JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, tasarım ve yüksek işlem hacmi zebra balığı embriyo bir 96-şey plaka diziliyor için böyle şablon kullanımı ayrıntılı yordam tarafından ardından arraying bir zebra balığı embriyo imal için bir protokol mevcut.

Özet

Zebra balığı genel olarak tanınan tatlı su organizma gelişim biyolojisi, Çevresel Toksikoloji ve insan hastalığı sık kullanılan ilgili araştırma alanları var. Sayesinde benzersiz özellikleri büyük verimlilik, vb, embriyo kalınlığı, hızlı ve eş zamanlı geliştirme de dahil olmak üzere, zebra balığı embriyolar genellikle büyük ölçekli toksisite değerlendirilmesi kimyasal maddeler için kullanılır ve uyuşturucu/tarama bileşik. Tipik prosedürü yetişkin zebra balığı yumurtlama, embriyo seçimi ve embriyoların çok iyi kalıplara diziliyor içerir. Oradan, embriyo pozlama ve kimyasal toksisitesi tabi olan veya uyuşturucu/bileşikler etkinliği nispeten hızlı bir şekilde bağlı fenotipik gözlemler olarak değerlendirilebilir. Bu işlemler arasında diziliyor embriyo üretilen iş düzeyi sınırlar en zaman alıcı ve emek yoğun adımlardan biridir. Bu protokol için 3D baskılı arraying şablon kullanımı ile birleştiğinde yapar işleme kadar zahmetli Bu adım hızlandırmak için vakum yenilikçi bir yaklaşım sunuyoruz. İletişim kuralı burada genel tasarımı arraying şablon, detaylı deneysel kurulum ve temsilcisi sonuçlarına göre takip adım adım yordamı açıklar. Uygulandığında, bu yaklaşım zebra balığı embriyo konular test olarak kullanarak araştırma uygulamaları çeşitli yararlı ispatlamak zorundadır.

Giriş

Popüler bir model organizma olarak, zebra balığı1,2,3,4tıp ve toksikoloji alanlarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Vitro platformları için karşılaştırıldığında, zebra balığı teklif daha fazla biyolojik karmaşıklığı bir ya da iki hücre tipleri değil sunabilir. Bütün bir organizma modeli, zebra balığı'nın büyük verimlilik, hızlı ve eşzamanlı embriyonik gelişim ve yüksek organ olmasının yanı sıra transparans büyük ölçekli toksisite veya uyuşturucu/bileşik5eleme için kullanılmak üzere bu modeli benzersiz avantajlar verdik. Her hafta yetişkin zebra balığı bir çift tarafından üretilen embriyolar yüzlerce diğer tüm hayvan modeller aşmak ve yüksek işlem hacmi tarama için uygun yaptık.

Zebra balığı kullanarak tipik prosedürü, embriyo seçimi, yumurtlama ve nereye onlar su daldırma yoluyla pozlama tabi uygun kaplar içine embriyo diziliyor yetişkin zebra balığı gibi manuel çalışma önemli miktarda içerir. Embriyo gelişimi izlenir ve ölüm, çıkım gücü ve anormallik gibi gözlemlenebilir bitiş noktaları kez el ile değerlendirilir ve kimyasal toksisitesi veya etkinliğinin belirtileri tanımlamaları ön kullanılan uyuşturucu ya da bileşikler. Kadar prosedürü hızlandırmak için otomatik görüntüleme ve bilgisayar destekli görüntü analizi gibi yaklaşımlar daha önce araştırılmalıdır. Örneğin, mikroskoplar yüksek içerik görüntüleme yetenekleri ile otomatik parlak alan veya floresan görüntüleme 96/384 iyi tabak6çeşitli gelişim aşamalarında, zebra balığı embriyo üzerinde gerçekleştirmek için adapte edilmiştir. Mikroskoplar ile birleştiğinde mikrosıvısal aygıtları zebra balığı larva beyin sinir hücreleri7görüntüleme için geçerli manipülasyonu yoluyla konumlandırmak için kullanılmıştır. Bu yaklaşımları önemli ölçüde görüntü satın almalar için geleneksel el ile işlem karşılaştırıldığında verimliliğini artırabilirsiniz. Ayrıca, çok sayıda ile oluşturulan resim, görüntü analiz araçları da veri işleme kadar hızlandırmak için Liu ve ark. ve Tu vd tarafından gösterildiği gibi geliştirilmiştir 8 , 9.

