аннотация

Данио рерио является глобально признанных пресной воды организм часто используются в биологии развития, экологической токсикологии и болезней человека соответствующих исследований. Благодаря его уникальными особенностями, включая большие плодовитость, прозрачность эмбрионов, быстрое и одновременное развитие, и т.д.данио рерио эмбрионы часто используются для больших масштабах оценки токсичности химических веществ и наркотиков/соединение скрининга. Типичная скрининг процедура включает нереста взрослых рыбок данио, отбор эмбрионов и одевающ эмбрионов в несколько хорошо пластины. От там эмбрионы подвергаются воздействия и токсичности химических, или эффективность препаратов/соединений может оцениваться относительно быстро основаны на фенотипическую наблюдений. Среди этих процессов одевающ эмбрионов является одним из самых длительных и трудоемких шагов, которые ограничивает уровень пропускной способности. В этом протоколе мы представляем новаторский подход, который делает использование шаблона выстраивающихся 3D-печать Наряду с вакуумной манипуляции, чтобы ускорить этот трудоемкий этап. Протокол в настоящем документе описывается общий дизайн выстраивающихся шаблон, подробный экспериментальной установки и шаг за шагом процедуры, после чего представитель результаты. При реализации, этот подход должен оказаться полезным в различных исследовательских приложений с помощью zebrafish эмбриона как тестирование субъектов.

Введение

Как организм популярная модель данио рерио широко используется в области медицины и токсикологии^1,2,3,4. По сравнению с платформами в пробирке , данио рерио предлагают гораздо большей биологической сложности, что один или два типа клеток не может предложить. Помимо того, что весь организм, модель, данио рерио большая плодовитость, быстрых и одновременных эмбрионального развития и высокий орган полупрозрачность дали уникальные преимущества этой модели использоваться для больших масштабах токсичности или наркотиков/соединение скрининг⁵. Сотни зародышей одна пара взрослых рыбок данио каждую неделю превосходят любой другой весь Животные модели и сделали это подходит для высокой пропускной способности скрининга.

Типичная скрининг процедура, с помощью данио рерио включает в себя значительное количество ручной работы, такие как взрослых рыбок данио нереста, отбор эмбрионов и одевающ эмбрионов в соответствующих емкостях, где они подвергаются воздействию путем погружения в воду. Мониторинг развития эмбрионов и наблюдаемых конечные точки как смертность, выводимости и аномалий часто оцениваются вручную и используется в качестве предварительных опознавательные токсичность химических веществ или признаки эффективности наркотиков или соединений. Чтобы ускорить процедуру проверки, были изучены ранее подходов, таких как автоматическое создание образов и анализа компьютерных изображений. К примеру Микроскопы с высоким содержанием изображений возможности были адаптированы для выполнения автоматизированных ярко поле или флуоресценции изображений на zebrafish эмбриона на различных этапах своего развития от 96/384 хорошо пластины⁶. Microfluidic приборы, в сочетании с Микроскопы были использованы для позиции данио рерио личинок через текущую манипуляцию нейронов мозга⁷для воображения. Эти подходы могли бы значительно повысить эффективность поглощения изображения по сравнению с традиционной ручной работы. Кроме того с большим количеством изображений создаются, инструменты анализа изображений также были разработаны для ускорения обработки данных, как это продемонстрировано Лю et al. и ту et al. ^{8 , 9}.

Как уровень пропускной способности анализа изображений и изображения увеличивается, стало ясно, что тариф ограничивая шаг для отбора лежит в процессе подготовки zebrafish эмбриона для экспозиции, который обычно означает, одевающ их в 96 - или 384-ну пластины. Чтобы решить это узкое место, видение руководствуясь робототехника были разработаны Мандрелл et al. ¹⁰ и нас¹¹ ранее, чтобы заменить ручной обработки, но инструменты были довольно сложные и есть глубокий кривой обучения для осуществления таких методов. Таким образом чтобы обеспечить легкий к употребление подход становится одним из важных факторов для дальнейшего улучшения уровень пропускной способности данио рерио скрининга и является главной целью этой работы.

В этой работе мы разработаны и изготовлены эмбриона, одевающ шаблон 3D печати. Такой шаблон выстраивающихся был разработан чтобы завлечь zebrafish эмбриона в скважины, которые подходят с стандартных 96-луночных пластины. Вместо выбора эмбрионов и одевающ их в отдельные хорошо один за другим, один может выполнить эмбриона изобличения и массив все 96 эмбрионов в многослойные пластины одновременно. Используя этот шаблон и следующий протокол, одно может значительно повысить эффективность одевающ эмбрионов в многослойные пластины, которые бы в срок увеличить потенциал скрининга по крайней мере в десять раз, по сравнению с ручной работы. Протокол, в описанный ниже включает в себя общий дизайн для одевающ шаблон, данио рерио нереста, коллекции эмбриона и одевающ. Рисунок 1 показывает общий дизайн выстраивающихся шаблона. Рисунок 2 показывает обзор протокола пошаговую инструкцию по использованию шаблона, описанные в частях 3 и 4.

протокол

1. Проектирование и изготовление Zebrafish эмбриона одевающ шаблон

1. Дизайн выстраивающихся шаблон с 12 на 8, 96-луночных макет, который подходит для стандартных 96-луночных пластины. Использование измерения, перечисленных на рисунке 1A для камеры захвата верхней эмбриона (см. также дополнительный файл).
   1. Используйте измерения, показано на рисунке 1B и 1 D для захвата хорошо.
   2. Использование измерения в Рисунок 1 c для нижней вакуумной камеры.
   3. Использовать измерения, на рисунке 1B для воздуха в / выход.
2. Использовать 3D-принтер (с точностью до 0,1 мм) для печати шаблона; Смотрите Таблицу материалов для рекомендованных смолы использоваться для печати.
   Примечание: 3D принтеры с точностью 0,1 мм, рекомендуется для изготовления выстраивающихся шаблона (см. Таблицу материалы). Предлагаемые цвета для поверхности шаблона — темно-серый или черный.

2. Zebrafish эмбриона нереста

1. Место две пары мужчин и женщин рыбы в спаривания поле за один день до нереста. Отдельные мужчины и женщины, ясно пластиковый делитель.
2. Взлет разделители утром смесь рыбы мужского и женского пола.
3. Удаление рыбы мужского и женского пола и собирать zebrafish эмбриона с помощью мелкоячеистое сито. Мыть эмбрионов с яйцо 250 мл воды (см. Таблицу материалы).
4. Передавать собранные эмбрионов Петри (90 мм в диаметре) с Holtfreter на решение (см. Таблицу материалы) и удаление мертвых и неоплодотворенных эмбрионов, с помощью стереомикроскопом.
5. Место эмбрионы в инкубаторе 28,5 ° C. В 4 ч оплодотворение (hpf), наблюдать эмбрионы и удалите любые мертвых и нездоровой эмбрионов. Эмбрионы теперь готовы к следующему шагу.

3. Подготовка одевающ шаблон

1. Вымойте шаблон 2 – 3 раза с 500 мл деионизированной водой и положить его в сушильной печи (45 ° C) 5 мин.
2. Лента в нижней камере с куском уплотняющей пленки (Рисунок 2Шаг 1).
3. Подключение вакуумного насоса через выход воздуха в нижней части шаблона.
   Примечание: Рекомендуемая макс вакуум для вакуумного насоса является 0,1 МПа. Следует помнить о силе вакуума используется. Если отрицательное давление будет слишком сильным, вырежьте крестообразное отверстие на уплотнение фильм для снижения давления.