Görüntüleme ve görüntü analizi üretilen iş düzeyi arttıkça, tarama hızı sınırlaması adım genellikle onları 96 - veya 384-da kalıplara diziliyor anlamına gelir pozlama, zebra balığı embriyo hazırlama sürecinde yatıyor netleşti. Bu performans sorunu adım çözmek için robotik vizyon güdümlü geliştirilmiş olup, tüm tarafından Mandrell vd. 10 ve bizden daha önce el ile işleme ama aletleri yerine11 oldukça sofistike ve bu tür teknikler uygulamak için derin bir öğrenme eğrisi olduğunu. Bu nedenle, bir kolay kullanımlı yaklaşım zebra balığı tarama üretilen iş düzeyini daha da geliştirmek için önemli bir faktör haline gelir ve bu çalışmanın temel amacı sağlamak için.

Bu çalışmada, tasarlanmış ve şablon tarafından 3D baskı arraying bir embriyo fabrikasyon. Arraying bir şablon ile standart bir 96-şey plaka uygun kuyu içine zebra balığı embriyo tuzağa düşürmeye tasarlanmıştır. Embriyo seçerek ve onları tek tek bireysel kuyuya diziliyor yerine, bir embriyo tuzak ve dizi tüm 96 embriyo multiwall bir tabak hemen gerçekleştirebilir. Bu şablonu ve aşağıdaki iletişim kuralı kullanarak, bir önemli ölçüde tarama kapasitesi en az on kat, el ile çalışmasına göre dönem alttan yukarıya ittirmek içinde istiyorsunuz multiwall tabak içine embriyo diziliyor verimliliğini artırmak olabilir. Aşağıda açıklanan protokol diziliyor şablon, zebra balığı yumurtlama, embriyo toplama ve diziliyor için genel bir tasarım içerir. Şekil 1 arraying şablonu genel tasarım gösterir. Şekil 2 parça 3 ve 4'de anlatıldığı şablonu kullanarak adım adım Protokolü özetini gösterir.

Protokol

1. tasarım ve üretim şablon diziliyor zebra balığı embriyolar

  1. Bir 12 tarafından 8 ile standart bir 96-şey plaka 96-şey düzen arraying şablonu tasarlayın. Boyutları listelenen Şekil 1A ' üst embriyo tuzak odası için kullanım (Ayrıca bkz: ek dosyası).
    1. Şekil 1B ve 1 D tuzak için de gösterilen boyutları kullanın.
    2. Boyutlar Şekil 1 c içinde alt vakum odası için kullanın.
    3. Şekil 1B adımında havada için boyutları kullanın / çıkış.
  2. 3D yazıcı (0,1 mm hassasiyetle) şablonu yazdırmak için kullanın; yazdırma işlemi için kullanılacak Malzemeler tablo önerilen reçine için bkz.
    Not: 0,1 mm hassasiyetle 3D yazıcılar arraying şablon imalatı için tavsiye edilir ( Tablo malzemelerigörmek). Önerilen şablon yüzeyi için koyu gri veya siyah renktir.

2. zebra balığı embriyo yumurtlama

  1. İki çift erkek ve dişi balık yumurtlama önce bir gün kutusu çiftleşme başına yerleştirin. Ayrı erkek ve kadın tarafından şeffaf plastik bir bölücü.
  2. Bölücüler sabah erkek ve dişi balık karıştırmak için götürür.
  3. Erkek ve dişi balık çıkartın ve ince gözenekli süzgeç kullanarak zebra balığı embriyo toplamak. (Bkz. Tablo reçetesi) 250 mL yumurta ile embriyo su yıkama.
  4. Petri yemekler (90 mm çapında) Holtfreter'ın çözüm ile toplanan embriyo transfer ( Tablo malzemelerigörmek) ve ölü ve döllenmemiş embriyo bir stereomicroscope kullanarak kaldırın.
  5. Embriyo 28.5 ° C kuluçka makinesine koyun. 4 h fertilizasyon (hpf) sonrası, embriyo gözlemlemek ve herhangi bir ölü ve sağlıksız embriyo kaldırın. Embriyo bir sonraki adım için hazırsınız.