4. одевающ Zebrafish эмбриона в плиту 96-луночных

1. Использование пипетки пластиковые передачи, место приблизительно 150 эмбрионов в шаблон, как показано в рисунке 2, шаг 2.
2. Подсоедините вакуумный насос для выпуска воздуха и используется для создания отрицательного давления в камере, герметичные уплотнения фильм на шаге 3.3.
3. Встряхните весь шаблон по горизонтали до тех пор, пока каждый хорошо имеет одного эмбриона захваченного (рис. 2, шаг 3).
   Примечание: Если Holtfreter раствор высыхает, прежде чем эмбрионы оказались в ловушке в каждой скважине, добавить дополнительные Holtfreter решение в камере изобличения и повторите этот шаг.
4. Отменить решение дополнительных Holtfreter и эмбрионов, которые не попадают в скважинах (рис. 2, шаг 4).
5. Выключите и отсоедините вакуумного насоса.
6. Переверните стандартных 96-луночных пластины против шаблон (рис. 2, шаг 5) и поверните оба в то же время (рис. 2, шаг 6).
7. Нажмите в нижней части шаблона или подключить воздух розетки для сжатого газа пыли может передать всех захваченных эмбрионов из шаблона 96-луночных пластины (рис. 2, шаг 6).
8. Повторите шаг 4.1 до 4,8 подготовить дополнительные несколькими хорошо пластины.
9. Снимите уплотнение пленку и вымыть шаблон 3 раза сверху вниз с 500 мл деионизированной воды для использования в будущем.
   Примечание: Не используйте любые органические растворители, как этанол, чтобы очистить шаблон.

Результаты

Рисунок 3 показывает типичный шаблон выстраивающихся 3D-печати. Этот шаблон использует фоточувствительный смолы в качестве сырья и был сделан на 3D принтере; слой черной краской был применен для обеспечения лучшей контрастности цвета эмбрионов. Положен...

Обсуждение

Есть два критических шагов в настоящем Протоколе, которые требуют пристального внимания для успешной реализации 3D-печати шаблон для одевающ zebrafish эмбриона.

Наиболее важным фактором в разработке выстраивающихся шаблон является хорошо захвата. Делает уверен Есть только ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zebrafish Facility	Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd.	Z-A-S5
Mating box	Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd.
Wash Bottle, 500 ml	Sangon Biotech	F505001-0001
Sodium chloride	Vetec	V900058-500G
Potassium Chloride	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10016318
Calcium chloride	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	20011160
Sodium bicarbonate	Vetec	v900182-500G
Methylene Blue Hydrate	TCI	M0501
Hydrochloric acid	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10011008
Sea Salts	Instant Ocean	SS15-10
Pipetter	Fisherbrand	13-675M
Controlled Drop Pasteur Pipet	Fisherbrand	13-678-30
Microscope	OLYMPUS	SZ61
Biochemical incubator	Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd.	LRH-250
3D printer	UnionTech	Lite600
Photosensitive resin	UnionTech	UTR9000
Vacuum pump	Shanghai Yukang Scientific Instrument Co., Ltd.	SHB-IIIA
Adhesive PCR Plate Seals	Solarbio	YA0245
96 well plate	Costar	3599
Multi 8-channel pipette 30 - 300 μl	Eppendorf	3122000.051
Compressed Gas Duster	Shanghai Zhantu Chemical Co., Ltd.	ST1005
DI Water	Thermo	GenPure Pro UV/UF
Drying oven	Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd.	BPG-9106A
System water			Water out of the facility’s water system
Egg water			Dilute 60mg “Instant Ocean” sea salts and 0.25 mg/L methylene blue in 1 L DI water
Holtfreter’s solution			Dissolve 7.0 g Sodium chloride (NaCl), 0.4 g Sodium bicarbonate (NaHCO3), 0.1 g Potassium Chloride (KCl), 0.235 g Calcium chloride (CaCl2.2H2O) in 1.9 L DI water. Adjust pH to 7 using HCl and adjust volume to 2 L using Di water