3. hazırlık şablonu diziliyor

  1. Şablon 2-3 kez 500 mL deiyonize su ile yıkama ve kurutma fırın (45 ° C) 5 min için içine koy.
  2. Alt kamara film (Şekil 2Adım 1) sızdırmazlık bir parça ile teyp.
  3. Bir vakum pompası şablonun altındaki hava çıkışı üzerinden bağlayın.
    Not: 0.1 Mpa vakum pompası için önerilen maksimum vakum var. Kullanılan vakum gücünü unutmayın. Negatif basınç çok güçlü ise, bir haç şeklindeki basıncı düşürmek için mühürleme film üzerinde delik açın.

4. bir 96-şey plaka zebra balığı embriyo diziliyor

  1. Plastik transfer pipet kullanarak, yaklaşık 150 embriyo şablonu, Şekil 2' de, 2. adımda gösterildiği gibi yerleştirin.
  2. Vakum Pompası adım 3.3 mühürleme filmde tarafından mühürlü odası negatif basınç oluşturmak için hava çıkışına bağlayın.
  3. Her şey bir embriyo (Şekil 2, adım 3) entrapped kadar tüm şablon yatay sallamak.
    Not: Holtfreter'ın çözüm embriyoların her kuyuda sıkışıp kalırlar önce kurur, tuzak odasında ek Holtfreter'ın çözüm ekleyin ve bu adımı yineleyin.
  4. İlave Holtfreter'ın çözüm ve wells (Şekil 2, adım 4) entrapped değil embriyo atmak.
  5. Devre dışı bırakmak ve vakum pompası bağlantısını kesin.
  6. Standart bir 96-şey plaka baş aşağı şablonu (Şekil 2, adım 5) karşı yerleştirin ve her ikisini de aynı anda (Şekil 2, adım 6) döndürün.
  7. Şablon alt dokunun veya hava bağlanmak bir sıkıştırılmış gaz toz prizine olabilir tüm kapana kısılmış embriyo şablondan 96-şey plaka (Şekil 2, adım 6) aktarmak için.
  8. 4.1-4,8 ek çok iyi tabak hazırlamak için adımları yineleyin.
  9. Mühürleme film kaldırın ve üstten 3 kez şablonu yukarıdan aşağıya doğru ileride kullanmak üzere 500 mL deiyonize su ile yıkayın.
    Not: şablon temizlemek için etanol gibi herhangi bir organik solventler kullanmayın.

Sonuçlar

Şekil 3 tipik bir 3D baskılı arraying şablonunu gösterir. Bu şablon ışığa duyarlı reçine hammadde olarak kullanır ve bir 3D printerlere harcama maddeler tarafından yapıldı; siyah boya tabakası embriyo rengini daha iyi bir kontrast sağlamak için uygulandı. 96 wells (12 tarafından 8) konumunu ile standart bir 96-şey plaka uyacak şekilde tasarlanmıştır. Benzer şekilde, 384 (24 den 16) iyi şablon da tasarlanabilir ve aynı yöntemi kul...

Tartışmalar

Zebra balığı embriyo diziliyor 3D baskılı şablonu başarılı uygulanması için yakın ilgi gerektiren iki kritik adımlarda bu protokolü vardır.

Tasarımı arraying şablonu, en önemli faktör de tuzaktır. Yapar emin tek embriyo her kuyuda sıkışmış, bir tane çapı ve tuzak kuyunun derinliği ve ile delik çapi yakın dikkat etmelidir. Önerilen çapı içinde (koryon dahil) tipik bir embriyo çapının 1,5-2 katı olduğunu. İyi tuzak derinliği içinde 2 kez (koryon dahil) ...

Açıklamalar

Yazarlar bir patent açıklanan 3D baskılı şablonundaki doldurdu.

Teşekkürler

Bu eser "1000plan Gençlik" programı, başlangıç fonlar Kent Üniversitesi ve NSFC Grant # 21607115 ve 21777116 (LIN) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Zebrafish FacilityShanghai Haisheng Biotech Co., Ltd.Z-A-S5
Mating boxShanghai Haisheng Biotech Co., Ltd.
Wash Bottle, 500 mlSangon BiotechF505001-0001
Sodium chlorideVetecV900058-500G
Potassium ChlorideSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10016318
Calcium chlorideSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd20011160
Sodium bicarbonate Vetecv900182-500G
Methylene Blue HydrateTCIM0501
Hydrochloric acidSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10011008
Sea SaltsInstant OceanSS15-10
PipetterFisherbrand13-675M
Controlled Drop Pasteur PipetFisherbrand13-678-30
MicroscopeOLYMPUSSZ61
Biochemical incubatorShanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd.LRH-250
3D printerUnionTechLite600
Photosensitive resinUnionTechUTR9000
Vacuum pumpShanghai Yukang Scientific Instrument Co., Ltd.SHB-IIIA
Adhesive PCR Plate SealsSolarbioYA0245
96 well plateCostar3599
Multi 8-channel pipette 30 - 300 μlEppendorf3122000.051
Compressed Gas DusterShanghai Zhantu Chemical Co., Ltd.ST1005
DI WaterThermoGenPure Pro UV/UF
Drying ovenShanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd.BPG-9106A
System waterWater out of the facility’s water system
Egg waterDilute 60mg “Instant Ocean” sea salts and 0.25 mg/L methylene blue in 1 L DI water
Holtfreter’s solutionDissolve 7.0 g Sodium chloride (NaCl), 0.4 g Sodium bicarbonate (NaHCO3), 0.1 g Potassium Chloride (KCl), 0.235 g Calcium chloride (CaCl2.2H2O) in 1.9 L DI water. Adjust pH to 7 using HCl and adjust volume to 2 L using Di water

Referanslar

  1. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  2. Leslie, M. Zebrafish larvae could help to personalize cancer treatments. Science. 357 (6353), 745-745 (2017).
  3. Lin, S., et al. Understanding the Transformation, Speciation, and Hazard Potential of Copper Particles in a Model Septic Tank System Using Zebrafish to Monitor the Effluent. ACS Nano. 9 (2), 2038-2048 (2015).
  4. Lin, S., et al. Aspect ratio plays a role in the hazard potential of ceo2 nanoparticles in mouse lung and zebrafish gastrointestinal tract. ACS Nano. 8 (5), 4450-4464 (2014).
  5. Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment. Nature Communications. 4, (2013).
  6. Lin, S., et al. High content screening in zebrafish speeds up hazard ranking of transition metal oxide nanoparticles. ACS Nano. 5 (9), 7284-7295 (2011).
  7. Kuipers, J., Kalicharan, R. D., Wolters, A. H. G., van Ham, T. J., Giepmans, B. N. G. Large-scale Scanning Transmission electron microscopy (nanotomy) of healthy and injured zebrafish brain. Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).
  8. Liu, R., et al. Automated Phenotype Recognition for Zebrafish Embryo Based In vivo High Throughput Toxicity Screening of Engineered Nano-Materials. PLoS One. 7 (4), (2012).
  9. Tu, X., et al. Automatic Categorization and Scoring of Solid, Part-Solid and Non-Solid Pulmonary Nodules. in CT Images with Convolutional Neural Network. Scientific Reports. 7, 8533 (2017).
  10. Mandrell, D., et al. Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).
  11. Lin, S., Zhao, Y., Nel, A. E., Lin, S. Zebrafish: An in vivo model for nano EHS studies. Small. 9 (9-10), 1608-1618 (2013).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

evre Bilimlerisay 1363D baskzebra balembriyo diziliyory ksek i lem hacmimultiwell kaplamalartoksisite tarama

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır